范晨宇,單艷菊,章 明,姬改革,巨曉軍,屠云潔,賀 喜,束婧婷,劉一帆,3*,張海涵*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南家禽安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心,長(zhǎng)沙 410128;2.江蘇省家禽科學(xué)研究所,江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,揚(yáng)州 225125;3.江蘇省家禽科學(xué)研究所科技創(chuàng)新有限公司,揚(yáng)州 211412)

黃羽肉雞產(chǎn)業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一,出欄數(shù)約占肉雞總數(shù)的一半,為滿足城鄉(xiāng)居民肉食品供應(yīng)和養(yǎng)殖戶增收做出了重要的貢獻(xiàn)。根據(jù)生長(zhǎng)速度和出欄日齡,黃羽肉雞一般分為快速型(49～70 d)、中速型(71～90 d)和慢速型(91～180 d)三類[1]。快速型黃羽肉雞生產(chǎn)時(shí)間短,飼料報(bào)酬高,具有最低的生產(chǎn)成本,并且肉質(zhì)優(yōu)于白羽肉雞,因此越來(lái)越受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。隨著肉雞消費(fèi)逐步轉(zhuǎn)向冰鮮上市,快速型黃羽肉雞能夠更好地適應(yīng)屠宰需求,市場(chǎng)份額逐漸增加,其選育提高也越來(lái)越受到育種人員的關(guān)注。

生長(zhǎng)速度和肉品質(zhì)是影響快速型肉雞經(jīng)濟(jì)效益最重要的兩類性狀。雖然肉雞體重在過(guò)去幾十年中得到了顯著提高,但由于瓶頸效應(yīng)的存在,進(jìn)一步的提升存在明顯困難[2-3]。在實(shí)際選育工作中,肉色、剪切力等肉質(zhì)性狀由于遺傳力低、測(cè)量難度大等原因,常規(guī)選擇遺傳進(jìn)展明顯滯后[4-5]。因此,深入鑒定與生長(zhǎng)和肉品質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,并基于此開(kāi)展分子選育,對(duì)于加快肉雞品種選育進(jìn)展有著重要的意義。

近年來(lái),全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide associated study,GWAS)已成為研究人類疾病和畜禽經(jīng)濟(jì)性狀遺傳調(diào)控機(jī)制的重要手段[6-7]。在肉雞上,已有許多學(xué)者針對(duì)重要經(jīng)濟(jì)性狀開(kāi)展了相關(guān)研究,包括屠宰性能[8]、體重[9-10]、抗病性狀等[11-12],并報(bào)道了大量的候選SNPs和基因。然而,大部分研究集中于國(guó)外品種和部分地方品種,在快速型黃羽肉雞品種上的研究較為有限。

本研究選擇本團(tuán)隊(duì)與江蘇立華牧業(yè)股份有限公司合作培育的立華麻黃雞終端父系種雞作為研究對(duì)象,該品系具有生長(zhǎng)速度快、優(yōu)質(zhì)、早熟的特點(diǎn),60日齡(配套系上市日齡)體重可達(dá)到2.5 kg。利用重測(cè)序獲得393只公雞的基因組遺傳變異信息,通過(guò)GWAS方法獲得與體重和肉品質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)的候選基因和位點(diǎn),為快速型黃羽肉雞選育提高提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究選擇393只立華麻黃終端父系公雞作為試驗(yàn)材料,飼養(yǎng)于江蘇立華牧業(yè)股份有限公司金壇種雞場(chǎng)。試驗(yàn)雞群均同批飼養(yǎng)于同一雞舍,采用公司標(biāo)準(zhǔn)的種雞飼糧進(jìn)行飼喂,試驗(yàn)期自由飲水和采食。采用常規(guī)光照和免疫程序。對(duì)所有試驗(yàn)雞進(jìn)行翅靜脈采血保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 體重和肉品質(zhì)測(cè)定

