張文濤,劉晨陽(yáng),朱炳霖,柳 麗,田 媛,姚宇航,成 功*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,楊凌 712100;2.國(guó)家肉牛改良中心,楊凌 712100)

肉牛肌內(nèi)脂肪含量與牛肉的風(fēng)味、多汁性和嫩度密切相關(guān)[1-2]。肌內(nèi)脂肪含量是衡量牛肉品質(zhì)等級(jí)的重要指標(biāo)之一[3]。肌內(nèi)脂肪的形成與脂肪細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān),而脂肪細(xì)胞增殖分化的過(guò)程本質(zhì)上是基因表達(dá)模式的改變,受到了一系列轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控[4-5]。然而,目前關(guān)于肉牛脂肪沉積調(diào)控的研究仍處于起步階段,相關(guān)功能基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步挖掘和研究[1,6]。Snail1屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子超家族,它是中胚層形成的關(guān)鍵基因。Snail家族成員編碼轉(zhuǎn)錄抑制子,通過(guò)結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)E-box(CAGGTG)位點(diǎn)參與基因表達(dá)調(diào)控[7-8]。前人研究表明,Snail1在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞干性維持等方面均具有廣泛的生物學(xué)功能[9-12]。此后大量研究也表明,Snail1在癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖過(guò)程同樣發(fā)揮了重要作用[13-14]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),Snail1也參與了脂肪細(xì)胞的分化調(diào)控[15]。Snail1可通過(guò)結(jié)合人脂聯(lián)素(Adiponectin,ADPN)啟動(dòng)子區(qū)E-box元件,進(jìn)而抑制Adiponectin表達(dá)[16]。同時(shí),Snail1可通過(guò)抑制3T3-L1細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CEBP/α)的表達(dá)來(lái)抑制脂肪細(xì)胞分化,染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)等進(jìn)一步證實(shí)了Snail1通過(guò)直接結(jié)合PPARγ啟動(dòng)子區(qū)E-box元件來(lái)抑制PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性[16]。有研究表明,Wnt-GSK3 β信號(hào)通路可通過(guò)磷酸化修飾調(diào)控Snail1的蛋白水平,進(jìn)而參與了細(xì)胞增殖調(diào)控[17-19]。然而,目前關(guān)于Snail1在牛脂肪細(xì)胞增殖和分化中的作用及其靶基因和信號(hào)通路仍未知,有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本試驗(yàn)所用牛前體脂肪細(xì)胞通過(guò)酶消化法從腎周脂肪組織分離,具體方法參考先前文獻(xiàn)[20]。脂肪組織采自西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心秦川肉牛良繁場(chǎng)秦川牛新生牛。

1.2 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Biorad);倒置熒光顯微鏡(Olympus);活細(xì)胞工作站(Biotek);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Biorad);流式細(xì)胞儀(BD);多功能酶標(biāo)儀(TECAN)。

1.3 主要試劑

胎牛血清(FBS, PAN);細(xì)胞周期染色試劑盒(聯(lián)科生物);Cell Counting Kit-8(同仁生物);Cell-LightTMEdU Apollo567 In Vitro Kit(廣州銳博);脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)I液(每100 mL:IBMX 300 μL, 0.5 mmol·L-1; 胰島素1 mL, 2 μmol·L-1; 地塞米松10 μL, 1 μmol·L-1; 羅格列酮7.8 μL, 1 μmol·L-1);脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)II液(每100 mL:胰島素1 mL,2 μmol·L-1);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa);TB Green Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus,TaKaRa);LipofectamineTM3000試劑盒(ThermoFisher)。

