張家祺,賈浠寧,周 群,宋 鑫,朱晨曦,李格格,張 斌,2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041;2.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是導(dǎo)致犢牛腹瀉的主要病原之一。BVDV不僅能感染牛,也能夠感染多種其他動物,包括豬、綿羊、山羊、鹿、牦牛和駱駝[1]。感染BVDV后患畜主要表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、咳嗽、生殖功能不全(如不孕、死胎、流產(chǎn))、免疫抑制、持續(xù)感染、黏膜疾病、白細(xì)胞減少和出血綜合征等[2]。疫苗免疫是預(yù)防BVDV的重要措施,目前國內(nèi)BVDV商品化滅活疫苗已發(fā)揮了重要的作用[3-4]。但接種上述疫苗的動物在血清學(xué)上無法區(qū)分感染與免疫,不利于對養(yǎng)牛業(yè)的病毒監(jiān)測。因此,加快對安全、高效新型基因工程疫苗的研發(fā),對更好的防控BVDV具有重要的意義。

目前,根據(jù)國內(nèi)外研究調(diào)查顯示BVDV分為三種基因型即BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3[5]。BVDV-1進(jìn)一步分為23個亞型(1a～1w),BVDV-2分為四個亞型(2a～2 d),BVDV-3分為巴西源、泰國源和意大利源[6-7]。近年來,BVDV病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明,BVDV-1已成為我國牛群中的主要流行基因型[6]。目前國內(nèi)已有針對BVDV-1a毒株來開發(fā)的商業(yè)滅活苗上市[3],相關(guān)新型基因工程疫苗也在陸續(xù)研發(fā)中,如任杰等[8]利用BVDVE0和E2基因串聯(lián)表達(dá)的重組腺病毒疫苗,Jia等[9]構(gòu)建了表達(dá)BVDV E2蛋白并可口服使用的重組乳酸菌疫苗,同時也有利用桿狀病毒構(gòu)建BVDV-1a、1b的VLPs研究[1,10-12],這些研究為BVDV新型基因工程疫苗的研制提供了參考。

E2蛋白為BVDV的表面囊膜糖蛋白,是決定BVDV抗原性的主要部位,病毒感染后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗E2蛋白的抗體,該抗體具有中和病毒的作用,因此,E2基因在BVDV亞單位疫苗和基因工程疫苗研發(fā)中常被作為重要的靶抗原[13-14]。病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是由一種或多種病毒蛋白構(gòu)建的非傳染性和無病毒基因組的病毒顆粒,VLPs在結(jié)構(gòu)上與真實(shí)病毒粒子相似,可誘導(dǎo)有效的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[15],因缺乏遺傳物質(zhì)而無傳染性使其具有良好的生物安全性。昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已廣泛用于VLPs的生產(chǎn),當(dāng)前已成為BVDV基因工程疫苗研發(fā)的一個重要工具[16-17]。研究表明重組蛋白疫苗需要佐劑來獲得強(qiáng)大的免疫反應(yīng)[18]。因此,佐劑或免疫增強(qiáng)劑是蛋白質(zhì)疫苗的重要組成部分。MF59是病毒類疫苗的新型商品化佐劑,當(dāng)其與流感病毒和新冠病毒等聯(lián)合使用時,可以明顯增強(qiáng)抗體滴度,且耐受性良好[19]。CpG序列是一條含有未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的微生物單鏈DNA片段,能夠通過Toll樣受體的識別刺激先天性免疫反應(yīng)[20],CpG-ODN是人工合成的CpG序列(synthetic oligodeoxynucleotide containing CpG motifs,簡稱CpG-ODN)目前,在臨床和疫苗應(yīng)用中作為免疫增強(qiáng)劑[21]。

