任秀娟,康德措,蘇少鋒,藺雅楠,李雅靜,杜 明,白東義,李 蓓,趙一萍*,芒 來*

(1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院/馬屬動物研究中心,呼和浩特 010018;2.青海省種羊繁育推廣服務中心,海北藏族自治州 812300;3.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院,呼和浩特 010031)

蒙古馬(Equusmongolianhorse)起源于蒙古草原,被人類馴化后,除定向培育類群外,大部分屬于未經人工選育的原始品種。內蒙古草原的氣候特點是寒冷、干旱和風大,并受沙塵暴影響嚴重(http://nmg.weather.com.cn/)。蒙古馬采取野外散養(yǎng)或半圈養(yǎng)的飼養(yǎng)管理方式。蒙古馬已很好地適應了當?shù)貝毫拥纳姝h(huán)境和粗放的飼養(yǎng)管理方式。純血馬(E.thoroughbred)是為了適應短距離比賽的需求,以速度性狀為選育目標,經歷300多年的閉鎖繁育而形成的品種,其血統(tǒng)來源可追溯到3個父系。通常,近親繁殖會導致嚴重的近交衰退,即純合的有害隱性(或部分隱性)突變會導致個體的適應性降低[1]。如肝配蛋白A5 (ephrin A5,EFNA5)基因遺傳區(qū)域單倍型的純合狀態(tài),是賽馬肌肉、骨骼災難性損傷常見原因之一[2]。純血馬對飼養(yǎng)管理的要求非常嚴格。因此,蒙古馬和純血馬已適應了不同的飼養(yǎng)管理、生存環(huán)境條件和人工選擇壓力。

馬在適應特定環(huán)境和選擇壓力時,生理機能會發(fā)生相應的改變,但是其分子機制尚不完善。免疫系統(tǒng)在適應特定環(huán)境、灰塵暴露和運動等外界壓力時發(fā)揮關鍵作用。例如,晉江馬(E.jinjianghorse)對中國東南沿海地區(qū)高溫和潮濕環(huán)境有很強的適應性,其可能的分子機制是熱休克70kDa蛋白1A(heat shock 70kDa protein 1A,HSPA1A)基因拷貝數(shù)增加[3]。雅庫特馬(E.yakutianhorse)對北極極端寒冷氣候有很強的適應性,這可能與其大量寒冷適應性候選基因的順式調控區(qū)域受到正選擇有關[4]。研究表明,粉塵暴露的馬容易感染炎癥性氣道疾病,患病馬對吸入性抗原會發(fā)生免疫反應,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin 1 beta,IL-1β)和白細胞介素23亞單位α(interleukin 23 subunit alpha,IL-23)基因的mRNA水平顯著升高[5]。運動對機體免疫功能具有雙重影響。長期保持科學的運動可改善機體的免疫功能,降低上呼吸道感染等炎癥性疾病的發(fā)生[6-7]。例如,與濟州馬(E.jejuhorse)相比,純血馬對運動應激的生理反應更不敏感[8]。另外,短暫的高強度運動、長時間的力竭運動和過度訓練會導致肌肉痙攣并伴隨肌纖維損傷,使機體發(fā)生炎癥等免疫反應[9-10]。運動馬常見傷病的病因大部分與運動負荷有關,例如屈腱炎、急/慢性關節(jié)炎和韌帶炎等[11]。

NF-κB信號通路在機體抵抗病原體等免疫反應過程中發(fā)揮積極作用,參與固有免疫應答和適應性免疫應答[12]。在病原微生物感染或其誘導的炎癥因子刺激下,核因子κB抑制因子α(NFκB inhibitor alpha, NFKBIA)等抑制蛋白被泛素化并降解,核因子κB亞基p50 (nuclear factor kappa B subunit 1,NF-κBp50)/核因子κB亞基p65 (RELA proto-oncogene NF-kB subunit,NF-κBp65)異源二聚體解離并釋放進入細胞核,啟動細胞因子IL-1β、C-X-C基序趨化因子配體8(C-X-C motif chemokine ligand 8,IL-8)和TNF-α等靶基因轉錄[12-13]。研究表明,因蚊蟲叮咬感染西尼羅河病毒(WestNilevirus)的馬,其外周血單核細胞的NF-κB、IL-1β和IL-8基因表達量升高[14]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等有害物質的過度暴露會觸發(fā)肝臟NF-κB激活,導致TNF-α、IL-1β和IL-8炎癥因子的釋放[15-16]。給母馬宮頸內接種鏈球菌(Streptococcusssp.)后,母體和胎兒脾臟IL-1β基因的表達升高[17]。