1.4 方法

1.4.1 腺病毒包裝及轉(zhuǎn)染Snail1過(guò)表達(dá)腺病毒(Ad-Snail1)及其空載對(duì)照(Ad-NC)由百恩維生物科技有限公司(深圳)包裝完成。腺病毒滴度為1.02×1011PFU·mL-1。腺病毒侵染試驗(yàn)具體參照先前文獻(xiàn)[21]。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù) 培養(yǎng)牛前體脂肪細(xì)胞匯合度達(dá)到40%～50%時(shí),利用Snail1過(guò)表達(dá)腺病毒按照MOI=22 侵染細(xì)胞,每組生物重復(fù)3次。細(xì)胞侵染48 h后,消化并收集細(xì)胞,按照細(xì)胞周期染色試劑盒說(shuō)明書(shū)(聯(lián)科生物)進(jìn)行處理,流式細(xì)胞儀(BD FACSAriaTMIII,BD)上機(jī)對(duì)牛脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.4.3 CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn) 將牛脂肪細(xì)胞接種于48孔板,每孔4 000個(gè)細(xì)胞。分別用Ad-NC、Ad-Snail1處理24、48、72 h后,按照CCK-8說(shuō)明書(shū)(Cell Counting Kit-8,同仁生物)操作,于450 nm處測(cè)定吸光度(Infinite M200PRO,TECAN)。

1.4.4 EDU染色 將牛前脂肪細(xì)胞接種到12孔板培養(yǎng),直到匯合度達(dá)到40%～50%進(jìn)行腺病毒侵染,每組生物學(xué)重復(fù)3次。細(xì)胞侵染48 h后,按照EdU染色試劑盒(Cell-LightTMEdU Apollo567 In Vitro Kit,廣州銳博)進(jìn)行染色,檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.4.5 牛前脂肪細(xì)胞的分化 將牛前脂肪細(xì)胞接種于6孔板中,置于37 ℃下,5% CO2培養(yǎng)箱中(Thermo Fisher)培養(yǎng)至融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行Ad-NC、Ad-Snail1腺病毒侵染。侵染48 h后,細(xì)胞中加入誘導(dǎo)I液進(jìn)行誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)I液處理2 d后,更換誘導(dǎo)II液進(jìn)行分化維持,之后每2 d更換一次誘導(dǎo)II液。

1.4.6 油紅O染色 誘導(dǎo)分化第6天的牛脂肪細(xì)胞經(jīng)PBS潤(rùn)洗3次,4%多聚甲醛室溫固定30 min。然后用PBS沖洗3次,1%油紅O工作液避光孵育30 min。之后用PBS多次沖洗細(xì)胞,最后在倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.4.7 甘油三酯測(cè)定 誘導(dǎo)分化第6天的牛脂肪細(xì)胞加入胰酶消化,然后加入等體積10% FBS培養(yǎng)液終止消化,轉(zhuǎn)移至離心管,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入細(xì)胞裂解液,混合后靜置10 min。將180 μL的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中,70 ℃加熱10 min,然后2 000 r·min-1離心5 min取上清,配制標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在96孔板中加入工作液190 μL和10 μL上清樣品,避光37 ℃孵育10～15 min,利用酶標(biāo)儀550 nm波長(zhǎng)進(jìn)行甘油三酯測(cè)定。

1.4.8 RNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR分析 采用Trizol法提取牛脂肪細(xì)胞總RNA,于-80 ℃保存。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR?Primix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.4.9 蛋白質(zhì)印跡 用于增殖和分化檢測(cè)的牛脂肪細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS沖洗3次后加入預(yù)冷的RIPA和蛋白酶抑制劑,冰上孵育15 min以裂解細(xì)胞。裂解的細(xì)胞12 000 r·min-1, 4 ℃,離心10 min,分離取上清液,通過(guò)BCA法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量。在提取的蛋白中加入5×蛋白上樣緩沖液,然后100 ℃煮沸10 min,-80 ℃保存?zhèn)溆?。Western blot試驗(yàn)蛋白上樣量為20 μg。用于Western blot分析的抗體概要信息列于表1。

