宋鵬琰,王思偉, 2,岳巧嫻,張寅梁,陳曉勇,周榮艷*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,保定 071001;2.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所,石家莊 050035)

microRNA(miRNA)是一種細胞內(nèi)源性長度約18～24 nt的非編碼且高度保守的RNA[1],主要通過與靶基因3′-UTR的特異性堿基互補配對在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[2]。miRNA可調(diào)控細胞周期、增殖、凋亡等過程[3-4]。miR-200b屬于miR-200家族一員,可以參與激素合成和分泌、發(fā)情周期和排卵來調(diào)節(jié)雌性動物的繁殖。miR-200b和miR-200c可以靶向調(diào)控磷酸酶張力蛋白同源物的表達抑制人顆粒細胞KGN增殖[5]。miR-200b通過下調(diào)GNAQ反饋調(diào)控GnRH的表達來調(diào)控綿羊的發(fā)情過程[6]。敲除miR-200b和miR-429的雌性小鼠不排卵,且通過抑制ZEB1的表達來調(diào)節(jié)小鼠繁殖過程[7]。miR-200b-3p還可以靶向CYP19A1基因調(diào)控小鼠顆粒細胞類固醇激素的合成和分泌[8]。此外,miR-200b在哈薩克羊和湖羊發(fā)情期卵巢中表達顯著下調(diào)[9-10],在小尾寒羊卵巢黃體期與卵泡期表達水平存在差異,且黃體期高于卵泡期[11],在不同直徑綿羊卵泡中表達水平也有所差異[12],但其表達調(diào)控機制尚不明確。

NR4A1(Nur77、TR3或NGF1-B)作為核受體家族NR4A成員之一,可作為轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)細胞凋亡[13-14]。NR4A1能夠調(diào)控卵泡發(fā)育[15]、抑制顆粒細胞增殖并促進顆粒細胞凋亡,且其與黃體退化密切相關(guān)[16-17]。通過靶基因和轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測,發(fā)現(xiàn)NR4A1基因3′-UTR不存在miR-200b的結(jié)合位點,但在miR-200b的啟動子區(qū)上存在NR4A1的結(jié)合位點,推測NR4A1能夠調(diào)控miR-200b的轉(zhuǎn)錄。為驗證這一假設(shè),本研究鑒定了綿羊miR-200b核心啟動子區(qū),檢測了NR4A1對miR-200b啟動子活性及其表達水平的影響,為miR-200b的上游轉(zhuǎn)錄機制提供了理論依據(jù)。

線粒體作為“能量工廠”,為細胞提供能量,調(diào)控細胞周期、增殖分化、信號傳導(dǎo)及細胞死亡過程[18]。細胞周期與線粒體功能協(xié)調(diào)互作[19],線粒體在細胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。細胞周期調(diào)節(jié)因子可以控制線粒體的生物發(fā)生、代謝活動及動力學(xué),線粒體又可以為細胞周期提供所需能量[19]。線粒體功能異?？芍戮€粒體膜電位下降、ROS升高,導(dǎo)致細胞凋亡[20-21]。線粒體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)是線粒體重要的代謝功能之一,OXPHOS缺陷導(dǎo)致線粒體膜電位降低,引起細胞啟動適應(yīng)性反應(yīng)[22]。miRNA通過靶基因參與細胞線粒體OXPHOS和ROS生成,調(diào)控細胞線粒體功能[23]。miR-211在調(diào)控細胞OXPHOS和線粒體能量代謝中起重要作用[24],miR-200a促進細胞線粒體伸長[25],miR-210調(diào)控線粒體電子傳遞鏈并刺激ROS產(chǎn)生[26]。抑制miR-23a可提高細胞線粒體膜電位并減少ROS產(chǎn)生,抑制細胞凋亡[27]。拮抗miR-107的表達可致細胞線粒體膜電位和電子傳遞鏈活性降低,引發(fā)線粒體失衡[28]。該團隊前期研究發(fā)現(xiàn),miR-200b抑制綿羊卵泡顆粒細胞增殖并促進細胞凋亡[29],推測miR-200b是通過影響顆粒細胞線粒體功能進而發(fā)揮抑增殖和促凋亡的作用。因此,本試驗研究了miR-200b對綿羊卵泡顆粒細胞線粒體功能的影響,為闡明其抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清FBS購自Thermo Fisher Scientific公司;miR-200b mimic和mimic NC合成于廣州銳博生物科技有限公司;SacⅠ、HindⅢ和PrimeScriptTM RT Reagent Kit購自TaKaRa公司;HiPerFect Transfection Reagent購自QIAGEN公司;LipofectamineTM2000和Mito-Tracker Red CMXRos購自Invitrogen公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;增強型線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和增強型ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ROS活性氧檢測試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司;綿羊線粒體呼吸鏈復(fù)合物 Ⅰ(Complex Ⅰ)ELISA試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司;Forget-Me-NotTMEvagreen?qPCR Master Mix購自美國Biotium公司。

