徐婷婷,齊芬芳,黃世會,牛 熙,李 升,冉雪琴*,王嘉福*,謝 健

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025;2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院,貴陽 550025;3.遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,遵義 563000)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、運(yùn)動及基因調(diào)控等過程中起關(guān)鍵作用[1-2],由細(xì)胞因子、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞黏附等多種因素刺激激活,并在所有真核細(xì)胞中發(fā)揮作用。MAPK信號通路的核心是3種蛋白激酶的聯(lián)級反應(yīng):活化的絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K)磷酸化并激活特定的 MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAP2K),進(jìn)一步激活MAPK[3]。MAP3K4作為絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一,有激酶結(jié)構(gòu)域和蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域[4-6]。研究表明,MAP3K4基因不僅是原癌相關(guān)基因[7-8],還參與草魚腸道免疫應(yīng)答[9]、細(xì)胞炎癥反應(yīng)[10],調(diào)節(jié)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白CREBBP(cAMP response element-binding binding proteins)或組蛋白脫乙酰酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)控制細(xì)胞在上皮和間充質(zhì)表型之間的轉(zhuǎn)換[11-12]。本實(shí)驗(yàn)室前期對香豬全基因組進(jìn)行了重測序,從MAP3K4基因內(nèi)含子15中檢測到一個結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189,本文著重研究該結(jié)構(gòu)變異的群體分布規(guī)律及其與基因表達(dá)之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

香豬1 216頭的血液或組織樣品采自貴州從江粵黔香豬開發(fā)有限公司,50頭大白豬血樣和組織樣采自貴州某屠宰場,其中血液樣品用于基因型分析,6月齡的香豬和大白豬組織用于基因表達(dá)譜等研究。2×TaqPCR Master Mix、膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit為Fermentas公司產(chǎn)品。

1.2 基因組提取

根據(jù)血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書方法,提取血液和組織樣基因組DNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,基因組質(zhì)量良好,分裝成小份量,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因片段擴(kuò)增

參照NCBI GenBank中豬參考基因(Scrofa11.1)MAP3K4序列,取結(jié)構(gòu)變異(structure variation, SV)上、下游各500 bp堿基序列,利用Primer 5設(shè)計(jì)引物PCR-MAP3K4-F/R(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的香豬和大白豬基因組作為模板進(jìn)行PCR檢測,擴(kuò)增體系為20 μL:TaqPCR Master Mix(2×)10 μL,上、下游引物各(10 μmol·L-1)0.5 μL,ddH2O 8 μL,基因組模板1 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,32個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下切取含目的DNA的膠塊,由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.4 MAP3K4基因結(jié)構(gòu)變異群體分布

以1 216頭香豬和50頭大白豬的血液基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增后,取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR產(chǎn)物測序,與基因參考序列等長的擴(kuò)增片段命名為正常的I等位基因,比參考序列短的命名為缺失型D等位基因,根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小判斷SV的基因型。計(jì)算各豬群每種基因型所占比例,等位基因頻率計(jì)算公式為:純合子基因型頻率+(雜合子基因型頻率/2),應(yīng)用IBM SPSS Statistics v26軟件對2個豬品種間進(jìn)行卡方檢驗(yàn),分析二者的等位基因頻率之間是否存在差異。

1.5 基因MAP3K4結(jié)構(gòu)變異區(qū)域生物信息學(xué)分析

利用在線軟件Repeat Masker和RegRNA2.0(表2)分析SV區(qū)域中是否包含重復(fù)元件、以及影響內(nèi)含子加工的功能元件。

表2 生物信息學(xué)分析軟件Table 2 Softwares for bioinformatics analysis

1.6 qPCR擴(kuò)增效率分析

以cDNA作為模板,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,qPCR產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,在紫外燈下,切下含擴(kuò)增產(chǎn)物的膠塊,由生工生物工程(上海)股份有限公司完成堿基序列測定。膠回收目的片段與pGEM-T Vector連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,涂布固體LB培養(yǎng)基[13],37 ℃過夜培養(yǎng),得到單菌落。用滅菌的槍頭沾取單菌落作為模板,進(jìn)行菌落PCR,檢測目的片段是否轉(zhuǎn)入大腸桿菌,LB液體培養(yǎng)基170 r·min-1振蕩37 ℃培養(yǎng)過夜,提取重組質(zhì)粒檢測濃度,將內(nèi)參GAPDH和目的基因的重組質(zhì)粒分別作5個10倍梯度稀釋作為模板,進(jìn)行RT-qPCR以檢測擴(kuò)增效率。檢測體系為:模板2 μL,引物0.5 μL,SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μL ,ddH2O 7 μL;反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 3 min,變性95 ℃ 5 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 20 s。