蒙古馬具有抗病力強和環(huán)境適應性強等特點。純血馬是以運動性能定向選育形成的品種,適應舍飼且飼草料充足的飼養(yǎng)管理環(huán)境。蒙古馬和純血馬在不同的環(huán)境及人工選擇壓力下,其免疫基因調控網絡是否存在品種間多樣性尚未可知。本研究對蒙古馬和純血馬的血液進行RNA-Seq和表達譜比較分析。根據表達譜結果,對NF-κB信號通路7個基因在2個品種馬肝臟、脾臟、肺臟和血液中的表達進行qRT-PCR分析。在轉錄組水平評價了蒙古馬和純血馬的免疫功能,以探索其機體免疫性能多樣性的可能分子機制。為蒙古馬免疫性能深入研究和抗病育種工作的開展提供理論基礎和數(shù)據依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究的試驗動物包括3匹雌性蒙古馬(E.mongolianhorse) (編號: MH1、MH2和MH3)和3匹雌性純血馬(E.thoroughbred) (編號: TH1、TH2和TH3)。樣品來自于內蒙古自治區(qū)包頭市,蒙古馬為野外自由放養(yǎng),純血馬為舍飼喂養(yǎng)的退役比賽用馬。試驗動物健康狀況良好,平均年齡為(5.67±1.53)歲[18]。樣品采集時間是10月份,確保所有動物日常攝入營養(yǎng)充足和食物結構(以干草為食)相似。采集頸靜脈血液并保存于-80 ℃冰箱,從全血中提取RNA,采用Illumina NextSeq 500進行測序。

用于NF-κB信號通路分析的試驗動物包括3匹蒙古馬(樣品來自于內蒙古自治區(qū)包頭市,為野外自由放養(yǎng))和3匹純血馬(樣品來自于內蒙古自治區(qū)包頭市,為舍飼喂養(yǎng))。試驗馬均為健康狀況良好,年齡為2歲左右。脾臟、肝臟和肺臟樣品的采集方法是屠宰采集,樣品采集時間是10月份,所有樣品保存于-80 ℃冰箱。

1.2 數(shù)據質控

對下機數(shù)據進行質控,符合以下任何一個標準的reads則被過濾:1) 包含5個以上adapter堿基污染的reads;2) 50%以上的堿基Q≤19的reads;3) 5%以上堿基是N的reads。根據上述標準,如果任何一個read被過濾,與其配對的另一條read也被舍棄。

1.3 差異表達分析

以純血馬基因組(Equcab3.0, ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/002/863/925/GCF_002 863 925.1_EquCab3.0)為參考,使用HISAT2(version 2.0.5)軟件[19]將質控后的reads比對到參考基因組。使用HTSeq (version 0.6.0)軟件進行表達量分析[20]。使用DESeq2軟件進行差異表達分析[21]?；虿町惐磉_顯著的標準是:q<0.05且|log2(Fold Change)|≥1。

為了驗證RNA-Seq結果的可靠性,隨機選取10個基因:干擾素誘導的四肽重復蛋白3 (interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3,IFIT3)、干擾素誘導的四肽重復蛋白5 (interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5)、2′-5′-寡腺苷酸合成酶(2′-5′-oligoadenylate synthetase-like,OASL)、腫瘤壞死因子超家族成員10(TNF superfamily member 10,TNFSF10)、T、B淋巴細胞弱化因子(B and T lymphocyte associated,BTLA)、Fos原癌基因AP-1轉錄因子亞單位 (Fos proto-oncogene AP-1 transcription factor subunit,FOS)、腫瘤壞死因子受體超家族成員1B(TNF receptor superfamily member 1B,TNFRSF1B)、C-C基序趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5,CCL5)、REL原癌基因,NF-kB亞單位(REL proto-oncogene, NF-kB subunit,REL)和NF-κBp65進行qRT-PCR驗證。使用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Blast2GO軟件對差異表達基因進行GO富集分析,顯著富集的閾值為FDR<0.05。使用KEGG的KAAS進行KEGG注釋,對KEGG中每個Pathway應用超幾何檢驗進行富集分析,Pathway顯著富集的閾值為FDR<0.05。