雞群飼養(yǎng)至60日齡(上市日齡),禁食12 h后對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行稱重。隨后進(jìn)行屠宰,統(tǒng)一采集左側(cè)胸肌樣品進(jìn)行剪切力、系水力、pH和肉色測(cè)定。肉品質(zhì)測(cè)定方法參考《NY/T 1333—2007畜禽肉質(zhì)的測(cè)定》進(jìn)行。剪切力測(cè)定:使用C-LM4型電腦測(cè)控式肌肉嫩度儀進(jìn)行測(cè)定,胸肌樣品修剪成長(zhǎng)條狀(厚0.5 cm,寬1.0 cm),測(cè)定3次取平均值。系水力測(cè)定:使用YYW-2型應(yīng)變控制式無(wú)側(cè)限壓力儀對(duì)樣品進(jìn)行加壓測(cè)定,取新鮮胸肌肉樣1 g左右(w1)放置于上下壓臺(tái)間,并于樣品上下墊8層濾紙,施壓35 kg,保持5 min后,去掉壓力和濾紙,測(cè)定肉樣重量(w2),計(jì)算系水力(w1-w2)/w1。pH測(cè)定:使用胴體肌肉pH測(cè)定儀PH-STAR,屠宰后45 min測(cè)定胸肌pH,選取3個(gè)不同位置取平均值。肉色測(cè)定:使用NR10QC-3nh色差儀進(jìn)行肉色測(cè)定,在相同環(huán)境條件下,選取3個(gè)不同位置進(jìn)行3次測(cè)定,分別記錄亮度值(L*)、紅度值(a*)、黃度值(b*)。

1.3 全基因組重測(cè)序

使用TIANGEN基因組試劑盒提取和純化高質(zhì)量的基因組DNA,通過(guò)凝膠遷移(1%瓊脂糖凝膠)測(cè)定DNA降解和污染程度,DNA純度采用Nano Photometer分光光度計(jì)測(cè)定,DNA濃度通過(guò)NanoDrop熒光儀進(jìn)行定量。將合格樣品送至北京博致格雅生物科技有限公司建庫(kù),采用MGISEQ-2000平臺(tái)進(jìn)行全基因組重測(cè)序,測(cè)序深度為10×。獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)后,使用FASTP(v.0.20.0)[13]進(jìn)行過(guò)濾,去除低質(zhì)量reads,并對(duì)得到的Clean Reads進(jìn)行質(zhì)量控制,后用BWA(v0.7.17)[14]軟件將質(zhì)控后得到的reads比對(duì)至參考基因組GRcg7b。用Picard軟件將重復(fù)比對(duì)的reads移除。通過(guò)GATK4[15]軟件分析獲得高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

使用Plink v1.9[16]軟件對(duì)所得SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,合格的個(gè)體和位點(diǎn)用于GWAS分析。篩選標(biāo)準(zhǔn)為剔除基因頻率缺失高于2%的SNP(geno<0.02),個(gè)體基因頻率缺失超過(guò)4%的個(gè)體(mind<0.04),次等位基因頻率小于0.05(MAF<0.05),哈代溫伯格頻率小于0.000 1(hwe<1×10-4),雜合率平均值中偏離3倍標(biāo)準(zhǔn)差的個(gè)體(mean±3SD)。利用GEMMA(v0.98.5)[17]軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,模型如下:

y=Wα+Xβ+μ+e;

其中,y是表型向量;W是協(xié)方差矩陣;α是以第一、二、三主成分作為的協(xié)變量;X是固定效應(yīng)矩陣;β是有效SNP位點(diǎn)的數(shù)量;μ代表隨機(jī)效應(yīng)向量;e代表殘差。

使用Plink(v1.90p)軟件中的參數(shù)(-indep-pairwise 50 10 0.2)來(lái)推斷獨(dú)立檢驗(yàn)的有效SNP數(shù)量,最終推斷出有效獨(dú)立檢驗(yàn)的SNPs為432 529個(gè)。多重檢驗(yàn)后,采用Bonferroni校正法來(lái)設(shè)定顯著閾值,全基因組水平顯著閾值和潛在顯著閾值分別為1.15×10-7(0.05/432 529)和2.31×10-6(1/432 529)。使用Cmplot程序包對(duì)GWAS結(jié)果進(jìn)行可視化。通過(guò)Bedtools (v2.30.0)[18]軟件和參考基因組GRcg7b對(duì)顯著位點(diǎn)的上、下游100 kb進(jìn)行基因注釋。

2 結(jié) 果

2.1 表型描述統(tǒng)計(jì)