表1 抗體信息Table 1 Antibody information

1.4.10 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 將牛脂肪細(xì)胞接種于6孔板中,用Ad-NC、Ad-Snail1侵染48 h后進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化。收集分化第6天細(xì)胞并送至廣州基迪奧生物技術(shù)公司進(jìn)行Illumina HiSeq2000 RNA-seq測(cè)序。利用Omicshare生物信息學(xué)云平臺(tái)(https://www.omicshare.com/)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,按照|Fold change|≥1.5、FDR<0.05標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因(DEGs)篩選。利用Omicshare在線工具對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。利用String在線工具和Cytoscape軟件構(gòu)建目標(biāo)基因集的蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。在線工具M(jìn)EME軟件包中FIMO(https://meme-suite.org/meme/tools/fimo)對(duì)牛注釋基因起始上游2 000 bp,下游100 bp進(jìn)行Snail1潛在的E-box結(jié)合位點(diǎn)分析,聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序DEGs篩選Snail1蛋白潛在結(jié)合靶基因。

1.4.11 熒光素酶報(bào)告分析 pFLAG-Snail1過(guò)表達(dá)載體和SFRP2啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告載體pSFRP2-luc+均由北京生工合成并克隆。將HEK293A細(xì)胞接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí),按照LipofectamineTM3000試劑盒(ThermoFisher)操作步驟將pFLAG-Snail1(0、0.25、0.5、1.0 μg)+ pSFRP2-luc+或pbasic-luc+質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù),海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL-TK作為內(nèi)參校正。轉(zhuǎn)染36 h后,通過(guò)酶標(biāo)儀進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)(Dual-Glo Luciferase Assay System,Promega)。

2 結(jié) 果

2.1 Snail1腺病毒侵染及過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)

將Ad-Snail1腺病毒以最佳感染復(fù)數(shù)MOI=22侵染牛前體脂肪細(xì)胞,檢測(cè)其過(guò)表達(dá)效率。通過(guò)對(duì)照組pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組綠色熒光蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn),腺病毒顯著提高了外源基因轉(zhuǎn)染效率(圖1A)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot結(jié)果表明,Ad-Snail1腺病毒能顯著上調(diào)細(xì)胞中Snail1基因的表達(dá)。與對(duì)照組相比,Snail1基因mRNA平均表達(dá)量提高了255.76倍(圖1B,P<0.01),蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯提高(圖1C)。結(jié)果表明,Ad-Snail1腺病毒過(guò)表達(dá)效果良好,可進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

A. pEGFP-N1質(zhì)粒,Ad-NC、Ad-Snail1轉(zhuǎn)染/侵染牛前體脂肪細(xì)胞48 h熒光檢測(cè)(標(biāo)尺:200 μm);B. qRT-PCR檢測(cè)Snail1基因mRNA表達(dá)水平;C. Western blot檢測(cè)Snail1蛋白過(guò)表達(dá)效率。*.P<0.05;**.P<0.01,下同A. Fluorescent detection of pEGFP-N1 plasmid, Ad-NC, and Ad-Snail1 transfection/infection into cattle preadipocytes for 48 hours(bar: 200 μm); B. Detection of Snail1 mRNA level by qRT-PCR; C. Western blot analysis to detect the overexpression efficiency of Snail1 protein. *. P<0.05;**. P<0.01, the same as below圖1 Snail1基因過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)Fig.1 Snail1 gene overexpression efficiency detection

2.2 Snail1抑制牛前脂肪細(xì)胞增殖

CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組(NC)相比,Snail1過(guò)表達(dá)48、72、96 h后,細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05),說(shuō)明Snail1抑制了牛前體脂肪細(xì)胞的增殖過(guò)程(圖2A)。EdU染色結(jié)果顯示,Snail1過(guò)表達(dá)后減少了EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P<0.05), 表明DNA復(fù)制受到抑制(圖2B)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),Snail1過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)了G0/G1細(xì)胞數(shù)量(P<0.05),下調(diào)G2/M期細(xì)胞數(shù)量(P<0.05),S期細(xì)胞呈現(xiàn)一定下降趨勢(shì)。上述結(jié)果表明,Snail1過(guò)表達(dá)引起G1/S期阻滯,抑制細(xì)胞增殖(圖2C)。進(jìn)一步,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot對(duì)增殖相關(guān)標(biāo)志基因與蛋白檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),Snail1過(guò)表達(dá)抑制了細(xì)胞周期相關(guān)基因(CCNB1,CCND2)的mRNA(P<0.05)和蛋白的表達(dá)(圖2D)。綜上所述,這些結(jié)果表明Snail1通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá),使得細(xì)胞G1/S期阻滯,從而抑制前脂肪細(xì)胞的增殖。

A. CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力;B. EdU染色檢測(cè)DNA復(fù)制活性: 陽(yáng)性細(xì)胞EdU染色(紅色),細(xì)胞核Hoechst染色(藍(lán)色)(標(biāo)尺:100 μm);C. 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定牛前體脂肪細(xì)胞細(xì)胞周期;D. Snail1過(guò)表達(dá)48 h后細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)A. Cell viability analysis by CCK-8;B. The activity of DNA replication detection by EdU staining: Positive cells were stained with EdU (Red), nucleus were stained with Hoechst (blue)(bar: 100 μm); C. The percentages of bovine preadipocytes in different cell-cycle phases were determined by flow cytometry;D. Relative expression analysis of cell cycle related genes after 48 hours of Snail1 overexpression treatment圖2 Snail1抑制牛前脂肪細(xì)胞增殖Fig.2 Snail1 inhibited the proliferation of cattle preadipocytes

2.3 Snail1抑制牛前體脂肪細(xì)胞成脂分化及甘油三酯生成

為了探究Snail1對(duì)牛前體脂肪細(xì)胞成脂分化的影響,對(duì)Ad-Snail1侵染并誘導(dǎo)分化第6天的牛脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色和甘油三酯測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Snail1過(guò)表達(dá)抑制了牛脂肪細(xì)胞的成脂分化和甘油三酯的生成 (圖3A,3B)。qRT-PCR和Western blot分析表明,Snail1過(guò)表達(dá)后,PPARγmRNA表達(dá)量下降 (P= 0.06),但蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化;脂肪酸結(jié)合蛋白4 (FABP4) mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05),蛋白水平呈現(xiàn)相同下降趨勢(shì);脂蛋白脂酶 (LPL) mRNA表達(dá)量顯著降低;磷酸肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基3 (PIK3R3) mRNA表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01,圖3C)。上述結(jié)果表明,Snail1過(guò)表達(dá)抑制了牛前體脂肪細(xì)胞成脂分化。

A.油紅O染色結(jié)果(標(biāo)尺:50 μm); B.甘油三酯測(cè)定結(jié)果; C.Snail1基因過(guò)表達(dá)且誘導(dǎo)分化6 d后,細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè);D.蛋白表達(dá)水平檢測(cè)A. Oil Red O staining results(bar: 50 μm); B. Triglyceride content analysis; C. The relative mRNA expression level detection of cell differentiation-related marker genes after overexpression of Snail1 gene and induced differentiaion for 6 days; D. Protein expression level detection圖3 Snail1抑制牛脂肪細(xì)胞成脂分化Fig.3 Snail1 inhibited adipogenic differentiation of cattle adipocytes

2.4 RNA-Seq探究Snail1影響成脂分化潛在作用信號(hào)通路

利用RNA-Seq對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Snail1影響脂肪細(xì)胞分化的潛在作用信號(hào)通路進(jìn)行分析。熱圖結(jié)果顯示,Ad-Snail1、Ad-NC組能明顯分為兩組,表明測(cè)序結(jié)果良好(圖4A)。與對(duì)照組相比較,Snail1基因過(guò)表達(dá)組有791個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào),549個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào) (|Fold change|≥1.5)(圖4B,4C)。KEGG富集分析結(jié)果表明,差異基因主要富集在PPAR、ECM受體互作、PI3K-AKT、MAPK、尼古丁成癮及胰島素分泌等信號(hào)通路(圖4D)。