該研究以本實(shí)驗(yàn)室分離毒株BVDV-1 SWU-Z6的E2蛋白作為靶抗原,構(gòu)建含有E2基因的重組桿狀病毒,并用該桿狀病毒在SF9細(xì)胞中大量制備BVDV-1 E2 VLPs,經(jīng)過蔗糖密度梯度離心純化后混合MF59佐劑和CpG-ODN免疫增強(qiáng)劑在BALB/c小鼠體內(nèi)評估其免疫原性,以及對同源毒株的免疫保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動物等

BVDV-1 SWU-Z6毒株[22],由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存;鼠抗BVDV-1 E2蛋白的多克隆血清由本實(shí)驗(yàn)室制備、保存;真核表達(dá)載體pFast Dual、SF9細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存;6周齡雌性BALB/c小鼠購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,所有動物試驗(yàn)均遵循四川省實(shí)驗(yàn)動物管理委員會《四川省實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理》指導(dǎo)原則,并經(jīng)西南民族大學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

感受態(tài)細(xì)胞DH5α、DH10和胎牛血清購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、NheⅠ、T4連接酶和pMD-19 T購自TaKaRa公司;DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒和去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;抗生素(卡那霉素、四環(huán)霉素、慶大霉素)、X-gal、IPTG購自Biofroxx公司;昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自武漢普諾塞生命科技有限公司;轉(zhuǎn)染試劑Cellfection?Ⅱ Reagent、蛋白Marker購自賽默飛世爾科技有限公司;羊抗鼠IgG抗體(IgG-FITC/HRP)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。CpG-ODN 1826由上海生工生物工程股份有限公司合成,序列如下:5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′;MF59佐劑由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 目的基因的獲取

選用BVDV-1 SWU-Z6株(GenBank No.MF693403.1)的E2基因序列為模板,參考文獻(xiàn)[10]方法對E2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,送上海生工生物工程股份有限公司針對SF9細(xì)胞優(yōu)化并合成E2基因。

1.4 表達(dá)E2基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

真核表達(dá)載體pFast Dual的PH啟動子采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ兩個酶切位點(diǎn),P10啟動子采用XhoⅠ和NheⅠ兩個酶切位點(diǎn),分別針對PH啟動子和P10啟動子設(shè)計引物如表1,從優(yōu)化合成后的質(zhì)粒中擴(kuò)增出目的基因片段。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,用OMEGA PCR產(chǎn)物純化試劑盒對DNA進(jìn)行純化回收。分別將純化后獲得的DNA(PH和P10)連接至pMD-19 T,16 ℃過夜。分別使用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和XhoⅠ、NheⅠ限制性內(nèi)切酶對E2-PH質(zhì)粒和E2-P10質(zhì)粒從pMD-19 T進(jìn)行酶切回收。

表1 PCR引物Table 1 The primers of PCR

將獲得的酶切回收產(chǎn)物利用T4連接酶分別連接至pFast Dual載體的PH和P10啟動子中。進(jìn)行針對pFast Dual載體PH和P10啟動子的雙酶切鑒定,并對重組質(zhì)粒中的E2基因進(jìn)行測序驗(yàn)證,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pFast Dual BVDV-1 E2。

1.5 重組桿粒的制備及重組桿狀病毒的拯救

按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)手冊(Invitrogen公司),將鑒定成功的pFast Dual BVDV-1 E2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,在三抗固體培養(yǎng)基(卡那霉素、四環(huán)霉素、慶大霉素、X-gal、IPTG)經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆,并進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定正確的重組桿狀病毒載體命名為Bacmid-BVDV-1 E2。

提取重組桿狀病毒載體Bacmid-BVDV-1 E2,利用Cellfection?Ⅱ Reagent轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞,27 ℃培養(yǎng)48～72 h,按MOI=3感染SF9細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)3代,將每代培養(yǎng)的上清放置-80 ℃保存。提取第三代培養(yǎng)上清的基因組DNA,用BVDV-1E2的全長引物(表1)進(jìn)行PCR鑒定,鑒定正確的重組桿狀病毒命名為Baculo-BVDV-1 E2。

