李貞明,余 苗,2,唐延天,李袁飛,劉志昌,容 庭,3*,馬現(xiàn)永,2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所 豬禽種業(yè)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評定工程技術(shù)研究中心,廣州 510640;2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心,茂名 525000;3.清遠(yuǎn)市弘順農(nóng)牧有限公司,清遠(yuǎn) 511500)

據(jù)《第二次全國污染源普查公報(bào)》[1]顯示,全國畜禽養(yǎng)殖業(yè)水污染排放量中,化學(xué)需氧量達(dá)到了1 000.53萬噸,氨氮11.09萬噸,總氮59.63萬噸,總磷11.97萬噸。針對畜禽污染,我國出臺了多項(xiàng)政策并提出了源頭減排、過程控制和末端利用的全方位減排理念,其中源頭減排主要是通過合理選擇飼料原料和在飼料中添加益生菌、天然提取物和酶制劑等的途徑來實(shí)現(xiàn)[2]。相較于過程控制和末端利用,源頭減排成本低,并具有事半功倍的效果,對畜禽養(yǎng)殖污染物的減排具有重要意義[3-4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

腐殖酸鈉中水溶性腐殖酸含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))≥70%。由輝昂化工有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取540只1日齡817白羽肉雞,隨機(jī)分為3組(每組6個重復(fù),每個重復(fù)30只)。對照組飼喂不含抗生素的基礎(chǔ)日糧,試驗(yàn)組分別飼喂含0.3%和0.5%腐殖酸鈉的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)為期42 d?；A(chǔ)日糧選取玉米、豆粕等原料,參照NRC(1994)并結(jié)合中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T33—2004)進(jìn)行配制,并制成顆粒料。基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)結(jié)束前3 d,每個重復(fù)選取體重相近的2只肉雞放入代謝籠,采取全收糞法進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (as-fed basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞飼養(yǎng)于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所試驗(yàn)場,采用地面平養(yǎng)。全期試驗(yàn)雞自由采食和飲水;1～28日齡,欄舍封閉,室溫保持32 ℃,采用全天光照;29～42日齡,欄舍開放,采用自然光照。其他按照常規(guī)飼養(yǎng)程序和免疫程序進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束前3 d,每個重復(fù)選取體重相近的2只肉雞放入代謝籠,采取全收糞法進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)。每天10:00收集糞樣,并剔除羽毛,隨后置于自封袋中,于-20 ℃冰箱保存。連續(xù)收集3 d后,取300 g糞樣,加入20 mL 10%硫酸,混合均勻。將日糧和糞樣65 ℃烘干至恒重,室溫回潮24 h后,稱重并粉碎。用于測定其中干物質(zhì)(DM)、能量(GE)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、鈣(Ca)、磷(P)和粗灰分(Ash)的含量,計(jì)算營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。另取10 g新鮮糞樣保存于-80 ℃冰箱,用于后續(xù)微生物及其代謝產(chǎn)物的檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的檢測 日糧和糞樣中營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率的檢測方法如下:分別按照GB/T6435—2006、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018和GB/T 6438—2007測定DM、CP、EE、Ca、P和Ash,采用全自動氧彈熱量計(jì)Parr 6400(Parr,美國)測定GE。

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)= 100×[(日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的量-對應(yīng)糞中該營養(yǎng)物質(zhì)的量)/日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的量]。

1.5.2 糞便微生物DNA提取和熒光定量PCR檢測 稱取0.20 g糞樣,利用糞便DNA純化試劑盒(4101050,杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)提取、純化糞便中微生物的總DNA,采用核酸蛋白測定儀(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific)測定DNA的濃度和質(zhì)量,樣品標(biāo)準(zhǔn)吸光度為260/280 在1.80～2.00,260/230 在2.00 左右。采用熒光定量PCR儀(CFX96 Real-time PCR System,Bio-Rad)對糞樣中總菌(total bacteria)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、普雷沃氏菌(Prevotella)、梭菌IV(ClostridiumclusterIV)、瘤胃球菌(Ruminococcus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的16S rRNA基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析,并以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豬禽種業(yè)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,計(jì)算結(jié)果均表示為每克糞樣中16S rRNA基因的拷貝數(shù)。PCR的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序具體參照Yu等[10]的方法,特異性引物由上海生工基因技術(shù)有限公司廣州分公司合成,PCR引物如表2[11-18]所示。

表2 定量微生物種類以及引物Table 2 Quantitative microbial species and primers

1.5.3 糞便中微生物代謝產(chǎn)物的檢測 氨態(tài)氮含量的檢測:根據(jù)Chaney和Marbach[19]的方法,采用比色法測定糞樣中氨態(tài)氮的含量。

乳酸含量的測定:按照試劑盒說明書步驟測定糞樣中乳酸的含量,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

酚和吲哚類物質(zhì)的檢測:參照Yu等[10]的方法處理樣品。使用高效液相色譜儀(Waters Alliance e2695,Waters)測定糞樣中酚和吲哚類化合物質(zhì),并利用外標(biāo)法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