1.2 顆粒細胞分離培養(yǎng)

在保定瑞麗肉食品有限公司采集綿羊(小尾寒羊)新鮮卵巢組織,立即放入含1%雙抗的37 ℃生理鹽水中,48 h內(nèi)運回實驗室。清洗消毒后去除多余的脂肪和系膜,利用無菌刀片劃破卵泡(3～7 mm)釋放卵泡液混于培養(yǎng)基中,1 500 r·min-1離心10 min。PBS洗滌2次后,用含10% FBS,1%青霉素鏈霉素與50 μg·mL-1丙酮酸鈉的DMEM/F12培養(yǎng)基混勻顆粒細胞,并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)[29]。

1.3 熒光素酶載體構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載綿羊miR-200b(ENSOARG00000023754,Chromosome 12,NC_040 263.1:55,091,437-55,091,495)啟動子區(qū)序列。利用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測miR-200b的啟動子,設(shè)計特異性引物(表1),并以綿羊基因組DNA為模板進行擴增。PCR產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進行測序。利用限制性內(nèi)切酶SacⅠ 和Hind Ⅲ將不同片段序列連接至pGL3-Basic載體上,經(jīng)制備線性克隆載體、片段插入、PCR擴增及產(chǎn)物純化、克隆、轉(zhuǎn)化及陽性克隆檢測等過程,陽性克隆送至通用生物系統(tǒng)有限公司進行測序。提取測序鑒定后的陽性重組質(zhì)粒用于細胞轉(zhuǎn)染,測定濃度后于-20 ℃保存。

表1 啟動子擴增引物Table 1 Primers used in promoter amplification

1.4 熒光素酶活性檢測

以每孔8×104個細胞的密度將顆粒細胞接種于24孔板,每孔加入500 μL細胞懸液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,當細胞匯合度達70%～90%時,按照質(zhì)粒:LipofectamineTM2000為1∶2、pGL3-control:pRL-TK為99∶1的比例分別將pGL3-Basic、miR-200b啟動子重組質(zhì)粒與內(nèi)參載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染至顆粒細胞中,每組3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染48 h后,棄掉培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,每孔加100 μL裂解液,室溫震蕩裂解10 min后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管,8 000×g(4 ℃)離心10 min。每組取5 μL上清液,加20 μL 1×LARII,混勻后測定F(螢火蟲熒光素)值,再加20 μL 1×Stop &Glo Reagent,測定R(海腎熒光素酶)值。每孔檢測重復(fù)3次。

1.5 Mito-tracker Red CMXRos染色

將顆粒細胞接種于24孔板,每孔0.5 mL細胞懸液,每組3個重復(fù),37 ℃預(yù)培養(yǎng)。用opti-M分別稀釋50 nmol·L-1miR-200b mimic和mimic NC,低速漩渦混勻,加入3 μL HiPerFect Transfection Reagent,低速漩渦混勻后室溫靜置10 min,然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合體逐滴加至24孔板內(nèi)。48 h后,棄掉培養(yǎng)基,加入25 nmol·L-1Mito-Tracker Red CMXRos工作液,37 ℃孵育30 min。棄掉工作液,PBS清洗3次。滴加Hoechst 33342染色液進行核染,室溫孵育10 min,PBS洗3次,棄掉液體,倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。然后將圖片用Image J進行光密度分析和細胞長度分析。

1.6 線粒體膜電位和ROS檢測

顆粒細胞轉(zhuǎn)染50 nmol·L-1miR-200b mimic和mimic NC,48 h后,棄掉培養(yǎng)基,PBS洗滌2次。然后分別按照線粒體膜電位檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒說明書進行探針的裝載和檢測,并用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。圖片用Image J進行光密度分析。