本研究使用的393只立華父系麻黃雞7種表型的基本統(tǒng)計(jì)描述如表1所示。體重、剪切力、系水力、pH、肉色L值、a值和b值的變異系數(shù)分別為8.18%、22.17%、10.45%、5.57%、4.91%、69.57%、22.58%。其中a值變異達(dá)到高度水平,剪切力和b值為中等變異性狀,表明這些性狀具有較大的遺傳選擇潛力。本群體中體重的變異系數(shù)較低,可能由于該品系經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的體重選擇導(dǎo)致。

2.2 全基因組SNP質(zhì)量控制

本研究獲得的原始下機(jī)數(shù)據(jù)共包含16 411 878個(gè)SNPs和393個(gè)個(gè)體,首先剔除SNP缺失率大于2%的位點(diǎn)1 767 209個(gè);2個(gè)個(gè)體因缺失率大于2%而被剔除;以MAF<0.05和HWE<1×10-4為標(biāo)準(zhǔn),剔除位點(diǎn)106 298個(gè);根據(jù)雜合度剔除個(gè)體3個(gè)。經(jīng)過(guò)質(zhì)控后,剩余388個(gè)個(gè)體和10 266 594個(gè)SNPs可用于后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)合異常表型值的剔除,最終用于各性狀GWAS分析個(gè)體數(shù)為:體重382個(gè),剪切力361個(gè),系水力354個(gè),pH 360個(gè),L值365個(gè),a值362個(gè),b值364個(gè)。

2.3 體重性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用GEMMA軟件構(gòu)建混合線性模型對(duì)382個(gè)個(gè)體的體重性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。如圖1和表2所示,本研究鑒定到2個(gè)與體重顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn),分別位于4號(hào)和28號(hào)染色體上,通過(guò)對(duì)SNP上、下游基因進(jìn)行搜索注釋,發(fā)現(xiàn)了11個(gè)基因位于與體重顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)上、下游100 kb的區(qū)域,包括FSTL3、DOCK11、IL13RA1、STK26等基因。而與體重潛在顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有52個(gè),主要分布于4、5、19、28號(hào)染色體上,位于NPFF、PFKM、MBNL3等基因附近。

圖1 體重性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.1 Genome-wide association study of body weight trait

表2 關(guān)聯(lián)SNPs注釋結(jié)果Table 2 Associated SNPs annotation results

2.4 肉品質(zhì)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

肉品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如圖2-7和表2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于4號(hào)染色體的1個(gè)位點(diǎn)與剪切力性狀顯著相關(guān);還發(fā)現(xiàn)15個(gè)位點(diǎn)與剪切力性狀存在潛在顯著關(guān)聯(lián),主要分布于4 號(hào)和19號(hào)染色體上,位于SLC13A5等基因附近。與系水力顯著相關(guān)的位點(diǎn)有1個(gè),位于17號(hào)染色體PTGS1基因附近;與系水力存在潛在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有25個(gè),主要分布在1號(hào)、14號(hào)和17號(hào)染色體,位于MDFIC等基因附近。共發(fā)現(xiàn)與pH性狀潛在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有36個(gè),主要分布在2號(hào)和6號(hào)染色體上,位于FGD3、AQP1等基因附近。位于2號(hào)染色體的1個(gè)SNP與肉色L值存在顯著關(guān)聯(lián),與a值存在顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有5個(gè),主要分布在1號(hào)和4號(hào)染色體上。與L*、a*、b*值存在潛在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)分別有124個(gè)、83個(gè)和13個(gè)。

圖2 剪切力性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.2 Genome-wide association study of shear force trait

圖3 系水力性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.3 Genome-wide association study of water binding capacity trait

圖4 pH的全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.4 Genome-wide association study of pH

圖5 L*值的全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.5 Genome-wide association study of L* value

圖6 a*值的全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.6 Genome-wide association study of a* value

圖7 b*值的全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.7 Genome-wide association study of b* value

本試驗(yàn)QQ-plot分析結(jié)果見(jiàn)圖8,各性狀膨脹系數(shù)介于1.008～1.037之間,表明本研究試驗(yàn)群體中不存在明顯的種群分層現(xiàn)象。