生物胺含量測定:參照Yu等[10]的方法處理樣品。使用高效液相色譜儀(Waters Alliance e2695,Waters)測定糞樣中生物胺,并利用外標(biāo)法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、微生物和微生物代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)結(jié)果均以籠為統(tǒng)計(jì)單位,采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因子方差分析(one-way ANOVA,LSD)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 腐殖酸鈉對肉雞表觀消化率的影響

由表3可知,與對照組相比,日糧添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高肉雞對粗蛋白質(zhì)、磷和灰分的表觀消化率(P<0.05)。不同日糧處理對日糧中干物質(zhì)、總能、粗脂肪和鈣的表觀消化率無顯著影響(P>0.05)。

表3 腐殖酸鈉對肉雞日糧養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 3 Effect of sodium humate on dietary nutrients apparent digestibility of broilers %

2.2 腐殖酸鈉對肉雞糞便中微生物數(shù)量的影響

由表4可知,與對照組和0.3%組相比,日糧中添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高肉雞糞便中總菌和乳酸桿菌的數(shù)量,并降低大腸桿菌的數(shù)量(P<0.05)。與0.3%組相比,日糧中添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高肉雞糞便中普雷沃氏菌的數(shù)量(P<0.05)。不同日糧處理對肉雞糞便中厚壁菌門、擬桿菌門、雙歧桿菌、梭菌IV和瘤胃球菌無顯著影響(P>0.05)。

表4 腐殖酸鈉對白羽肉雞糞便中微生物數(shù)量的影響Table 4 Effect of sodium humate on the number of microorganisms in the feces of white-feathered broilers lg(16S基因拷貝數(shù))·g-1

2.3 腐殖酸鈉對肉雞糞便中氨態(tài)氮、乳酸、酚和吲哚類化合物含量的影響

由表5可知,與對照組相比,日糧中添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中氨態(tài)氮的含量,并提高乳酸的含量(P<0.05)。與對照組和0.3%組相比,0.5%組肉雞糞便中的對甲酚顯著降低(P<0.05)。不同日糧處理對肉雞糞便中苯酚、吲哚和糞臭素?zé)o顯著影響(P>0.05)。

表5 腐殖酸鈉對肉雞糞便中乳酸和含氮化合物含量的影響Table 5 Effect of sodium humate on lactic acid and nitrogenous compounds concentrations in broilers′ manure

2.4 腐殖酸鈉對肉雞糞便中生物胺含量的影響

由表6可知,與對照組和0.3%組相比,日糧添加0.5%腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中酪胺、亞精胺、精胺和總生物胺的含量(P<0.05)。與對照組相比,日糧添加0.3%和0.5%腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中腐胺的含量(P<0.05);另外,日糧添加0.3%腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中酪胺和精胺的含量(P<0.05)。不同日糧處理對肉雞糞便中甲胺、色胺和尸胺的含量無顯著影響(P>0.05)。

表6 腐殖酸鈉對肉雞糞便中生物胺含量的影響Table 6 Effect of sodium humate on biogenic amine concentrations in broilers′ manure μg·g-1

3 討 論

3.1 腐殖酸鈉對肉雞營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

表觀消化率是反映試驗(yàn)動物對日糧中營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收水平的重要指標(biāo)。在本試驗(yàn)中,日糧添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高粗蛋白、磷和灰分的表觀消化率。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn),日糧添加腐殖酸鈉可顯著提高肉雞對有機(jī)物和干物質(zhì)的表觀消化率。Wang等[21]研究則表明,羔羊?qū)θ占Z養(yǎng)分的表觀消化率不受腐殖酸的影響。本試驗(yàn)結(jié)果與上述的結(jié)果并不一致,可能是添加劑量和生產(chǎn)廠家的不同所導(dǎo)致的,具體原因還需進(jìn)一步研究。腐殖酸鈉是一種有機(jī)弱酸鹽,可調(diào)節(jié)并穩(wěn)定畜禽消化系統(tǒng)中的pH,提高消化酶的活性,促進(jìn)畜禽腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收[22-24]。同時,腐殖酸鈉作為一種螯合劑,具有較強(qiáng)的絡(luò)合力、離子交換作用和吸附作用,在日糧經(jīng)過畜禽腸道時,腐殖酸鈉通過吸附作用使日糧中的營養(yǎng)物質(zhì)緩慢通過腸道,延長營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收時間,提高營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率[25-26]。因此,腐殖酸鈉提高肉雞對營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率,可能是因?yàn)楦乘徕c提高了肉雞腸道中有益菌的數(shù)量,穩(wěn)定了腸道環(huán)境的pH,刺激消化酶分泌,并通過吸附作用,延長營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收時間,進(jìn)而提高肉雞對營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。

