范錦全,張宇航,唐午陽(yáng),趙欣宇,李丕順,鄭曉峰

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410125)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)是環(huán)狀單鏈DNA病毒,無(wú)囊膜,屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus),在禽類、犬類、企鵝、狐貍、熊類和豬中均能引起疾病。1998年Allan發(fā)現(xiàn)了一種全長(zhǎng)為1.76 kb的環(huán)狀病毒,其與PCV1結(jié)構(gòu)相似,但二者序列相似性小于80%,因此將其命名為PCV2[1]。直至今日,PCV2仍是一種全球傳播的頻發(fā)病原,感染的豬會(huì)出現(xiàn)多系統(tǒng)衰竭癥、腸炎、肺炎和生殖障礙等癥狀,這些癥狀統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus desease,PCVD)或豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated disease, PCVAD)[2]。PCV2是嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要疫病之一,盡管商品化的獸用疫苗已廣泛使用,有效降低了宿主感染后的亞臨床癥狀,減少了養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失;但更多證據(jù)表明,使用PCV2滅活疫苗免疫,臨床的抗原陽(yáng)性率仍然較高,對(duì)疫病防控仍是一種挑戰(zhàn)[3-4]。因此,新的PCV2防控手段的研發(fā)迫在眉睫?？共《舅幬锸强刂撇《拘约膊〉囊粋€(gè)重要研究方向,老藥新用因其安全性、有效性以及給藥方式較為明晰,不僅能夠降低成本、節(jié)約時(shí)間、還能提高研發(fā)的成功率[5]。地西他濱(decitabine,DAC),又名5-氮雜-2′-脫氧胞嘧啶核苷(5-aza-2′-deoxycytidine),2006年5月經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)用于骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes, MDS)治療,是一種具有口服活性的脫氧胞苷類似物和 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[6-7]。目前,已有研究表明DNA甲基化與先天免疫反應(yīng)密切相關(guān),地西他濱作為最有效的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,已證明對(duì)多種病毒具有抑制作用,包括人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)和馬皰疹病毒1型(equid herpesvirus-1, EHV-1)[8-13]。但DAC對(duì)PCV2是否具有抑制作用尚未可知,因此研究DAC對(duì)PCV2增殖的影響并確定其機(jī)制,能夠?yàn)镻CV2預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒

豬腎上皮細(xì)胞 PK-15 傳代細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室凍存;PCV2病毒毒株(GenBank 登錄號(hào):KJ867555)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院楊毅教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器

地西他濱購(gòu)自美國(guó)GLPBIO有限公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自APExBIO有限公司;PCV2 Cap蛋白抗體和Rep蛋白抗體均購(gòu)自GeneTex有限公司;5-methylcytosine(5 mC)單克隆抗體購(gòu)自Epigentek有限公司;RNA提取試劑盒Gene JET RNA Purification Kit,DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰酶和熒光二抗抗體[Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLightTM488]均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司;DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR酶均購(gòu)自北京全式金生物有限公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司;RIPA裂解液、DAPI、Triton X-100購(gòu)自索萊寶科技有限公司。熒光PCR儀(Roche,light cycler 480);酶標(biāo)儀(Tecan,Infinite E plex);化學(xué)發(fā)光成像儀(GE,Amersham Imager 600);熒光顯微鏡(Leica,DMi8)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染

將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行傳代或接種PCV2(MOI=1),根據(jù)試驗(yàn)需求,在感染24、48或72 h后收樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞毒性

將100 μL PK-15 細(xì)胞懸液以 1.3×104·孔-1接種到96孔板中,培養(yǎng)16 h后加入不同溶度的地西他濱,以DMSO組作為對(duì)照,孵育48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度,再根據(jù)試劑盒說(shuō)明書中的公式計(jì)算細(xì)胞活力。

1.5 RNA提取及熒光定量PCR

使用Gene JET RNA Purification Kit提取總RNA,再根據(jù)Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,以此作為模板進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH作為內(nèi)參基因,對(duì)目的基因進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)NCBI設(shè)計(jì)定量引物(表 1),由湖南擎科生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系:qPCR Mix 5 μL,上下游引物各0.4 μL,ddH2O 4.1 μL,cDNA 0.1 μL。PCR程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃10 s,60 ℃35 s,40個(gè)循環(huán)。通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。

1.6 間接免疫熒光試驗(yàn)