A.聚類分析;B.差異表達(dá)基因(DEGs)分析;C.差異表達(dá)基因(DEGs)火山圖; D. 差異表達(dá)基因(DEGs)KEGG通路富集分析A. Cluster analysis; B. Differentially expressed gene (DEGs) analysis; C. Volcanic map of differentially expressed genes (DEGs); D. KEGG pathway enrichment analysis of DEGs圖4 RNA-Seq分析Fig.4 RNA-Seq analysis

隨機(jī)挑選RNA-Seq結(jié)果中8個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),通過(guò)qRT-PCR與RNA-Seq差異倍數(shù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),RNA-Seq/qRT-PCR差異倍數(shù)相關(guān)系數(shù)為0.88(P<0.001),結(jié)果表明RNA-Seq測(cè)序結(jié)果可靠(圖5A、5B)。

A. qRT-PCR驗(yàn)證;B. RNA-seq/qRT-PCR差異倍數(shù)相關(guān)性分析A. qRT-PCR verification of RNA-Seq results; B. Correlation analysis of fold changes of RNA-Seq/qRT-PCR圖5 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證Fig.5 Verification of RNA-Seq data

2.5 Snail1作用靶基因的預(yù)測(cè)、篩選及驗(yàn)證

為了獲得Snail1作用關(guān)鍵的潛在靶基因,利用String在線工具對(duì)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的下調(diào)基因(|Fold change|≥2)進(jìn)行蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(圖6)。進(jìn)一步利用Cytoscape mCODE 對(duì)互作網(wǎng)絡(luò)功能模塊進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因富集到了5個(gè)子網(wǎng)絡(luò)集(表2)。

圖6 Snail1 過(guò)表達(dá)后差異基因PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.6 PPI network construction of DEGs after Snail1 overexpression

表2 mCODE篩選子網(wǎng)絡(luò)Table 2 mCODE filtlers subnetworks

利用MEME包中的FIMO工具搜索牛注釋基因啟動(dòng)子區(qū)域(上游2 000 bp,下游100 bp),篩選潛在的結(jié)合靶基因。通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因和RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)合KEGG富集信號(hào)通路篩選發(fā)現(xiàn),Wnt信號(hào)通路拮抗基因SFRP2基因可能是Snail1的潛在靶基因(圖6,表3)。RNA-Seq 數(shù)據(jù)表明,Snail1過(guò)表達(dá)后SFRP2下調(diào)3.3倍,且該基因位于PPI互作網(wǎng)絡(luò)中核心子網(wǎng)絡(luò) 5的Wnt信號(hào)通路中(圖6,表2)。此外,SCD、ATGL等脂肪代謝相關(guān)基因也可能是Snail1的潛在靶基因(表3)。

表3 Snail1靶基因預(yù)測(cè)及表達(dá)相關(guān)性分析Table 3 Prediction of Snail1 target gene and correlation analysis of its expression

進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶試驗(yàn)對(duì)Snail1潛在靶基因SFRP2進(jìn)行驗(yàn)證。JASPAR軟件分析發(fā)現(xiàn),在SFRP2啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Snail1轉(zhuǎn)錄因子的5個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn),其中包含F(xiàn)IMO 軟件預(yù)測(cè)的388～397位置結(jié)合位點(diǎn)(圖7A)。pFLAG-Snail1和pSFRP2-luc+共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞36 h后進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)(pRL-TK為內(nèi)參)。結(jié)果表明,SFRP2啟動(dòng)子活性隨著Snail1表達(dá)質(zhì)粒濃度的升高而被顯著抑制,呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(圖7B)。陰性對(duì)照組pBasic-luc+中熒光素酶含量無(wú)明顯變化(圖7C)。以上結(jié)果表明,SFRP2可能是Snail1直接作用的靶基因。

A. SFRP2啟動(dòng)子中Snail1的潛在結(jié)合位點(diǎn)示意圖;B.熒光素酶檢測(cè)Snail1過(guò)表達(dá)對(duì)pSFRP2-luc+啟動(dòng)子活性的影響;C.陰性對(duì)照pBasic-luc+質(zhì)粒A.Diagram of potential Snail1 binding sites in SFRP2 promoter;B．Luciferase detection of the effect of Snail1 concentration on the activity of SFRP2 promoter;C．pBasic-luc+ plasmid was used as negative control圖7 SFRP2啟動(dòng)子區(qū)Snail1潛在結(jié)合位點(diǎn)和Snail1-SFRP2靶向關(guān)系的驗(yàn)證Fig.7 Verification of potential Snail1 binding sites and Snail1-SFRP2 targeting relationships in SFRP2 promoter region