3.2 腐殖酸鈉對肉雞糞便中微生物數(shù)量的影響

腸道菌群與畜禽機(jī)體代謝和健康水平密切相關(guān),是維持腸道屏障功能和穩(wěn)定腸道微生態(tài)環(huán)境的關(guān)鍵[27]。乳酸桿菌和普雷沃氏菌是肉雞腸道中的有益菌,乳酸桿菌作為優(yōu)勢菌群定植在肉雞腸道中,具有產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和抑菌因子的功效,可有效改善腸道環(huán)境,抑制有害菌的生長和繁殖;普雷沃氏菌是短鏈脂肪酸的主要生產(chǎn)菌,可通過促進(jìn)腸道黏膜的發(fā)育來穩(wěn)定腸道環(huán)境[28-29]。大腸桿菌屬于畜禽腸道中常見的病原菌,產(chǎn)生內(nèi)毒素和腸毒素破壞腸道黏膜屏障,導(dǎo)致畜禽腸道感染,影響畜禽機(jī)體健康[30]。在本試驗(yàn)中,日糧添加0.5%的腐殖酸鈉可顯著提高肉雞糞便中乳酸桿菌的數(shù)量,并降低大腸桿菌的數(shù)量。這與Domínguez-Negrete等[31]研究一致。腐殖酸鈉是一種多功能化合物,富含生物堿、維生素和生物活性物質(zhì),具有抗菌、抗炎和止瀉等功能[32]。腐殖酸鈉能夠調(diào)控腸道菌群,可能是因?yàn)楦乘徕c富含多種功能性活性物質(zhì),促進(jìn)有益菌的生長繁殖,使有益菌分泌乳酸、短鏈脂肪酸和抑菌因子等,抑制大腸桿菌等有害菌的生長繁殖。這也進(jìn)一步驗(yàn)證了腐殖酸鈉可通過改善腸道微生態(tài)環(huán)境,提高肉雞對營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。

3.3 腐殖酸鈉對肉雞糞便中乳酸和含氮化合物含量的影響

日糧中未被胃和小腸消化吸收的含氮物質(zhì)進(jìn)入后腸后會被微生物發(fā)酵生成氨態(tài)氮、酚和吲哚類化合物等臭味物質(zhì),其中高濃度氨態(tài)氮抑制腸道上皮細(xì)胞的增殖與分化,降低線粒體的氧化作用,增加腹瀉率;高濃度對甲酚具有遺傳毒性和致癌性,不利于腸道健康[33-34]。McMurphy等[35]和Ikyume等[36]研究表明,腐殖酸具有較強(qiáng)的氮結(jié)合能力,可顯著降低肉牛和山羊瘤胃中氨態(tài)氮的濃度。本試驗(yàn)中,肉雞糞便中氨態(tài)氮和對甲酚的濃度顯著降低,可能與腐殖酸鈉的氮結(jié)合能力有關(guān)。此外,日糧添加0.5%的腐殖酸鈉顯著提高了肉雞糞便中乳酸的含量,這與腐殖酸鈉提高糞便中乳酸菌的數(shù)量有關(guān)。研究表明,乳酸可有效抑制致病菌的生長與繁殖,并降低其發(fā)酵含氮化合物所需蛋白酶的活性,減少畜禽糞便中的臭味物質(zhì)的產(chǎn)生[37-38]。因此,腐殖酸鈉降低肉雞糞便中的含氮化合物的濃度,一方面是因?yàn)楦乘徕c具有較強(qiáng)的氮結(jié)合能力,另一方面是因?yàn)楦乘徕c抑制有害菌的生長與繁殖,降低發(fā)酵含氮化合物所需蛋白酶的活性,進(jìn)而減少臭味物質(zhì)的產(chǎn)生。

3.4 腐殖酸鈉對肉雞糞便中生物胺含量的影響

生物胺主要是微生物對氨基酸進(jìn)行脫羧產(chǎn)生的一種有機(jī)堿性化合物,包括一元胺、二元胺和多胺[39-40]。例如,酪氨酸脫羧生成酪胺;精氨酸脫羧生成腐胺、亞精胺和精胺。高濃度酪胺、腐胺、亞精胺和精胺具有毒性,能引起高血糖、偏頭痛、腎衰竭和腫瘤在內(nèi)的相關(guān)疾病[41]。何俊娜等[42]報(bào)道稱,腐殖酸可影響微生物對含氮化合物的代謝水平。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,日糧添加腐殖酸鈉可顯著降低肉雞糞便中酪胺、腐胺、亞精胺、精胺和總生物胺的濃度,表明腐殖酸鈉可抑制微生物對酪氨酸和精氨酸的脫羧反應(yīng),降低相關(guān)生物胺濃度。余苗等[34]研究表明,大腸桿菌等微生物具有代謝含氮化合物產(chǎn)生生物胺的能力。在本試驗(yàn)中,日糧添加腐殖酸鈉顯著降低了肉雞糞便中大腸桿菌的數(shù)量,進(jìn)一步驗(yàn)證了腐殖酸鈉具有降低肉雞糞便中生物胺濃度的作用。

4 結(jié) 論

日糧添加腐殖酸鈉可提高肉雞對日糧中粗蛋白、磷和灰分的表觀消化率,促進(jìn)糞便中乳酸菌的生長與繁殖,提高乳酸的濃度,抑制大腸桿菌的生長與繁殖;同時,降低糞便中氨態(tài)氮、對甲酚、腐胺、酪胺、亞精胺、精胺和總生物胺等臭味物質(zhì)的濃度,達(dá)到源頭減排的目的,且在本試驗(yàn)條件下添加0.5%的效果優(yōu)于0.3%。