1.7 ATP含量檢測

將顆粒細胞接種于6孔板,每孔2.3 mL細胞懸液,每組3個重復(fù),37 ℃預(yù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染50 nmol·L-1miR-200b mimic和mimic NC,48 h后收集上清液。每孔加240 μL裂解液,裂解細胞。裂解后4 ℃12 000×g離心5 min,取上清,放冰上待檢測。先在1.5 mL離心管內(nèi)加入100 μL ATP檢測工作液,室溫放置5 min,以消耗本底ATP;然后向檢測孔內(nèi)加20 μL樣品或標準品,吹打混勻,2 s后檢測RLU值。

1.8 線粒體復(fù)合物 Ⅰ 濃度檢測

ELISA用于檢測顆粒細胞上清液中線粒體復(fù)合物 Ⅰ 濃度。將步驟“1.5”中收集的細胞上清液3 000 r·min-1離心10 min。按ELISA試劑盒說明書進行配液和檢測,并利用酶標儀在450 nm處測定OD值,并根據(jù)標準曲線計算樣品線粒體復(fù)合物 Ⅰ 的濃度。

1.9 基因表達水平檢測

將顆粒細胞接種于6孔板,轉(zhuǎn)染50 nmol·L-1miR-200b mimic和mimic NC,48 h后收集細胞。首先利用TRIzolTMReagent提取RNA,然后利用PrimeScriptTMRT reagent kit進行反轉(zhuǎn)錄。具體步驟和體系如下:除去基因組DNA(RNA 800 μg,5×gDNA Reaction Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL,RNase-free dH2O 補至10 μL,42 ℃孵育2 min,4 ℃保存),以及反轉(zhuǎn)錄(上述反應(yīng)液 10 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL,RT Primer Mix 1 μL,5×PrimeScript Buffer 4 μL,RNase Free dH2O 4 μL。輕輕混勻,37 ℃孵育15 min,85 ℃加熱失活5 s,產(chǎn)物-20 ℃保存)。最后利用Forget-Me-NotTMEvagreen?qPCR Master Mix進行qRT-PCR,反應(yīng)體系:2×Forget-Me-NotTM qPCR Master Mix 10 μL,Forget-Me-Not EvaGreen ROX Reference Dye 3 μL,RNase-free dH2O 4.2 μL,cDNA 2 μL,Forward Primer 0.4 μL,Reverse Primer 0.4 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 5 s共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進行計算。引物序列詳見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 qRT-PCR primer sequences

1.10 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。判斷每組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布,若符合正態(tài)分布,則采用獨立樣本t檢驗;若不符合則采用非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney U檢驗)。利用GraphPad Prism 8軟件作圖。所有結(jié)果以“平均數(shù)±標準差(Mean±SD)”表示,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊miR-200b核心啟動子區(qū)的鑒定

利用pGL3-Basic質(zhì)粒構(gòu)建miR-200b啟動子區(qū)不同長度片段的熒光素酶表達載體miR-200b-P1(-159/+36 nt)、miR-200b-P2(-339/+36 nt)和miR-200b-P3(-581/+36 nt)。將不同長度片段重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至綿羊卵泡顆粒細胞中,48 h后收集細胞,化學(xué)發(fā)光法檢測雙熒光素酶活性。如圖1所示,miR-200b-P1的熒光素酶活性分別極顯著高于空載體pGL3-Basic和其他片段(P<0.01),表明其為綿羊miR-200b的核心啟動子。利用在線軟件JASPAR(https://jaspar2018.genereg.net/analysis)預(yù)測綿羊miR-200b-P1序列中存在1個轉(zhuǎn)錄因子NR4A1結(jié)合位點(圖2)。

**.P<0.01,下同**.P<0.01, the same as below圖1 綿羊miR-200b啟動子區(qū)不同缺失載體的相對熒光素酶活性Fig.1 The relative luciferase activity of different deletion vectors of oar-miR-200b promoter

2.2 NR4A1促進綿羊miR-200b的轉(zhuǎn)錄

將實驗室保存的NR4A1過表達載體(pcDNA3.1-NR4A1)與miR-200b-P1共轉(zhuǎn)染至綿羊卵泡顆粒細胞中,48 h后收集細胞并進行雙熒光素酶活性檢測。過表達NR4A1的顆粒細胞中miR-200b-P1啟動子活性極顯著升高(P<0.01,圖3A)。與pcDNA3.1組相比,NR4A1過表達的顆粒細胞中miR-200b表達水平極顯著上調(diào)(P<0.01,圖3B)。以上結(jié)果說明,NR4A1可促進綿羊miR-200b的轉(zhuǎn)錄。