1.6 重組蛋白的表達(dá)和鑒定

1.6.1 間接免疫熒光鑒定(IFA) 將長滿細(xì)胞培養(yǎng)皿的貼壁SF9細(xì)胞進(jìn)行傳代,用新鮮的含10%胎牛血清、1%雙抗的貼壁SF9細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105cells·mL-1,進(jìn)行6孔板鋪板,每孔2 mL。使細(xì)胞分布均勻,放入27 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)24 h。MOI=3感染SF9細(xì)胞,以不接種病毒的SF9細(xì)胞做陰性對照繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

棄去培養(yǎng)液,用80%丙酮室溫固定30 min,PBST清洗3次,加入5%脫脂奶粉溶液2 mL,37 ℃封閉1 h,PBST清洗3次加入鼠抗BVDV-1a E2蛋白血清作為一抗(1∶50),室溫孵育1 h,PBST再清洗3次,避光條件下以羊抗鼠IgG抗體(IgG-FITC)作為二抗(1∶3 000)室溫作用45 min,PBST清洗3次,然后于熒光顯微鏡下觀察目的蛋白的表達(dá)情況。

1.6.2 Western blot鑒定 取Baculo-BVDV-1 E2 P3代,以MOI=3感染SF9細(xì)胞,96 h后收集細(xì)胞懸液,反復(fù)凍融3次后超聲裂解,(4 ℃ 5 000 r·min-1離心30 min)去除細(xì)胞碎片;利用20%、30%和60%的蔗糖溶液進(jìn)行梯度離心純化,獲得BVDV-1 E2 VLPs。加入RIPA蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制劑),后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂乳封閉2 h;用PBST洗膜3次,以鼠抗BVDV-1 E2蛋白作為一抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,用PBST洗膜3次;以辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,洗膜3次后,在PVDF膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,放入免染成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光顯色。

1.6.3 TEM觀察 將“1.6.2”經(jīng)蔗糖梯度離心純化獲得BVDV-1 E2 VLPs稀釋后滴加在銅網(wǎng)上,室溫孵育,用濾紙輕輕吸去銅網(wǎng)上多余的液體,晾干后,再滴加1%磷鎢酸,室溫染色3 min。然后再用濾紙吸去銅網(wǎng)上的液體,室溫晾干進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.7 動物的免疫及攻毒試驗(yàn)

1.7.1 動物免疫 將20只6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組,每組5只。即A:BVDV-1 E2 VLPs 50 μg、B:BVDV-1 E2 VLPs 25 μg、C:天腹凈商品化滅活疫苗(1型 NM01株)和D:空白對照。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行免疫,免疫時A組和B組加入等體積免疫佐劑MF59與CpG-ODN 20 μg,免疫劑量為每只小鼠100 μL,免疫方式為腿部肌肉多點(diǎn)注射,在首次免疫后2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫,空白對照組注射等量PBS。每周固定時間通過眼眶靜脈采血分離血清用于測定特異性抗體水平。

1.7.2 特異性抗體檢測 利用本實(shí)驗(yàn)室建立并優(yōu)化的間接ELISA方法檢測免疫小鼠的特異性抗體水平,其優(yōu)化后的方法為將抗原BVDV-1 SWU-Z6終濃度調(diào)整為0.1×108.11TCID50包被在聚乙烯96孔板中4 ℃放置24 h,使用5% BSA 37 ℃封閉1 h;將被檢測的鼠血清按1∶10的梯度稀釋在該96孔板中并37 ℃孵育1.5 h;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶5 000稀釋并置于37 ℃孵育1.5 h;最佳顯色時間為37 ℃ 15 min;被檢測血清≥2.1倍空白血清OD450 nm處的吸光值則判定為陽性。