3 討 論

肉牛的脂肪沉積過(guò)程表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程,其受到了一系列轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),Snail1在成脂分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Snail1通過(guò)結(jié)合并抑制成脂分化關(guān)鍵基因PPARγ的表達(dá),抑制小鼠3T3-L1細(xì)胞的分化。Snail1基因在3T3-F442A細(xì)胞中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致其分化為成熟脂肪細(xì)胞的能力喪失[22]。此外,Snail1可以通過(guò)招募組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)抑制MyoD與其靶基因的結(jié)合,進(jìn)而抑制肌源性分化[23]。上述研究表明,Snail1同時(shí)參與細(xì)胞脂肪生成和成肌細(xì)胞分化的調(diào)控,是影響動(dòng)物脂肪沉積和肌肉發(fā)育的重要候選功能基因。然而,在細(xì)胞增殖方面Snail1的作用仍存在爭(zhēng)議。目前多數(shù)研究表明Snail1促進(jìn)了細(xì)胞的增殖,如Snail1可誘導(dǎo)癌癥中的EMT過(guò)程從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[24];TRIM55可以通過(guò)UPP途徑促進(jìn)Snail1降解,進(jìn)一步的抑制腫瘤的發(fā)展和肺癌細(xì)胞的增殖過(guò)程[25]。然而,也有研究表明Snail1對(duì)于細(xì)胞增殖具有抑制作用,如Snail1通過(guò)直接結(jié)合并抑制成脂基因Fasn表達(dá),進(jìn)而阻斷由胰島素刺激產(chǎn)生的產(chǎn)脂酶表達(dá)來(lái)抑制脂肪生成,同時(shí)抑制肝臟中的脂肪細(xì)胞增殖[26]。本研究發(fā)現(xiàn),Snail1抑制了牛前脂肪細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。RNA-Seq、靶基因預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)等證實(shí),Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵拮抗蛋白基因SRFP2是Snail1的靶基因。Snail1可能通過(guò)靶向SRFP2介導(dǎo)的Wnt/β-catenin參與了脂肪細(xì)胞分化調(diào)控。

細(xì)胞增殖受到了細(xì)胞周期的調(diào)控,主要表現(xiàn)在DNA的復(fù)制及其隨后的細(xì)胞分裂過(guò)程,其又可細(xì)分為4個(gè)不同的階段(G0/G1期、S期、G2期和M期)[27]。本研究發(fā)現(xiàn),Snail1過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)了促增殖相關(guān)基因如CCNB1、CCND2的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。CCNB1是有絲分裂的主要調(diào)節(jié)因子,在調(diào)控周期蛋白依賴激酶1 (CDK1)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,主要通過(guò)與CDK1形成復(fù)合物,磷酸化其底物,促進(jìn)細(xì)胞周期由G2期向有絲分裂期過(guò)渡[28]。CCND2是一種D型細(xì)胞周期蛋白,與CDK4、CDK6結(jié)合參與G1/S檢查點(diǎn)調(diào)控[29-30]。流式細(xì)胞術(shù)顯示,Snail1基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致G1/S期阻滯,G2、M期細(xì)胞比例降低;EdU染色顯示,過(guò)表達(dá)Snail1可顯著降低復(fù)制期EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例;CCK-8結(jié)果也顯示,Snail1過(guò)表達(dá)可降低細(xì)胞增殖速率。上述結(jié)果表明,Snail1基因抑制了牛前脂肪細(xì)胞增殖并導(dǎo)致細(xì)胞周期G1/S期阻滯。