A. miR-200b-P1啟動子區(qū)活性;B. miR-200b相對表達量A. The promoter activity of miR-200b-P1; B. Relative expression of miR-200b圖3 綿羊miR-200b核心啟動子活性及其相對表達水平Fig.3 The core promoter activity and relative expression of oar-miR-200b

2.3 miR-200b對顆粒細胞線粒體形態(tài)和數(shù)量的影響

通過Mito-Tracker Red CMXRos染色(圖4A)發(fā)現(xiàn),與mimic NC組相比,miR-200b mimic組的顆粒細胞線粒體發(fā)生皺縮。經(jīng)統(tǒng)計分析,miR-200b mimic處理組顆粒細胞平均光密度顯著降低(P<0.01,圖4B),線粒體數(shù)量減少,且細胞長度顯著縮短(P<0.01,圖4C)。

2.4 miR-200b對顆粒細胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中,形成JC-1聚合物(JC-1 aggregates),產(chǎn)生紅色熒光;線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,以JC-1單體(JC-1 monomer)形式存在,產(chǎn)生綠色熒光;JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變,說明細胞線粒體膜電位下降,也是細胞早期凋亡的標志性事件。與mimic NC組相比,miR-200b mimic組的顆粒細胞綠色熒光顯著增強,且紅色熒光與綠色熒光比值顯著降低(P<0.05,圖5A),說明顆粒細胞中JC-1單體明顯增多,線粒體膜電位下降。

A. 線粒體膜電位染色(200×)及紅色熒光與綠色熒光相對比值;B. ATP含量;C. ROS水平;D. 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 Ⅰ 濃度。*.P<0.05A. Staining in mitochondrial membrane potential (200×) and relative RFP/GFP ratio; B. The content of ATP; C. The level of ROS; D. The concentration of mitochondrial respiratory chain complex I. *.P<0.05圖5 過表達miR-200b的綿羊卵泡顆粒細胞線粒體膜電位及氧化磷酸化相關(guān)指標變化Fig.5 Changes in mitochondrial membrane potential and OXPHOS-related indicators in ovine follicular granulosa cells with overexpression of miR-200b

2.5 miR-200b對顆粒細胞線粒體氧化磷酸化及相關(guān)基因表達的影響

與mimic NC組相比,miR-200b mimic組的顆粒細胞ATP含量(P<0.05,圖5B)和線粒體呼吸鏈復(fù)合物 Ⅰ 的濃度(P<0.01,圖5D)顯著降低,ROS水平極顯著升高(P<0.01,圖5C)。此外,miR-200b mimic極顯著下調(diào)顆粒細胞線粒體氧化磷酸化相關(guān)基因NDUFV1(P<0.01, 圖6A)和ATP6V1G1(P<0.01, 圖6B)基因的表達水平,并極顯著上調(diào)NOX4基因的表達水平(P<0.01, 圖6C)。

圖6 綿羊卵泡顆粒細胞中線粒體氧化磷酸化相關(guān)基因的表達水平Fig.6 The expression level of mitochondrial OXPHOS related genes in ovine follicular granulosa cells

3 討 論

miRNA主要通過與靶基因3′-UTR結(jié)合發(fā)揮其對基因下游的調(diào)控功能,但miRNA的轉(zhuǎn)錄及其上游調(diào)控機制研究也很重要。一些miRNAs位于基因內(nèi)含子區(qū)域,與宿主基因享有相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,但大部分miRNA具有自己的啟動子[2]。因此,研究miRNA的啟動子有助于揭示miRNA自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。轉(zhuǎn)錄因子在動物細胞內(nèi)廣泛存在,能通過準確識別并結(jié)合到特異的DNA片段來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[30]。許多轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄。CCAAT/增強子結(jié)合蛋白a可作用于miR-130a和miR-130b基因的啟動子分別顯著抑制和促進miRNA的啟動子活性[31]。TGFβ1可調(diào)控miR-224啟動子區(qū)域誘導(dǎo)miR-224的轉(zhuǎn)錄[32]。ZEB1和ZEB2可直接結(jié)合miR-200s 啟動子區(qū)抑制其轉(zhuǎn)錄[33]。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達時結(jié)合的靶基因啟動子的特殊位點[34],轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合在miRNA啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上調(diào)控miRNA表達。本研究明確了綿羊miR-200b核心啟動子區(qū)(-159/+36 nt),證實NR4A1影響miR-200b核心啟動子的活性及其表達水平,促進miR-200b的轉(zhuǎn)錄。