1.7 RT-qPCR擴(kuò)增

采用熒光定量PCR方法檢測MAP3K4基因的表達(dá)量。據(jù)NCBI公布的MAP3K4基因mRNA參考序列(GenBank No. XM_021 086 227.1),用在線軟件Primer3 Plus(www.bioinformatics.nl)設(shè)計(jì)定量引物qPCR-F/R(表1),引物跨越第23和25外顯子,預(yù)計(jì)擴(kuò)增199 bp。以GAPDH為內(nèi)參。用TRIzol試劑盒(天根公司)提取6月齡香豬和大白豬組織樣品總RNA,取 1 μL檢測RNA濃度;采用Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Promega公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)體系為10 μL:2 μL總RNA,1 μL Random primer(50 μmol·L-1),1 μL dNTPs(10 nmmol·L-1),6 μL RNase-free H2O。qPCR反應(yīng)體系為20 μL:SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μL,定量引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7 μL。每種組織或基因型設(shè)置3個生物學(xué)樣本重復(fù),且每個樣本進(jìn)行3個技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 兩個豬群結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189基因分型

以香豬和大白豬的基因組DNA為模板,以特異性引物PCR-MAP3K4 F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1),檢測得到兩種條帶,分別是552 bp和363 bp,兩者相差189 bp,結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189處于第15內(nèi)含子中(圖2)。所獲序列與Ssrofa11.1豬參考基因序列進(jìn)行比對,552 bp序列與MAP3K4參考序列(NC_010443.5∶6912498-6913049)的相似性為100%,363 bp片段為552 bp片段缺失了SV區(qū)域后的片段;SV區(qū)域位于Chr15: 6912533-6912721(NC_010443.5),長度189 bp。與參考基因序列一樣的擴(kuò)增片段(552 bp)定義為I等位基因,將缺失了189 bp的短片段(363 bp)定義為D等位基因。本文建立的結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189的PCR檢測方法,可以區(qū)分SV的不同基因型。

M. DL2000 DNA Marker;泳道1. II型;泳道2～6. DD型;泳道7. ID型M. DL2000 DNA Marker. Lane 1. Genotype II. Lanes 2-6. Genotype DD. Lane 7. Genotype ID 圖1 結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189的基因分型Fig.1 Genotyping of the structural variation MAP3K4-I15-sv189

A.SV位置示意圖;B.MAP3K4-I15-sv189堿基序列A.Diagram of SV; B.Sequence of structural variant MAP3K4-I15-sv189圖2 結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189在MAP3K4基因中的位置Fig.2 Position of structural variant MAP3K4-I15-sv189 in the MAP3K4 gene

2.2 豬群中結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189的頻率分析

采用建立的結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189檢測方法,檢測香豬和大白豬2個豬群中MAP3K4-I15-sv189的分布。香豬群體中檢測出兩種基因型(DD和ID),且DD型頻率遠(yuǎn)高于ID型。大白豬群體中檢測出3種基因型,以DD型為主。比較兩個豬群間的等位基因頻率(表3),香豬D等位基因頻率顯著高于大白豬相應(yīng)值(P<0.05)。

表3 兩個豬品種MAP3K4-I15-sv189位點(diǎn)基因頻率比較Table 3 Comparison of gene frequencies at the MAP3K4-I15-sv189 locus in two pig breed populations

2.3 生物信息學(xué)分析

采用RegRNA2.0預(yù)測結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189區(qū)域中的功能元件,以MAP3K4-I15-sv189的第一個堿基為1進(jìn)行功能元件的定位(表4)。從結(jié)構(gòu)變異中檢測出10個內(nèi)含子剪切增強(qiáng)子(intron splicing enhancer,ISE)、1個miRNA結(jié)合位點(diǎn)(ssc-miR-342);用Repeat Masker進(jìn)行分析,得出MAP3K4-I15-sv189含有2個簡單重復(fù)元件(simple sequence repeats ,SSR)。缺失型結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189將導(dǎo)致這些功能元件的丟失。