表1 用于評估RNA-Seq穩(wěn)定性的qRT-PCR引物信息Table 1 Primers information for qRT-PCR to assess steady-state RNA-Seq

1.4 熒光定量PCR

以馬β-actin為內參基因,以NF-κB信號通路7個基因NF-κBp65、NF-κBp50、NFKBIA、IL-1β、TNF-α、IL-8和前列素內環(huán)氧化物合成酶2 (prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)為目的基因。使用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計(表2),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用Trizol提取總RNA,使用酶標儀檢測總RNA的純度和濃度,OD值在1.8～2.0之間且濃度較高的總RNA用于后續(xù)試驗。根據PrimeScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒(TaKaRa,中國)說明書進行反轉錄,合成cDNA。qRT-PCR反應體系根據TB Green?Premix ExTaqTMII定量試劑盒(TaKaRa,中國)說明書配制,共25 μL:TB Green Premix ExTaqTMII 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性1 min,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,40個循環(huán)。為減少試驗過程中產生的誤差,每個樣品進行3次重復。采用2-ΔΔCt定量分析方法進行表達量分析。采用GraphPad Prism 6軟件進行t-test檢驗,差異顯著值為P<0.05,差異極顯著值為P<0.01。

表2 引物信息Table 2 Primers information

1.5 免疫印跡分析

采用常規(guī)方法提取總蛋白。分別稱取50 mg蒙古馬與純血馬肺臟組織,立即放入液氮預冷的研缽中進行研磨,期間不斷加入液氮。研磨至粉末狀態(tài)后移入1.5 mL離心管,并加入500 μL裂解液,電動勻漿器勻漿1 min,劇烈震蕩2 min,冰上孵育20 min后,超聲處理3 min,4 ℃ 13 000 r·min-1離心20 min。取上清液,儲存在-20 ℃冰箱備用。采用二辛可寧酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒(Cwbiotech,中國)檢測蛋白濃度。然后通過制膠、蛋白變性、凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、成像和灰度分析等步驟對目的蛋白表達量進行分析。用0.45 pm孔徑的PVDF膜,通過濕轉法進行凝膠轉膜。免疫印跡中使用的一級抗體是兔多克隆NF-κB p65抗體(Abcam,英國)、山羊多克隆IL-1β抗體(Abcam,英國)和小鼠單克隆β-actin抗體(ZSGB-BIO,中國)。二級抗體是羊抗兔IgG抗體、兔抗羊IgG抗體、羊抗鼠IgG抗體(Jackson,美國)。采用GraphPad Prism 6軟件進行t-test檢驗,差異顯著值為P<0.05,差異極顯著值為P<0.01。

2 結 果

2.1 馬血液轉錄組測序

為了比較和分析蒙古馬和純血馬在適應不同生存環(huán)境過程中mRNA表達譜的整體情況,本研究對3匹蒙古馬(編號:MH1、MH2、MH3)和3匹純血馬(編號:TH1、TH2、TH3)的血液樣品構建了6個cDNA文庫,使用Illumina平臺進行轉錄組測序。每個樣本平均產生24.92 Gb下機數(shù)據。質量控制后,共獲得19.69～23.95 Gb的高質量數(shù)據,Q30≥95%(表3)。以純血馬基因組為參考,每個文庫高質量數(shù)據的比對率達98%(表3)。組裝后,共獲得17 026個已注釋的蛋白質編碼基因,用于后續(xù)分析。

表3 各樣本高質量測序數(shù)據統(tǒng)計Table 3 Summary of high-quality reads obtained for each sample