NR4A(nuclear receptor subfamily 4 group A member)家族是一類及早反應(yīng)基因家族[35],主要由NR4A1、NR4A2和NR4A3組成。NR4A涉及細胞生長、生存和凋亡,主要源于3種生化特性:1)作為轉(zhuǎn)錄因子,激活上調(diào)介導(dǎo)細胞增殖和存活的靶基因表達;2)作為轉(zhuǎn)錄因子,激活上調(diào)導(dǎo)致細胞凋亡的靶基因表達;3)移位至胞質(zhì)并靶向定位于線粒體觸發(fā)凋亡[13-14]。NR4A1在動物組織中廣泛表達,并在卵巢組織中主要定位于卵泡膜細胞、黃體細胞和顆粒細胞[17,36-37],調(diào)控雌性動物卵巢功能和卵泡發(fā)育。NR4A1可作為miRNA(如miR-204-5p[38]、miR-506[39])下游靶基因發(fā)揮作用。然而,NR4A1基因3′-UTR與綿羊miR-200b間不存在靶向結(jié)合位點,因此二者不存在靶向關(guān)系。NR4A1作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多種RNAs的轉(zhuǎn)錄。NR4A1在黃體細胞中高表達[37],miR-200b在黃體期卵巢中表達上調(diào)[11],且二者都能抑制顆粒細胞增殖并促進細胞凋亡[16,29],推測NR4A1可調(diào)控miR-200b的轉(zhuǎn)錄。在本研究中,綿羊miR-200b核心啟動子上存在NR4A1的結(jié)合位點,且過表達NR4A1提高了miR-200b的啟動子活性和表達水平,證實NR4A1能夠正向調(diào)控綿羊miR-200b的轉(zhuǎn)錄。

miR-200b過表達顯著下調(diào)細胞周期相關(guān)基因表達抑制綿羊卵泡顆粒細胞增殖,同時顯著下調(diào)Bcl-2的表達水平促進顆粒細胞凋亡[29]。線粒體在細胞周期和凋亡中扮演著重要作用[18]。細胞周期重要調(diào)控因子CDK1和Cyclin B,其蛋白定位于線粒體基質(zhì)上,可磷酸化呼吸鏈復(fù)合物 Ⅰ 亞基,復(fù)合物被激活,可促進OXPHOS為G2/M期轉(zhuǎn)化提供充足的ATP[40]。Bcl-2家族成員可驅(qū)動線粒體外膜透化,導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)因子和半胱天冬酶通路激活所介導(dǎo)的細胞凋亡[41-43]。半胱天冬酶通路與線粒體損傷相關(guān),伴隨電子傳遞的破壞、OXPHOS、ATP產(chǎn)生和氧化還原電位變化[21,44]。本研究發(fā)現(xiàn),在顆粒細胞中過表達miR-200b導(dǎo)致線粒體功能異常,包括線粒體皺縮、線粒體膜電位下降、ATP含量降低,以及ROS水平提高。線粒體結(jié)構(gòu)的完整性與形態(tài)維持對其功能發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用,且線粒體通過OXPHOS產(chǎn)生ATP[45],而ROS是觸發(fā)顆粒細胞凋亡所必需的[46]。通過檢測發(fā)現(xiàn),miR-200b過表達導(dǎo)致顆粒細胞線粒體呼吸鏈體復(fù)合物 Ⅰ 的濃度降低,且下調(diào)了參與復(fù)合物 Ⅰ 模塊組裝的關(guān)鍵基因NDUFV1的表達。同時,與ATP生成相關(guān)基因ATP6V1G1的表達水平也發(fā)生異常,且上調(diào)與ROS產(chǎn)生相關(guān)基因NOX4的表達。所有這些結(jié)果相互一致,表明miR-200b可負調(diào)控綿羊卵泡顆粒細胞OXPHOS,導(dǎo)致細胞線粒體功能異常,進而能夠抑制顆粒細胞增殖并促進細胞凋亡。

4 結(jié) 論

綿羊miR-200b的核心啟動子區(qū)為-159/+36 nt,NR4A1正向調(diào)控miR-200b的轉(zhuǎn)錄,且miR-200b抑制綿羊卵泡顆粒細胞氧化磷酸化過程,誘導(dǎo)顆粒細胞線粒體損傷。本研究為進一步揭示miR-200b調(diào)控綿羊卵泡發(fā)育的作用機制提供了理論依據(jù)。