1.7.3 攻毒試驗(yàn) 二免4周后進(jìn)行攻毒,利用BVDV-1 SWU-Z6毒株,以1×108.11TCID50·只-1的劑量采用灌胃途徑對A、B、C、D組小鼠用進(jìn)行攻毒,攻毒完成后每天觀察小鼠的活動狀況和精神狀態(tài)并記錄。在攻毒后第5、7和10天收集小鼠糞便樣本并稱量小鼠體重,所得糞便提取RNA,根據(jù)文獻(xiàn)[23]合成定量引物,用熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)含量。

1.7.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 應(yīng)用軟件GraphPad Prism 8.0對免疫組與非免疫組的抗體效價采用one way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義(*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001),P>0.05意味著沒有顯著差異(n.s)。所有結(jié)果均代表至少三次重復(fù)試驗(yàn)。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pFast Dual BVDV-1 E2的構(gòu)建與鑒定

為了構(gòu)建質(zhì)粒pFast Dual BVDV-1 E2,以針對SF9細(xì)胞優(yōu)化合成的E2基因序列為模板使用表1引物擴(kuò)增得到帶有不同酶切位點(diǎn)的E2基因,大小為1 174 bp(圖 1A)。重組質(zhì)粒pFast Dual BVDV-1 E2經(jīng)EcoRⅠ、Hind Ⅲ和XhoⅠ、NheⅠ分別雙酶切后,得到的條帶大小與插入基因E2的大小相符(圖 1B)。通過對重組質(zhì)粒中的E2基因進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)與之前測得的序列完全一致,表明重組質(zhì)粒pFast Dual BVDV-1 E2構(gòu)建成功。

M.Marker DL5000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.BVDV-1 E2基因;2.pFast Dual BVDV-1 E2 EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ酶切鑒定;3.pFast Dual BVDV-1 E2 Xho Ⅰ、Nhe Ⅰ酶切鑒定M.Marker DL5000;1.PCR result of BVDV-1 E2 gene;2.pFast Dual BVDV-1 E2 digested by EcoR Ⅰ and Hind Ⅲ; 3.pFast Dual BVDV-1 E2 digested by Xho Ⅰ and Nhe Ⅰ圖1 BVDV-1 E2基因PCR擴(kuò)增(A)及pFast Dual BVDV-1 E2重組質(zhì)粒酶切鑒定(B)Fig.1 Amplification of BVDV-1 E2 gene of SWU-Z6 by PCR (A) and restriction endonuclease analysis of recombinant plasmids pFast Dual BVDV-1 E2 (B)

2.2 重組桿狀病毒的拯救

重組桿狀病毒Baculo-BVDV-1 E2以MOI=3感染SF9細(xì)胞,27 ℃培養(yǎng)72 h,SF9細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變大和變圓的現(xiàn)象。

圖2 Baculo-BVDV-1 E2第三代導(dǎo)致SF9細(xì)胞病變Fig.2 CPE in SF9 by the third generation of Baculo-BVDV-1 E2

2.3 BVDV-1 E2 VLPs的表達(dá)與鑒定

為了驗(yàn)證該桿狀病毒是否能正確表達(dá)E2蛋白,利用IFA、TEM和Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測及觀察。

IFA檢測結(jié)果表明,Baculo-BVDV-1 E2感染的SF9細(xì)胞可觀察到明顯的綠色熒光(圖 3A1),對照組細(xì)胞未觀察到熒光(圖 3B1)。

A. Baculo-BVDV 1 E2感染SF9細(xì)胞;B. 正常SF9細(xì)胞A. Sf9 cells infected with Baculo-BVDV 1a E2; B. Normal SF9 cells圖3 Baculo-BVDV-1 E2蛋白表達(dá)的間接免疫熒光鑒定Fig.3 Identification of the protein expression of the Baculo-BVDV 1a E2 by immunofluorescence assay