2.2 馬血液mRNA差異表達分析結果

蒙古馬與純血馬相比,共獲得1 199個差異表達的mRNA,在蒙古馬中460個表達上調和739個表達下調(圖1A)。對這些差異表達的基因進行聚類分析,如圖1B所示,明顯的分為蒙古馬和純血馬2個表達模式聚類,這反映了試驗樣本的生物學可重復性。由圖1C可知,隨機選取10個基因(IFIT3、IFIT5、OASL、TNFSF10、BTLA、FOS、TNFRSF1B、CCL5、REL和NF-κBp65)的qRT-PCR結果與RNA-Seq的表達趨勢一致,表明RNA-Seq數(shù)據是可靠的。差異表達基因功能分析發(fā)現(xiàn),大部分和機體免疫功能相關,包括主要組織相容性復合物Ⅰ類基因(Major Histocompatibility complex class I genes,MHCⅠ ),如MHC I級重鏈(MHC class I heavy chain,MHCX1)和 MHC I級重鏈 (MHC class I heavy chain,EQMHCB2)、主要組織相容性復合物Ⅱ類基因(Major Histocompatibility complex class Ⅱ genes,MHCⅡ),如MHC II類DRα鏈 (MHC class II DR alpha chain,DRA) 和 MHC II類DQβ鏈(MHC class II DQ-beta chain,DQB);促炎性細胞因子,如IL-1β和IL-8;促炎性趨化因子,如趨化因子C-C基序配體3 (chemokine C-C motif ligand 3,CCL3)和CCL5;干擾素刺激基因IFIT家族,如IFIT3和IFIT5;轉錄因子,如REL和Jun原癌基因AP-1轉錄因子亞單位(Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit,JUN)和免疫蛋白基因,如烏頭酸脫羧酶1(aconitate decarboxylase 1,ACOD1)。

圖1 蒙古馬和純血馬基因表達量比較Fig.1 The comparison of gene expression between Mongolian horse and Thoroughbred

2.3 差異表達基因GO富集分析

對差異表達基因進行GO富集分析。結果顯示221個GO條目被顯著富集(FDR<0.05),其中生物學過程(biological process, BP)的186個條目,分子功能(molecular function, MF)的15個條目和細胞成分(cell component, CC)的20個條目被顯著富集。

許多顯著富集的GO條目直接和免疫反應過程相關(圖2),例如免疫反應(immune response)、固有免疫反應(innate immune response)、抗原加工和提呈(antigen processing and presentation)和toll樣受體4信號通路負調控(negative regulation of toll-like receptor 4 signaling pathway);炎癥反應相關過程,例如炎癥反應(inflammatory response)、急性炎癥反應(acute inflammatory response)、炎癥反應的調節(jié)(regulation of inflammatory response)和炎癥反應的負調節(jié)(negative regulation of inflammatory response);和抗細菌感染反應相關過程,例如對細菌的反應(response to bacterium)、對細菌來源分子的反應(response to molecule of bacterial origin)、對LPS的反應(response to lipopolysaccharide)和細胞對細菌來源分子的反應(cellular response to molecule of bacterial origin)。

圖2 差異表達基因GO富集Fig.2 GO enrichment of differentially expressed genes

2.4 差異表達基因KEGG富集分析

KEGG富集分析結果顯示,差異表達的mRNA共顯著富集到8個KEGG通路(圖3),這些通路均與機體免疫過程相關,包括細胞因子和細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、趨化因子信號通路(chemokine signaling pathway)、I型糖尿病(type I diabetes mellitus)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)和造血細胞譜系(hematopoietic cell lineage)。

圖3 差異表達基因的KEGG富集Fig.3 KEGG enrichment of differentially expressed genes

2.5 免疫組織NF-κB信號通路相關基因的表達研究

NF-κB信號通路在免疫過程中具有至關重要的作用。為了評估NF-κB信號通路相關基因在免疫組織(血液、脾臟、肝臟和肺臟)中的表達多樣性,以β-actin為內參基因,使用qRT-PCR比較NF-κBp65、NF-κBp50、NFKBIA、IL-1β、TNF-α、IL-8和PTGS2基因在蒙古馬和純血馬品種之間的表達多樣性。