表4 SV區(qū)域功能元件預(yù)測分析Table 4 Prediction of functional elements in SV region

2.4 RT-qPCR檢測方法的建立

RT-qPCR產(chǎn)物經(jīng)測序,與NCBI上目的基因的相似性為96%,確認(rèn)為MAP3K4基因。以內(nèi)參和目的基因重組質(zhì)粒的5個10倍稀釋梯度為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測,內(nèi)參基因與目的基因的擴(kuò)增效率相近,均在100%±10%范圍內(nèi)(圖3),由此建立了MAP3K4表達(dá)量的RT-qPCR檢測方法。

圖3 GAPDH基因(A)和MAP3K4基因(B)擴(kuò)增效率Fig.3 Amplification efficiency of GAPDH (A) and MAP3K4 genes (B)

2.5 香豬各組織中MAP3K4基因的表達(dá)量分析

采用RT-qPCR方法檢測香豬DD型MAP3K4基因的組織表達(dá)譜(圖4),肺和腦組織中的表達(dá)量最高,子宮、脾、腎、心、卵巢中有少量表達(dá),骨骼肌中幾乎不表達(dá)。

圖4 香豬MAP3K4基因組織表達(dá)譜Fig.4 Tissue expression profiles of MAP3K4 gene in Xiang pigs

2.6 不同基因型肺中MAP3K4的表達(dá)

選取大白豬II型、香豬ID型和DD型肺組織(香豬沒有II型),提取總RNA,應(yīng)用建立的MAP3K4 RT-qPCR方法檢測基因的表達(dá)量。得出3種基因型的表達(dá)量呈現(xiàn)從高到低的規(guī)律性變化:DD型>ID型>II型(圖5)。

*. P<0.05;**. P<0.01圖5 肺組織中MAP3K4三種基因型表達(dá)量比較Fig.5 Comparison of the expression levels of MAP3K4 in lung with three genotypes

3 討 論

基于本實(shí)驗(yàn)室前期對香豬全基因組重測序數(shù)據(jù),在MAP3K4基因第15內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)一個長度為189 bp的結(jié)構(gòu)變異(MAP3K4-I15-sv189),經(jīng)群體檢測,證實(shí)該結(jié)構(gòu)變異在豬群中真實(shí)存在,且在不同豬群中表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。在基因型上,香豬群體中檢測到DD和ID兩種基因型,且以純合缺失型為主。大白豬有3種基因型(DD、ID和II);在等位基因頻率方面,香豬的D等位基因顯著高于大白豬。組織表達(dá)譜檢測顯示,香豬肺和腦中MAP3K4的表達(dá)量較高。選擇攜帶3種基因型的肺組織比較MAP3K4基因表達(dá)差異,RT-qPCR檢測證實(shí),DD型的表達(dá)量顯著高于ID型和II型。對結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189中的功能元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),結(jié)構(gòu)變異區(qū)域含有10個內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子(ISE)、1個miRNA結(jié)合位點(diǎn)和2個簡單重復(fù)元件(SSR)。