TEM電鏡結(jié)果顯示,BVDV-1 E2蛋白可自我組裝成圓形、橢圓形或不規(guī)則的VLPs,粒子直徑在80～100 nm之間(圖4A)。

A圖中:紅色箭頭指向BVDV-1 E2 VLPs,黑色箭頭指向桿狀病毒;B圖中:1. BVDV-1 E2 VLPs;2. SF9 空白細(xì)胞In Fig. A: Red arrows point to BVDV-1 E2 VLPs;black arrows point to baculovirus; In Fig. B: 1. BVDV-1 E2 VLPs;2. Normal SF9 cells圖4 BVDV-1 E2 VLPs的TEM觀察(A)及Baculo-BVDV-1 E2感染SF9細(xì)胞表達(dá)蛋白的免疫印跡分析鑒定(B)Fig.4 The TEM image of BVDV-1 E2 VLPs(A)and western blotting analysis of protein expression of cells infected Baculo-BVDV-1 E2(B)

Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)過蔗糖梯度離心純化獲得的BVDV-1 E2 VLPs在約60 ku處有目的條帶(圖4B),表明E2蛋白在真核細(xì)胞中能正確表達(dá),并具有良好的生物學(xué)活性。

2.4 ELISA檢測特異性抗體水平

為了檢測免疫后小鼠是否產(chǎn)生針對BVDV的特異性IgG抗體,如圖5A所示,在免疫后每周采血分離血清,并通過間接ELISA檢測免疫小鼠的特異性IgG抗體水平。結(jié)果如圖5B、C所示,BVDV-1 E2 VLPs在第一劑免疫接種后BVDV特異性IgG抗體水平逐漸升高,在二免后一周血清中特異性IgG抗體滴度達(dá)到峰值;其中BVDV-1 E2 VLPs 50 μg組抗體滴度最高為1∶100 000,抗體滴度明顯高于對照組(P<0.001),BVDV-1 E2 VLPs 25 μg組抗體滴度最高為1∶10 000。相較于BVDV商業(yè)滅活苗組,該VLPs能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的BVDV血清抗體。

A. 小鼠的免疫和攻毒流程圖;B. 小鼠特異性抗體水平變化;C. 小鼠特異性抗體效價變化A. Schematic diagram of immunization and challenge in mice; B. Antibody level changes of mice; C. Changes in mice antibody titers圖5 小鼠免疫及攻毒試驗(yàn)流程圖(A)及特異性抗體變化(B、C)Fig.5 Schematic diagram of immunization and challenge in mice(A)and antibody titers changes of mice(B,C)

2.5 攻毒保護(hù)的效果評價

為了評價該VLPs的攻毒保護(hù)效果,利用BVDV-1 SWU-Z6毒株,以1×108.11TCID50·只-1的劑量采用灌胃途徑感染小鼠。

空白攻毒組小鼠感染后體重總體呈現(xiàn)下降趨勢,平均下降百分比為16.324%;免疫BVDV-1 E2 VLPs 50 μg組小鼠與空白攻毒組比較,感染后第7天體重雖有一定程度的下降但總體呈上升趨勢,平均升高百分比為1.515%,體重顯著高于空白攻毒組;免疫BVDV-1 E2 VLPs 25 μg小鼠和免疫BVDV商業(yè)滅活苗小鼠體重總體呈下降趨勢,平均下降百分比分別為3.435%和2.539%(圖6)。

圖6 攻毒后小鼠體重變化情況Fig.6 Weight change of mice after challenge

熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù)含量的結(jié)果表明,免疫BVDV-1 E2 VLPs 50 μg小鼠和免疫BVDV商業(yè)滅活苗小鼠在第10天檢測不到BVDV,免疫BVDV-1 E2 VLPs 25 μg小鼠在攻毒后第10天只有一只小鼠BVDV病毒拷貝數(shù)為4.74 copies·mg-1,而空白攻毒組小鼠在感染后一直能檢測到BVDV。