NF-κB 信號通路7個基因在蒙古馬和純血馬的4個免疫組織中均表達。IL-1β、IL-8、NFKBIA和PTGS2基因在蒙古馬血液中的表達顯著低于純血馬 (P<0.05),NF-κBp65、NF-κBp50和TNF-α基因在蒙古馬和純血馬血液中的表達差異不顯著(P≥0.05),這些基因在血液中的qRT-PCR結果和RNA-Seq的趨勢一致(圖4A)。7個基因在蒙古馬肺臟中的表達均高于純血馬,除TNF-α差異不顯著(P≥0.05),其余基因均差異顯著(P<0.05)(圖4D)。血液、脾臟和肝臟中,NF-κBp50和NF-κBp65基因品種之間的表達差異不顯著(P≥0.05);IL-1β、IL-8、NFKBIA、PTGS2和TNF-α基因在品種之間的表達差異情況存在組織多樣性(圖4A,4B,4C)。

**.P<0.01,*. P<0.05。下同**.P<0.01,*. P<0.05. The same as below圖4 血液(A)、脾臟(B)、肝臟(C)和肺臟(D)NF-κB信號通路相關基因的表達量Fig.4 mRNA expression of NF-κB pathway-related genes in blood (A), spleen (B), liver (C), and lung (D)

2.6 肺臟組織NF-κB通路相關基因蛋白水平表達分析

與純血馬相比,蒙古馬不易患炎癥性肺病。上述研究結果表明,NF-κB通路似乎影響蒙古馬和純血馬肺部炎癥易感性差異。以β-actin作為內參,開展Western blot試驗進一步分析NF-κB信號通路關鍵基因NF-κB p65和下游基因IL-1β在肺臟中的蛋白相對表達量。如圖5所示,蒙古馬肺臟中NF-κB p65蛋白和IL-1β蛋白的表達量均高于純血馬(P<0.05)。

圖5 蒙古馬和純血馬肺臟組織中NF-κB p65和IL-1β蛋白表達Fig.5 Expression of NF-κB p65 and IL-1β proteins in lung of Mongolian horse and Thoroughbred

3 討 論

研究表明,基因表達存在品種間差異[22-23]。蒙古馬和純血馬血液轉錄組比較分析共發(fā)現(xiàn)了1 199個差異表達基因。隨機選擇10個差異表達基因進行qRT-PCR驗證,結果顯示和RNA-Seq趨勢一致,說明RNA-Seq獲得的差異基因數(shù)據可信。對差異表達基因進行聚類分析,結果顯示明顯聚為蒙古馬和純血馬2個類,說明本研究試驗樣本的生物學可重復性。

動物的不同屬、品種和個體之間存在抗病力的遺傳差異[24]。血液的免疫功能主要是吞噬和分解外來病原體、自我衰老及死亡細胞和抵抗炎癥。蒙古馬和純血馬血液差異表達基因許多顯著富集的通路在機體免疫過程中發(fā)揮關鍵作用,例如免疫反應途徑、固有免疫反應途徑和抗原加工和提呈途徑。免疫反應是機體對異己成分做出的防御反應,包括固有免疫反應和適應性免疫反應。固有免疫反應是種系演化過程中形成的天然免疫防御功能,在機體受到病原體刺激后,主要通過特殊的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別病原體相關的分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)而識別入侵的病原體,后通過誘導炎性因子的分泌,抑制或清除病原菌[25]。核苷酸結合寡聚結構域1(nucleotide binding oligomerization domain 1, NOD1)是哺乳動物固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,是病原體和組織損傷產生的內源性分子的細胞內受體,被激活后通過信號轉導途徑介導各種效應器功能,發(fā)揮多種免疫調節(jié)作用和維持組織免疫穩(wěn)態(tài),當失調時會導致炎癥性疾病[26]。ACOD1是重要的調控因子,在固有免疫和適應性免疫中發(fā)揮重要作用[27]。宿主細胞在感染病原體(如細菌和病毒)或受到病原體相關模式分子(如LPS)或細胞因子(如TNF和干擾素類,interferons, IFNs)刺激時,ACOD1基因高表達,進而參與機體應對細菌和病毒感染的免疫應答[28]?？乖庸ず吞岢释緩降闹饕δ苁菍碜园麧{蛋白(自身和外來)的肽抗原加工并于細胞表面提呈給限制性T淋巴細胞,啟動適應性免疫應答[29]。MHC I類分子(如MHCX1和EQMHCB2)主要與病毒蛋白等內源性肽抗原結合,激活CD8+ T細胞,使其轉化為致敏細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL),發(fā)揮細胞毒作用殺傷靶細胞[30]。MHC II類分子(如DRA和DQB)主要與致病菌等外源性肽抗原結合,激活CD4+ T細胞,使其表達相應的淋巴因子,啟動體液免疫,保護機體免受感染[31]。