提示結(jié)構(gòu)變異缺失型個體MAP3K4基因的表達(dá)量增加,可能與結(jié)構(gòu)變異中所含特殊元件有關(guān)。miRNA是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要方式之一,廣泛存在于動植物和病毒體內(nèi),miRNA與成熟mRNA結(jié)合可以使mRNA裂解或者阻礙下一步的翻譯過程[14-15]。蛋白激酶 Cα(protein kinase C alpha,PRKCA)基因的第15內(nèi)含子中有一個miR-634結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)是由特異性的啟動子控制由聚合酶Ⅲ催化獨(dú)立轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可降低PRKCA基因的轉(zhuǎn)錄水平[16];MAP2K4內(nèi)含子中miRNA-744結(jié)合位點(diǎn)可通過同時靶向β-連環(huán)蛋白和MAPK信號通路來阻礙MAP2K4的功能,從而減輕MAP2K4的促遷移作用[17];miR-342-3p 可下調(diào)前梯度蛋白2(anterior gradient protein 2,AGR2)基因,抑制非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細(xì)胞增殖和遷移[18]。推測MAP3K4-I15-sv189中的miR-342結(jié)合位點(diǎn)可能以相似的方式影響MAP3K4基因的翻譯效率。此外,大量研究表明,內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子能結(jié)合反式作用因子,調(diào)節(jié)剪接體選擇性使用剪接位點(diǎn)的能力[19],影響內(nèi)含子的剪切速度[20]。推測處于內(nèi)含子中的結(jié)構(gòu)變異可能通過其中的剪切增強(qiáng)子改變MAP3K4基因轉(zhuǎn)錄后的加工效率。同時,簡單重復(fù)元件(SSR)以微衛(wèi)星形式存在于基因組中,長25 bp[21],內(nèi)含子中的SSR可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄頻率[22],其序列長度會影響基因的表達(dá)量水平[23-24],過長會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平降低[25]。結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189中含有兩個串聯(lián)的SSRs,長186 bp,幾乎涵蓋整個SV區(qū)域。有研究表明(CA)n序列可影響內(nèi)含子剪切增強(qiáng)子的作用,(CA)n序列優(yōu)先結(jié)合反式作用因子,從而影響剪切效率[26],例如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptors,EGFR)基因的轉(zhuǎn)錄過程因21個連續(xù)的(CA)而受到抑制[27];將肺表面活性蛋白B(surfactant protein B,SP-B)基因內(nèi)含子4中的17個連續(xù)(CA)敲除,SP-BRNA前體的剪切效率顯著上升[28]。結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189的每個SSR序列中含有多個(GT)重復(fù),其互補(bǔ)鏈則為多個(CA)重復(fù),最多之處有連續(xù)11個(CA)重復(fù)。推測可能是該SV序列中連續(xù)出現(xiàn)的(CA)序列,起到了剪切抑制因子的作用,并拮抗內(nèi)含子增強(qiáng)子的效應(yīng),從而降低MAP3K4基因的轉(zhuǎn)錄水平,DD型肺組織中MAP3K4基因缺乏結(jié)構(gòu)變異,不受CA重復(fù)及miRNA的干擾作用,從而表達(dá)量較高。由此推測,這兩個SSR可能是阻礙MAP3K4基因轉(zhuǎn)錄的因素之一。

組織表達(dá)譜顯示,MAP3K4基因在腦和肺組織中高表達(dá)。MAP3K4基因中含有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP),是中國東北漢族人群精神分裂癥的易感基因位點(diǎn)[29],推測可能與腦中MAP3K4基因的異常表達(dá)有關(guān)。目前MAP3K4基因與豬腦部疾病間的關(guān)系尚不清楚。有研究表明,MAP3K4基因所屬p38 MAPK信號通路活性在膿毒性肺損傷中升高,p38 MAPK通路受抑制可消除肺部的白細(xì)胞浸潤和肺水腫[30];發(fā)生急性肺損傷和支原體肺炎時,p38 MAPK/核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路被激活,兩者調(diào)控的多種炎癥因子水平顯著上升,如白細(xì)胞介素12 (interleukin-12,IL-12)、IL-13和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α);敲除鞘氨醇1磷酸酯受體3(sphingosine 1 phosphate receptor 3,S1PR3)基因、加入脂氧素受體激動劑BML-111(Methyl (5 S,6R)-5,6,7-trihydroxyheptanoate)或應(yīng)用解毒清肺劑來抑制MAPK信號通路的活性,則可減輕肺部炎癥[31-33];黨參防治急性肺損傷的靶基因主要參與MAPK級聯(lián)活化密切相關(guān)通路、膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合和ATP結(jié)合等生物功能[34]。這些研究結(jié)果表明MAPK信號通路的激活與肺部炎癥正相關(guān)。香豬MAP3K4基因以DD型為主,同時DD型肺組織MAP3K4基因的表達(dá)量最高,已知香豬易發(fā)生肺部疾病[35-36],推測MAP3K4基因中結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189的有無與香豬肺部疾病易感有關(guān)。

4 結(jié) 論

豬群中結(jié)構(gòu)變異MAP3K4-I15-sv189具有多態(tài)性,香豬群體以DD型為主,且DD型肺組織的MAP3K4高表達(dá),表明該結(jié)構(gòu)變異的缺失導(dǎo)致MAP3K4基因表達(dá)量上升,可能是香豬肺部疾病易感的原因之一。