待檢細(xì)胞棄去培養(yǎng)上清液,用PBS洗滌3次。加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定10 min,而后棄去固定液,PBS清洗,加入1% Triton-X 100的PBS進(jìn)行通透,15 min后吸盡,棄上清后PBS清洗。加入5% BSA,于37 ℃封閉1 h。棄掉封閉液,加入PCV2病毒蛋白R(shí)ep的多克隆抗體(1∶500稀釋)或5 mC的多克隆抗體(1∶1 000),37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次,加入熒光二抗(1∶1 000),37 ℃孵育1 h。PBS洗滌后,DAPI(1∶1 000)孵育5 min,PBS洗滌3次,封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot

棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS 洗滌后加入預(yù)冷的 RIPA 裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉 2 h,PCV2 Cap 蛋白抗體(1∶1 000)、PCV2 Rep蛋白抗體(1∶1 000)β-Actin 抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜,HRP 標(biāo)記二抗(1∶5 000)室溫孵育 1 h,化學(xué)發(fā)光顯色后,在超靈敏多功能成像儀(GE Amersham Imager 600)中曝光成像。

1.8 TCID50試驗(yàn)

PCV2病毒液從10-1～10-7作10倍倍比稀釋。每孔100 μL體系,10%的病毒液與90%的細(xì)胞懸液,每孔重復(fù)8次,正常細(xì)胞作為對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)96 h。而后經(jīng)免疫染色,對(duì)感染情況進(jìn)行觀察,通過(guò)Spearman-Karber法計(jì)算TCID50[14-15]。

1.9 RNA干擾

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索豬DNMT1 mRNA序列(NM_001032355.1),根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)并合成shRNA序列,shRNA序列為5′-CCGGGTCTCTTGAAGGTGGTGTTAACTCGA-GTTAACACCACCTTCAAGAGACTTTTTG-3′,陰性對(duì)照序列為5′-AAGTTCATCTCGAGATGA-ACTTCAGGGTCAGCTTGCTTTTTG-3′,序列由北京擎科生物科技有限公司合成,采用化學(xué)合成方法合成單鏈寡核苷酸,退火后得到雙鏈DNA,將雙鏈DNA片段與經(jīng)EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切的pLKO.1進(jìn)行連接制備pDNMT1-shRNA重組載體。通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑Lipo Fiter介導(dǎo)慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G和目的質(zhì)粒pDNMT1-shRNA、pLKO.1-shGFP共轉(zhuǎn)染至293 T細(xì)胞中,48 h后收集含有慢病毒顆粒的上清液,經(jīng)0.45 μm過(guò)濾后獲得慢病毒純化液。試驗(yàn)分為三組:試驗(yàn)組(pDNMT1-shRNA)為感染含有pDNMT1-shRNA的慢病毒,陰性對(duì)照組(pLKO.1-shGFP)為感染含有pLKO.1-shGFP的慢病毒,空白對(duì)照組(Mock)不感染慢病毒。將2 mL慢病毒液以及2 μL polybrene(終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1)加入已接種PK-15細(xì)胞的6孔板中,每孔細(xì)胞匯合度為60%。慢病毒感染12 h后換成含10%胎牛血清的新鮮完全培養(yǎng)基,感染24 h后加入4 μL嘌呤霉素(終質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1)進(jìn)行篩選。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞感染模型的鑒定

為了探究地西他濱對(duì)PCV2的抑制作用,實(shí)驗(yàn)室需要對(duì)病毒進(jìn)行分離培養(yǎng),并建立細(xì)胞感染模型。在此,作者使用特異性引物通過(guò) PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證了 PCV2的特異條帶(圖 1A)。通過(guò)Western blot和免疫熒光進(jìn)一步檢測(cè)PCV2在PK-15細(xì)胞中的感染效率(圖1B、C),證明使用的PCV2毒株能正常感染PK-15細(xì)胞系。

A. PCR驗(yàn)證PCV2的特異性擴(kuò)增條帶;B. Western blot檢測(cè)PCV2的感染;C. 免疫熒光檢測(cè)PCV2的感染效率A. PCR identification results of PCV2; B. Detection of PCV2 viral protein by Western blot; C. Immunofluorescence results of PCV2 infected PK-15 cell圖1 PCV2細(xì)胞感染模型的建立Fig.1 Establishment of PCV2 infected PK-15 cell model