前脂肪細(xì)胞能夠在誘導(dǎo)劑的作用下分化為產(chǎn)生脂滴的成熟脂肪細(xì)胞,脂滴是成熟脂肪細(xì)胞的一個(gè)顯著形態(tài)特征,其在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸積累[31]。本研究發(fā)現(xiàn),Ad-Snail1抑制了脂肪細(xì)胞分化及脂滴的生成。通過(guò)對(duì)RNA-Seq差異基因的KEGG分析顯示,差異基因主要富集在PPAR、ECM受體互作、PI3K-AKT、MAPK、尼古丁成癮及胰島素分泌等信號(hào)通路。PPAR信號(hào)通路是脂肪細(xì)胞分化的明星通路,該通路的下調(diào)會(huì)抑制脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程[32];尼古丁成癮信號(hào)通路參與了脂肪的調(diào)控,尼古丁飼喂的小鼠體重降低并伴隨著脂肪細(xì)胞體積減小[33]。也有研究表明,尼古丁促進(jìn)了上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的形成[34]。本研究RNA-Seq測(cè)序也證實(shí),Snail1過(guò)表達(dá)激活了尼古丁成癮相關(guān)信號(hào)通路基因的表達(dá),而Snail1及尼古丁成癮信號(hào)通路基因均在上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及癌癥的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

為了進(jìn)一步探究Snail1參與脂肪細(xì)胞分化的潛在分子機(jī)制,對(duì)FIMO工具預(yù)測(cè)的靶基因及 RNA-Seq等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),SFRP2、AQP9、Serpine1、SCD、ATGL等為Snail1潛在靶基因。前人研究證實(shí),Snail1可結(jié)合并靶向調(diào)節(jié)甘油三酯脂肪酶基因ATGL[35]。本研究通過(guò)熒光素酶試驗(yàn)表明,Wnt信號(hào)通路拮抗蛋白基因SFRP2是Snail1的潛在靶基因,而Wnt信號(hào)通路在PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中被顯著富集。Wnt/β-catenin屬于經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路,主要由Wnt家族蛋白、糖原合成激酶3(GSK3)、軸突蛋白(Axin)、β-catenin和TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子組成。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活抑制了GSK3β的磷酸化,進(jìn)而抑制了C/EBPα和PPARγ的表達(dá),抑制分化過(guò)程[36]。本研究表明,Snail1可通過(guò)結(jié)合并抑制Wnt信號(hào)通路拮抗蛋白基因SFRP2的表達(dá),進(jìn)而激活Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)的成脂分化抑制作用。前人研究發(fā)現(xiàn),Snail1可通過(guò)與β-catenin蛋白相互作用激活Wnt信號(hào)通路,參與調(diào)控癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,而Wnt信號(hào)通路的激活抑制了GSK3β活性,進(jìn)一步提高了Snail1蛋白的穩(wěn)定性[37]。那么可推測(cè)Wnt信號(hào)通路可能存在正反饋效應(yīng),通過(guò)“Snail1/SFRP2-Wnt/β-catenin-GSK3β”環(huán)[22],進(jìn)一步維持Snail1對(duì)Wnt信號(hào)的激活參與牛脂肪發(fā)育的調(diào)控,但其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探究Snail1調(diào)節(jié)脂肪生成的機(jī)制提供了新的思路。

4 結(jié) 論

前人對(duì)于Snail1在牛前體脂肪細(xì)胞增殖和分化中的作用尚不明確。本研究通過(guò)CCK-8、EdU、流式細(xì)胞術(shù)及油紅O、甘油三酯等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Snail1抑制了牛脂肪細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、靶基因預(yù)測(cè)及熒光素酶等試驗(yàn)證實(shí),SFRP2是Snail1的潛在靶向基因,且Snail1可能通過(guò)“Snail1/SFRP2-Wnt/β-catenin-GSK3 β”正反饋環(huán)參與牛脂肪細(xì)胞分化調(diào)控。上述研究為進(jìn)一步探索Snail1在脂肪生成中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為通過(guò)分子育種提高牛肌內(nèi)脂肪含量提供了思路。