血液中的白細胞、淋巴細胞、抗體等免疫細胞和免疫分子對病原微生物的入侵具有免疫作用。蒙古馬和純血馬差異表達基因顯著富集到抗細菌感染免疫反應過程,包括對細菌的反應、對細菌來源分子的反應、對LPS的反應、細胞對細菌來源分子的反應和toll樣受體4信號通路負調控和趨化因子信號通路。Blanco等[32]對感染分枝桿菌(Mycobacterium)的牛(Bostaurus)外周血單核細胞進行表達譜分析,共獲得172個和機體免疫炎癥、細胞凋亡等過程相關的差異表達基因,并檢測到分枝桿菌感染使CD14分子(CD14 molecule,CD14)、白細胞介素1受體 (interleukin 1 receptor type 1,IL-1R)、血小板凝血酶蛋白1 (thrombospondin 1,THBS1)和基質金屬蛋白酶9 (matrix metallopeptidase 9,MMP9)等免疫基因在牛單核細胞中表達下調。LPS誘導仔豬(Susscrofa)外周血單核細胞, IL-1β和TNF-α炎癥因子以及NF-κB p65 蛋白濃度顯著上調(P<0.05)[33]。對瓦灰鴿(Columbidae)腹腔注射LPS后TNF-α表達上調,NF-κB信號通路激活[34]。趨化因子主要功能是募集白細胞在感染局部發(fā)揮抗感染作用和誘導局部炎癥反應。例如,CCL5的主要功能是定向趨化和激活T 淋巴細胞和NK細胞[35],C-X-C基序趨化因子配體10 (C-X-C motif chemokine ligand 10, CXCL10)的主要功能是炎癥趨化作用[36]。研究表明,剛地弓形蟲癥患者血液中CCL5 和 CXCL10 水平明顯高于健康人群[37]。

蒙古馬和純血馬血液差異表達基因還顯著富集到了炎癥反應相關過程,例如,炎癥反應、急性炎癥反應、炎癥反應的調節(jié)和炎癥反應的負調節(jié)。炎癥反應的本質是機體對各種損傷性刺激的一種防御反應,具有殺滅病原體、限制感染及修復損傷等作用。當病原體入侵機體時,PRRs識別胞內PAMPs激活炎癥反應信號通路,促使炎性因子如IL-1β和C-C基序趨化因子配體20(C-C motif chemokine ligand 20, CCL20)等釋放以調控機體的免疫反應,進而發(fā)揮抗病毒作用[38]。例如,炎性因子IL-1β基因在患有炎癥性氣道疾病的馬匹中高表達[5]。干擾素刺激基因IFIT家族(如,IFIT3和IFIT5)在免疫調節(jié)和抗病毒中發(fā)揮重要作用,是宿主抗病毒免疫分泌的標志性干擾素[39]。對小鼠體內和體外試驗研究表明,IFIT3在抑制狂犬病病毒的復制和降低其致病性方面發(fā)揮重要作用[40]。炎癥反應過程受到其他信號通路的調控,進而調控機體免疫應答的有序進行和維持自身穩(wěn)態(tài),例如,在病毒感染過程中,IFN信號通路與炎癥反應調控網絡中的關鍵分子(如 NF-κB p65)存在一定的交互作用,它們之間的交互調控失衡將會引起過度炎癥反應,導致組織器官的免疫病理性損傷[41]。