2.2 地西他濱具有抗PCV2活性

DAC的結(jié)構(gòu)式如圖2A所示,分子大小為228.08。用不同濃度DAC溶液處理PK-15細(xì)胞,通過(guò)CCK8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒性,結(jié)果顯示:當(dāng)DAC濃度>20 μmol·L-1時(shí)才對(duì)細(xì)胞具有顯著的毒性,(圖2B)。選取10 μmol·L-1的DAC處理PK-15細(xì)胞2 h后接種PCV2(MOI=1),再于37 ℃含DAC的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)48 h。給藥組TCID50的結(jié)果顯示DAC可以抑制PCV2的增殖(圖2C)。通過(guò)間接免疫熒光法檢測(cè)PCV2的感染效率,結(jié)果如圖2 D顯示,DAC處理組中PCV2的Rep蛋白熒光信號(hào)顯著降低。

A.地西他濱的結(jié)構(gòu)式;B. 地西他濱的細(xì)胞毒性;C. TCID50檢測(cè)地西他濱的抗PCV2活性;D.免疫熒光檢測(cè)地西他濱的抗PCV2活性。**.P<0.01A. Chemical formula of DAC; B. Cytotoxicity of DAC; C. Anti-PCV2 activity of DAC detected by TCID50; D. Anti-PCV2 activity of DAC detected by immunofluorescence.**.P<0.01圖2 DAC的抗PCV2活性Fig.2 Anti-PCV2 activity of DAC

檢測(cè)DAC在PCV2增殖的不同時(shí)間的作用,分別在病毒接種后的24、48、72 h進(jìn)行Western blot和qPCR,比較DAC處理組和未處理組細(xì)胞內(nèi)的Cap蛋白的表達(dá)量和病毒的拷貝數(shù)。結(jié)果如圖3所示,與對(duì)照組相比,同一時(shí)間點(diǎn)的DAC給藥組中PCV2的Cap蛋白表達(dá)量(圖3A)與PCV2的拷貝數(shù)(圖3B)顯著降低。結(jié)果表明DAC在PCV2增殖的不同時(shí)期均具有抑制病毒增殖的作用。

A. Western blot檢測(cè)Cap蛋白含量;B. qPCR檢測(cè)病毒的拷貝數(shù)。**.P<0.01,***.P<0.001A. Western blot detection of Cap protein content; B. Detection of PCV2 copies by qPCR method.**.P<0.01,***.P<0.001圖3 DAC抑制不同時(shí)間的PCV2增殖Fig.3 DAC inhibits PCV2 proliferation at different time

2.3 地西他濱下調(diào)細(xì)胞DNA甲基化水平

DAC作為一種去甲基化藥物,能顯著抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的甲基化功能。通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)表征細(xì)胞的甲基化程度,結(jié)果顯示DAC給藥組的細(xì)胞中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5 mC) 的甲基化水平顯著降低(圖4A)。此外,通過(guò)qPCR檢測(cè)細(xì)胞中的Ⅰ型干擾素(interferons,IFNs)和干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs),發(fā)現(xiàn)DAC處理組的Ⅰ-IFN和ISGs均發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4B)。

A. 免疫熒光檢測(cè)DNA甲基化程度;B. qPCR檢測(cè)抗病毒因子的轉(zhuǎn)錄水平。ns. P>0.05,***.P<0.001,****.P<0.000 1A. Detection of DNA methylation level using immunofluorescence assay; B. Transcription level of antiviral factors were detected by qPCR. ns. P>0.05,***.P<0.001,****.P<0.000 1圖4 DAC抑制DNA甲基化并活化抗病毒免疫通路Fig.4 DAC inhibits DNA methylation and activates antiviral immune pathway

2.4 敲低DNMT1顯著抑制PCV2的體外增殖

DNMT1作為DAC的作用靶點(diǎn),是哺乳動(dòng)物中主要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,可將甲基轉(zhuǎn)移到基因組DNA的胞嘧啶核苷酸上。為了進(jìn)一步確定DAC抗PCV2活性的作用機(jī)制,采用RNA干擾技術(shù)沉默DAC的作用靶點(diǎn)DNMT1。通過(guò)顯微鏡成像觀察細(xì)胞形態(tài)變化,qPCR檢測(cè)shRNA的敲低效率。結(jié)果顯示,RNA干擾并未對(duì)細(xì)胞的形態(tài)造成影響(圖5A),且敲低效率十分明顯(圖5B)。

A. 顯微鏡明場(chǎng)觀察細(xì)胞形態(tài);B. qPCR檢測(cè)Dnmt1敲低效率。***.P<0.001A. Observation of cell morphology by microscopic bright field; B. Dnmt1 knockdown efficiency was detected by qPCR.***.P<0.001圖5 Dnmt1敲低效率的驗(yàn)證Fig.5 Validation of Dnmt1 knockdown efficiency