3 討 論

由于傳統(tǒng)的飲食習(xí)慣,我國(guó)肉雞生產(chǎn)呈現(xiàn)出獨(dú)特的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)。隨著活禽交易的逐步減少,消費(fèi)者開(kāi)始接受冰鮮雞肉產(chǎn)品,使得育種企業(yè)和研究人員對(duì)兼顧成本和品質(zhì)的快速型黃羽肉雞品種的關(guān)注日益增加。利用GWAS方法挖掘與重要性狀相關(guān)的分子標(biāo)志并用于分子育種,是加快畜禽品種選育進(jìn)展的有效措施。目前許多研究已經(jīng)應(yīng)用GWAS對(duì)京海黃雞[19]、汶上蘆花雞[20]、茶花雞、狼山雞、竹絲雞[21]等品種的體重性狀開(kāi)展了研究。雞肉品質(zhì)方面,許多學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展了肌肉糖原與血糖水平[22-23]、肌內(nèi)脂肪[24]、pH[25]、胸肌脂肪酸組成[26]、胸肌游離氨基酸和核苷酸組成[27]等性狀的關(guān)聯(lián)研究,為相關(guān)性狀的選育提高積累了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究利用全基因組重測(cè)序,對(duì)393只立華父系麻黃雞的60日齡體重和肉品質(zhì)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn),338個(gè)潛在關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。這些與體重相關(guān)的SNPs主要位于4號(hào)、5號(hào)、19號(hào)和28號(hào)染色體上,其中以4號(hào)染色體上的位點(diǎn)最為豐富。先前的研究也發(fā)現(xiàn),與體重有關(guān)的位點(diǎn)集中在1號(hào)和4號(hào)染色體上,張濤等[28]基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序?qū)┖｜S雞上市體重進(jìn)行研究時(shí),篩選出了9個(gè)位于4號(hào)染色體75.641～79.592 Mb區(qū)域的關(guān)聯(lián)位點(diǎn),這說(shuō)明本研究構(gòu)建的模型相對(duì)準(zhǔn)確。

在本研究中,發(fā)現(xiàn)一個(gè)與體重顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)位于28號(hào)染色體,其臨近基因?yàn)镕STL3。FSTL3是一種分泌型糖蛋白,屬于卵泡抑素模塊蛋白家族,與肥胖水平和脂肪細(xì)胞炎癥發(fā)生相關(guān)。血清中的FSTL3水平可反映脂肪中FSTL3表達(dá)水平及肥胖相關(guān)指標(biāo),被認(rèn)為是內(nèi)臟肥胖的生物標(biāo)志[29]。此外,FSTL3的過(guò)表達(dá)減少了肥胖發(fā)展過(guò)程中的脂肪積累,并可能通過(guò)抑制肌肉生長(zhǎng)抑制素等因子來(lái)控制體重[30]。在潛在關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中,rs43415532位于4號(hào)染色體上,其臨近基因?yàn)镸BNL3。MBNL3屬于肌盲樣蛋白家族成員,與肌肉發(fā)育和RNA的剪接調(diào)控密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),MBNL3能夠通過(guò)調(diào)控Myod的轉(zhuǎn)錄參與肌細(xì)胞的分化過(guò)程,抑制肌管的形成,并拮抗肌原素和肌球蛋白重鏈的表達(dá)。MBNL3過(guò)表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致肌肉發(fā)育和收縮相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)[31]。一項(xiàng)研究報(bào)道了MBNL3敲除的小鼠出現(xiàn)肌肉再生功能的明顯受損[32]。另外,位于34號(hào)染色體附近的一個(gè)體重相關(guān)SNP注釋到基因NPFF和PFKM。NPFF是一種由兩個(gè)氨基酸(Phe-Leu)組成的神經(jīng)肽,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮多種作用。研究表明,NPFF可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)激素的分泌來(lái)控制動(dòng)物的攝食行為[33]。PFKM是磷酸化果糖激酶,在糖酵解途徑中起重要作用,并在肌肉組織中廣泛表達(dá)。Tan等[34]報(bào)道該基因與雞和豬的肌肉發(fā)育有關(guān)。綜上所述,本研究推測(cè)FSTL3、MBNL3、NPFF、PFKM可能通過(guò)控制脂肪沉積、肌肉發(fā)育和攝食行為參與快速型黃羽肉雞的生長(zhǎng)發(fā)育,因此可作為候選基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。