NF-κB信號通路中的7個基因在蒙古馬和純血馬4個免疫組織中均表達,但不同組織的品種間差異不同;血液中差異表達的qRT-PCR結果和RNA-Seq的趨勢一致,進一步說明RNA-Seq數(shù)據的可靠性。不同的組織、生理條件、受體類型、激活的信號轉導途徑以及復雜的分子共同參與控制一個基因最終的表達。例如,研究表明IL-1β基因在不同組織中差異表達[42]。Li 等[43]對杜洛克豬不同組織中NF-κB基因的表達研究發(fā)現(xiàn),在肺臟、脾臟、肝臟和小腸等免疫組織中相對高表達。NF-κBp50/NF-κBp65是NF-κB信號通路的核心基因,靜息狀態(tài)時,NF-κB p50/NF-κB p65異源二聚體與抑制蛋白結合定位于細胞質內,當抑制蛋白被降解,異源二聚體活化并釋放進入細胞核,立即啟動多種細胞因子基因(IL-1β和IL-8)的轉錄[13]。NF-κB p50與 NF-κB p65形成異源二聚體,故二者的表達趨勢一致。本研究中,蒙古馬肺臟NF-κBp50與NF-κBp65的表達量高于純血馬,蒙古馬血液、脾臟和肝臟中NF-κBp50與NF-κBp65的表達量和純血馬之間無顯著性差異。

NF-κB信號通路的7個基因在蒙古馬肺臟中的表達量均高于純血馬,除TNF-α基因差異不顯著外,其余基因均具有生物學統(tǒng)計意義。NF-κB p65蛋白和IL-1β蛋白在蒙古馬肺臟中的表達也高于純血馬。這說明NF-κB信號通路在蒙古馬肺臟的活性高于純血馬。Bureau等[44]通過比較健康馬和受肺氣腫影響的馬支氣管細胞中NF-κB活性,發(fā)現(xiàn)患肺氣腫的馬NF-κB活性處于高水平,但是健康馬中NF-κB存在較少。Uhl等[45]發(fā)現(xiàn),馬駒接種馬紅球菌后,細胞核內NF-κB活性增加,同時細胞因子表達也明顯增加。因此,馬匹受到外界刺激后,NF-κB信號通路被激活,NF-κB活性增強,啟動下游細胞因子(如,IL-8、TNF-α和IL-1β)等表達。本研究檢測的NF-κB信號通路7個基因在蒙古馬肺臟中表達量高于純血馬,這可能是由于內蒙古包頭地區(qū)長期風沙較大,在該地區(qū)草原上放牧的蒙古馬為了適應惡劣的風沙環(huán)境所致。本試驗所用蒙古馬均未患有肺部疾病,但肺臟NF-κB信號通路關鍵基因高表達是否起到預警的作用需要后續(xù)研究進一步論證。另外,本研究的結果是通過有限數(shù)量的試驗樣本獲得,而且試驗樣品取樣存在地域的局限性,研究結論的獲得可能存在統(tǒng)計效能的不足。因此,在接下來的工作中,需要在更大樣本量、更廣泛自然棲息地采集樣品和更深入試驗研究開展的基礎上來進一步驗證以上結論。

4 結 論

本研究利用RNA-Seq方法對蒙古馬和純血馬血液的表達譜進行了比較分析。結果表明,大量免疫相關基因在兩個品種馬的血液中差異表達,這可能是因為蒙古馬適應內蒙古特定環(huán)境以及純血馬長期的閉鎖繁育,導致兩個品種的機體免疫功能發(fā)生了適應性變化。qRT-PCR 和 Western blot 方法比較了NF-κB 信號通路相關基因在蒙古馬和純血馬免疫組織中的表達多樣性。結果顯示,7 個基因在蒙古馬肺臟中的表達量均高于純血馬,這可能與蒙古馬適應內蒙古包頭地區(qū)風沙較大的環(huán)境有關。但是,本研究由于試驗樣本量有限和取樣地域局限性的原因,得出以上試驗結論可能存在統(tǒng)計效能的不足。本研究的結果為接下來在更大樣本量、更廣泛自然棲息地等的條件下研究蒙古馬的免疫功能提供了一些信息。