檢測(cè)在PK-15細(xì)胞中沉默Dnmt1后PCV2不同時(shí)間的增殖情況,分別在病毒接種后的24、48、72 h進(jìn)行Western blot和qPCR,比較Dnmt1敲低組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的Cap蛋白的表達(dá)量和病毒的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,同一時(shí)間點(diǎn)的Dnmt1敲低組中PCV2的Cap蛋白表達(dá)量(圖6A)與PCV2的拷貝數(shù)(圖6B)顯著降低。表明Dnmt1在PCV2增殖的不同時(shí)期均發(fā)揮重要作用。此外,敲低Dnmt1后,發(fā)現(xiàn)Ⅰ-IFN和ISGs均發(fā)生了顯著的上調(diào)(圖6C)。

A. Western blot檢測(cè)Cap蛋白含量;B. qPCR檢測(cè)PCV2的病毒拷貝數(shù);C. qPCR檢測(cè)抗病毒因子的轉(zhuǎn)錄水平。***.P<0.001,****.P<0.000 1A. Western blot detection of Cap protein content; B. Detection of PCV2 copies by qPCR method; C. Transcription level of antiviral factors were detected by qPCR.***.P<0.001,****.P<0.000 1圖6 敲低Dnmt1可抑制PCV2的增殖并活化抗病毒免疫通路Fig.6 Knockdown of Dnmt1 inhibits PCV2 proliferation and activates antiviral immune pathway

3 討 論

PCV2作為一種普遍存在的病毒,當(dāng)前商品化疫苗的廣泛使用有效降低了PCV2發(fā)病率和病毒血癥水平,但亞臨床感染以及新基因型的出現(xiàn)仍然威脅著現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)[16-17]。因此,抗病毒藥物的開發(fā)與應(yīng)用是降低該病毒對(duì)養(yǎng)殖行業(yè)影響的重要手段。地西他濱作為一種核酸類似物,多項(xiàng)研究指出其不僅能有效對(duì)抗多種癌癥,還能通過(guò)上調(diào)固有免疫反應(yīng)發(fā)揮抗病毒功能[8,18-19]。此外,一系列研究表明DAC處理和DNMT1敲低能誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng),如低劑量的化療藥物DAC可以通過(guò)誘導(dǎo)病毒擬態(tài)來(lái)開啟結(jié)直腸癌干細(xì)胞抗病毒反應(yīng)等[20-23]。PCV2作為已知最小的感染動(dòng)物的DNA病毒,DAC抑制PCV2的作用靶點(diǎn)究竟是宿主DNA還是病毒DNA暫時(shí)未知,但多篇已發(fā)表的研究均指出宿主DNA去甲基化能誘導(dǎo)免疫信號(hào)的激活進(jìn)而發(fā)揮抗病毒功能。因此,人們有理由相信DAC主要作用于宿主細(xì)胞的DNA,但也可能對(duì)病毒基因組產(chǎn)生一些影響,具體的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)仍然需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定。

PCV2對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)有很強(qiáng)的抑制作用,能夠抑制干擾素生成細(xì)胞中IFN-α和TNF-α的生成,這是其常合并感染其他病原體的重要原因。本研究對(duì)DAC是否具有抑制PCV2增殖的作用進(jìn)行了初步探究,證明了DAC在較低濃度時(shí)可有效抑制PCV2在PK-15細(xì)胞中的增殖,其抗病毒機(jī)制依賴于DAC導(dǎo)致的去甲基化及其上調(diào)的固有免疫反應(yīng)。沉默DAC的作用靶點(diǎn)Dnmt1,能有效激活I(lǐng)-IFN和ISGs的表達(dá)且抑制PCV2的增殖,進(jìn)一步證明了DAC的抗病毒功能與其抑制DNA甲基化息息相關(guān),揭示Dnmt1是防治PCV2的潛在靶點(diǎn)。同時(shí),本研究證明DAC能有效抑制不同時(shí)期PCV2的增殖,指明DAC具有作為PCV2治療藥物的潛力,為豐富PCV2抗病毒藥的研發(fā)拓寬方向。

4 結(jié) 論

本研究證明DNA甲基化抑制劑地西他濱在體外對(duì)PCV2的感染具有抑制作用,且該抑制作用依賴于地西他濱的已知靶點(diǎn)DNMT1,為地西他濱在臨床上治療PCV2奠定理論基礎(chǔ)。