體重和病毒載量結(jié)果說明,小鼠肌肉注射免疫BVDV-1 E2 VLPs 50 μg后,可以對BVDV-1 SWU-Z6毒株感染呈現(xiàn)明顯的保護(hù)效果(圖6和表2)。

表2 實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測攻毒后小鼠糞便中BVDV病毒載量Table 2 The BVDV virus load in mouse feces after challenge was detected by using real-time fluorescent quantitative

3 討 論

牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是牛的重要病原體之一,給全球養(yǎng)牛業(yè)造成了重大損失。流行病學(xué)表明,BVDV-1型已成為國內(nèi)牛群中的主要流行基因型[6],其中BVDV-la基因亞型是我國牛群中流行的主導(dǎo)亞型之一[24]。一般而言,為了有效控制傳染病,基本原則應(yīng)包括消除病原體宿主,預(yù)防或減少感染個體向易感動物的傳播[4]。然而,由于在全球范圍內(nèi)BVDV的根除仍處于起步階段,因此疫苗免疫成為BVDV防控的一個重要手段,加快對安全、高效新型基因工程疫苗的研發(fā),為更好地防控BVDV具有重要的意義。

VLPs由病毒結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成,與疫苗佐劑混合能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,具備產(chǎn)生長期免疫應(yīng)答的能力,其缺乏病毒遺傳物質(zhì)具有良好的生物安全性,近年來已成為疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]。VLPs疫苗的一系列優(yōu)勢,奠定了其在新型疫苗的研制方面具有巨大潛力和良好前景。昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為一種VLPs的生產(chǎn)平臺,已廣泛用于VLPs的生產(chǎn),并已開發(fā)數(shù)種許可疫苗,例如人乳頭瘤病毒疫苗、流感病毒疫苗和乙型肝炎病毒疫苗等[25]。E2蛋白是BVDV的主要保護(hù)性抗原,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體,已成為疫苗開發(fā)的重要抗原蛋白[12,14,26]。BVDV進(jìn)入宿主細(xì)胞由E2介導(dǎo)并結(jié)合細(xì)胞表面受體CD46,由于E2蛋白存在多個糖基化位點(diǎn),其分子質(zhì)量大小同樣存在一定差異[27]。有報道表明,蛋白糖基化在維持BVDV抗原蛋白免疫原性中具有重要作用,而昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有完整的翻譯后修飾功能,使E2蛋白糖基化并正確折疊成更接近真實(shí)病毒的VLPs[28]。

本研究選取BVDV-1a亞型流行株SWU-Z6抗原編碼基因E2,以期能夠較好地與田間流行病毒亞型匹配,構(gòu)建含有E2基因的重組桿狀病毒,并使用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了由E2蛋白自動組裝成的BVDV-1 E2 VLPs,經(jīng)IFA、Western blot驗(yàn)證和電鏡觀察證實(shí)E2蛋白得到正確表達(dá)并成功組裝VLPs。ELISA結(jié)果顯示在二免2周后,免疫BVDV-1 E2 VLPs 50 μg組小鼠針對BVDV-1 SWU-Z6的IgG抗體滴度達(dá)到1∶100 000,不同免疫劑量產(chǎn)生的抗體滴度雖存在差異,但明顯高于商業(yè)滅活疫苗對照組。攻毒保護(hù)試驗(yàn)中結(jié)果顯示,BVDV-1 E2 VLPs 50 μg劑量兩次免疫后,免疫組小鼠在攻毒后7 d表現(xiàn)出體重下降,而后開始回升;在攻毒后第10天采集糞便沒有檢測到病毒。這些結(jié)果表明該VLPs的免疫能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和病毒的特異性抗體,能有效阻止因病毒攻擊造成的小鼠體重下降以及病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制,對BVDV-1 SWU-Z6毒株的感染產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)能力。這一結(jié)果與BVDV干酪乳桿菌口服疫苗效果基本一致[29]。并且進(jìn)一步驗(yàn)證了通過灌胃途徑建立的小鼠感染模型,為BVDV疫苗效果評價提供參考依據(jù)。本研究所獲得的BVDV-1 E2 VLPs在攻毒保護(hù)效力上與商業(yè)滅活苗相比沒有明顯的差異,且不表達(dá)BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白,與現(xiàn)有NS3蛋白抗體檢測試劑盒兼容,在區(qū)分病毒的感染與免疫方面存在優(yōu)勢[30]。但利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)VLPs疫苗的成本較高,在后續(xù)研究中,為適應(yīng)BVDV VLPs疫苗的工藝化生產(chǎn),應(yīng)該對重組蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。