目前,用于評(píng)價(jià)雞肉品質(zhì)的常見(jiàn)指標(biāo)包括剪切力、系水力、pH和肉色。肉色通常被認(rèn)為是評(píng)價(jià)肉質(zhì)的首要指標(biāo),直接影響消費(fèi)者的購(gòu)買選擇,一般用L(亮度)、a(紅度)和b(黃度)來(lái)衡量。本研究共鑒定到220個(gè)與肉色相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn),位點(diǎn)數(shù)量多于前人報(bào)道的結(jié)果[35-36],可能是由于本研究選擇重測(cè)序作為分型工具,可用于關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)更多。本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)與胸肌黃度值相關(guān)的位點(diǎn)位于PRKG1基因附近。Zheng等[37]研究發(fā)現(xiàn),PRKG1可以通過(guò)調(diào)控MYOD、MYOG和MEF2C的表達(dá),從而參與肌肉品質(zhì)性狀的調(diào)控。剪切力是另一項(xiàng)重要的肉質(zhì)指標(biāo),可直接反映肉的鮮嫩程度。本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)與剪切力顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)位于SLC13A5基因附近,該基因是溶質(zhì)載體家族成員,在脂肪酸合成中起重要作用[38]。此外,Luo等[39]報(bào)道SLC13A5與肌內(nèi)脂肪含量(IMF)顯著相關(guān),而IMF是影響肉類多汁性、嫩度和風(fēng)味的關(guān)鍵因素之一[40]。系水力即肌肉的保水能力[41],它決定了肉的多汁性、營(yíng)養(yǎng)組成、肉色外觀、酸堿度和其他感官特性[42]。此外,系水力與pH存在聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與系水力相關(guān)位點(diǎn)附近的基因?yàn)镸DFIC。MDFIC屬于一個(gè)包含富含半胱氨酸的c端結(jié)構(gòu)域的小家族蛋白,研究發(fā)現(xiàn)該基因可能通過(guò)PI3K/AKT等通路調(diào)控肌細(xì)胞增殖分化,從而參與肌肉功能的調(diào)控[43-44]。本研究還發(fā)現(xiàn)AQP1基因旁的一個(gè)SNP與雞肉的pH潛在相關(guān)。AQP編碼一類水通道蛋白,參與水的跨膜運(yùn)輸。在一項(xiàng)關(guān)于豬肉品質(zhì)的GWAS研究中也報(bào)道了AQP1與滴水損失顯著關(guān)聯(lián)[45]。另一個(gè)與pH潛在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)位于FGD3基因附近。Marchesi等[46]在白條紋雞肉上的研究中發(fā)現(xiàn),FGD3基因在患病和正常個(gè)體的胸肌組織中表達(dá)存在顯著差異,提示該基因與這種雞肉問(wèn)題的發(fā)生有關(guān)。本試驗(yàn)中,pH性狀關(guān)聯(lián)信號(hào)較強(qiáng),與之相關(guān)的位點(diǎn)集中于1、2、5、6、12和23號(hào)染色體。葡萄糖的代謝途徑之一即為合成肝糖原與肌糖原,肌糖原分解為乳酸影響pH,已有研究發(fā)現(xiàn)雞肌肉糖原和血糖水平關(guān)聯(lián)位點(diǎn)位于1、2、3、6和12號(hào)染色體[22-23],與本試驗(yàn)結(jié)果相似,提示相關(guān)位點(diǎn)在肉質(zhì)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。根據(jù)以上結(jié)果,認(rèn)為PRKG1、SLC13A5、MDFIC、AQP1、FGD3等基因可能是快速型黃羽肉雞肉品質(zhì)性狀的候選基因。然而,具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究基于立華麻黃雞全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了GWAS分析,在與體重性狀關(guān)聯(lián)的結(jié)果中,篩選到2個(gè)顯著關(guān)聯(lián),52個(gè)潛在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn);肉品質(zhì)性狀結(jié)果中,篩選到8個(gè)顯著關(guān)聯(lián),296個(gè)潛在關(guān)聯(lián)的位點(diǎn);并注釋到99個(gè)與體重、225個(gè)與肉品質(zhì)相關(guān)的功能基因。其中FSTL3、MBNL3、NPFF、PFKM、PRKG1、SLC13A5、MDFIC、FGD3、AQP1等基因可作為肉雞體重和肉質(zhì)性狀的關(guān)鍵候選基因。本研究為快速型黃羽肉雞重要經(jīng)濟(jì)性狀提供了重要的遺傳變異位點(diǎn)和候選基因,可以為相關(guān)品種開(kāi)展分子育種提供理論基礎(chǔ)。