本研究中VLPs誘導(dǎo)的抗體效價優(yōu)于本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的亞單位疫苗[31],有研究表明單獨(dú)的抗原蛋白通常不能誘導(dǎo)最佳的免疫反應(yīng),需要用合適的佐劑或佐劑組合來配制使用。MF59是一種由角鯊烯、聚山梨酸酯80、山梨醇三油酸酯和檸檬酸三鈉組成的水包油佐劑,已被證明能顯著促進(jìn)針對配伍抗原的抗體產(chǎn)生以及Th2和Th1免疫反應(yīng)的增強(qiáng)[32]。此外,它還可以增強(qiáng)注射部位的抗原攝取,主要靶細(xì)胞類型可以是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[18]。CpG-ODN是一種有效的免疫增強(qiáng)劑,可以誘導(dǎo)Th1反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和干擾素的分泌,并通過激活TLR9上調(diào)抗原提呈細(xì)胞的功能,增強(qiáng)對抗原的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[32]。最初將MF59與CpG聯(lián)合使用是在流感領(lǐng)域,其誘導(dǎo)了高于單獨(dú)佐劑的抗體滴度和Th1應(yīng)答[33],Singh等[34]的一項(xiàng)研究中,MF59佐劑配伍CpG與重組腦膜炎球菌抗原免疫小鼠能明顯增強(qiáng)其抗體滴度。有研究表明將使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備的Erns和E2蛋白配伍MF59佐劑和CpG-ODN免疫增強(qiáng)劑能有效地提高小鼠對BVDV的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[35]。本研究中低劑量的E2蛋白就能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的IgG抗體可能與該蛋白配伍的MF59+CpG-ODN佐劑組合有關(guān),但該VLPs配伍MF59+CpG-ODN佐劑組合是否能提高機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答還需進(jìn)一步試驗(yàn)來論證。

該研究初步以BALB/c小鼠為模型,評價了BVDV-1 E2 VLPs與MF59+CpG-ODN佐劑組合有良好的免疫效果,其較低的蛋白含量就能誘導(dǎo)高水平抗體并能夠保護(hù)小鼠抵御同源病毒的攻擊,認(rèn)為該VLPs良好的體液免疫應(yīng)答可能與MF59+CpG-ODN佐劑組合有關(guān),同時細(xì)胞免疫應(yīng)答也至關(guān)重要。因此,在后續(xù)研究中會對該疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平開展系統(tǒng)的檢測,有關(guān)該VLPs是否能保護(hù)小鼠免受異源病毒的攻擊以及在牛體內(nèi)的免疫效力如何,還將有待進(jìn)一步的試驗(yàn)。

4 結(jié) 論

本研究以國內(nèi)近年來流行毒株BVDV-1 SWU-Z6為研究對象,成功制備了BVDV-1 E2 VLPs。將VLPs混合MF59佐劑與CpG-ODN免疫增強(qiáng)劑免疫小鼠,兩次免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng),能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對BVDV-1 SWU-Z6毒株的高水平抗體,可有效抵抗BVDV同源毒株的攻擊。本研究為BVDV商品化基因工程疫苗提供了新的開發(fā)思路。