王燕星,張雨時,姬海港,劉 陽,牛玉芳,韓瑞麗,劉小軍,田亞東,康相濤,李轉(zhuǎn)見

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,鄭州 450046)

骨骼肌是畜禽機體重要組成部分之一,對畜禽運動的維系具有重要作用[1]。肌肉組織的終生維持是由衛(wèi)星細胞介導(dǎo)的[2],骨骼肌衛(wèi)星細胞(muscle satellite cells, MSCs)是位于細胞膜和基膜之間的一類肌源性干細胞[3],通常情況下,處于靜止狀態(tài)僅零星增殖[4]。而當機體損傷,骨骼肌衛(wèi)星細胞被激活,進行分裂以重建纖維完整性和功能[5]。分離培養(yǎng)PMSCs對于禽類骨骼肌研究來說是一個復(fù)雜且耗時的過程,并且每次試驗中細胞產(chǎn)量有限。同時,得到的細胞通常在一次或兩次傳代后停止生長,且存在內(nèi)源性污染[6]。細胞永生化是指通過自發(fā)或人為誘導(dǎo)原代細胞[7],使其度過復(fù)制衰老期,持續(xù)增殖分裂。永生化細胞系保留了原代細胞所具有的特定免疫標記和功能特性[8],且能夠提供均一的細胞群和可重現(xiàn)的結(jié)果[9-10]。常用于建立永生化細胞系的外源基因包括EB病毒[11]、猿猴病毒 40 Large T (SV40-LT)[12]和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶[13]等。SV40 是一種雙鏈DNA病毒,因其能夠快速且使原代細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)化為永生化細胞而應(yīng)用廣泛[14-15]。

本試驗通過慢病毒轉(zhuǎn)染SV40-LT以培養(yǎng)雞骨骼肌衛(wèi)星細胞系,從而為家禽骨骼肌的功能研究及永生化細胞系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM:F12、多聚甲醛(PFA)、膠原酶I、牛血清白蛋白、紅細胞裂解液、嘌呤霉素、Triton X-100、馬血清購自索萊寶公司;胎牛血清FBS購自Gibco公司;PAX7購自DSHB公司;CY3、山羊血清購自博奧森公司;Fluoromount-G熒光封片劑購自SourthernBiotech公司;質(zhì)粒無內(nèi)毒素提取試劑盒購自天根公司;動物總RNA快速提取試劑盒購自GENERay公司;5×All-In-One RT MasterMix購自Abm公司;SYBR Green qPCR Master、CCK-8試劑購自vazyme公司;Agarose購自擎科生物公司;pHY-SV40-Puro病毒液購自賽百慷公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原代雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離、培養(yǎng) 取15胚齡的雞胚20～30枚常規(guī)消毒后,超凈臺內(nèi)分離胸部肌肉于平皿;PBS緩沖液沖洗3次,剔除血管、脂肪、結(jié)締組織等非肌肉組織;平皿中加入少量消化酶(0.1% I型膠原酶、2%牛血清白蛋白混合于DMEM/F12),將組織剪碎并移至50 mL離心管中;加入組織塊5倍體積的消化酶溶液,封口,置于37 ℃水浴消化45 min左右;加入3倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化;混合液依次過100目、200目、500目的細胞過濾篩,細胞懸液1 000 r·min-1離心5 min;棄上清,完全培養(yǎng)基重懸細胞接種于T75培養(yǎng)瓶,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后進行差速貼壁,即可分離得到PMSCs。

1.2.2 PMSCs免疫熒光鑒定 取F1代細胞接種于24孔板中,每孔3×106個細胞。將細胞用PBS緩慢洗滌;4%多聚甲醛于4 ℃固定30 min;0.1%Triton X-100室溫透膜10 min;PBS洗滌;滴加山羊血清[16]封閉1 h;棄封閉液,加入PAX7一抗,4 ℃過夜孵育;回收一抗,PBS洗滌;加入CY3二抗,37 ℃避光孵育1 h;PBS洗滌;加入DAPI染核5 min;PBS洗滌;熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 最佳藥物篩選濃度的確定 取F2代細胞接種于24孔板,將嘌呤霉素設(shè)置如下梯度:1、2、3、4、5、6、7 μg·mL-1對F2代細胞進行加壓篩選,每2 d 換一次液;觀察細胞狀態(tài),以細胞全部死亡的最低濃度為最佳篩選濃度。PMSCs的嘌呤霉素最佳篩選濃度為1 μg·mL-1。

1.2.4 慢病毒載體的包裝 取HEK293T細胞接種于培養(yǎng)皿,將質(zhì)粒pBobi-SV40-Puro與Lenti-Mix(pMDLg/pRRE∶pVSV-G∶pRSV-Rev=5∶3∶2 比例混合)混勻,加入0.25 moL· mL-1CaCl2吹勻;加入2×HBS,室溫靜置10 min;將Lenti-Mix-DNA轉(zhuǎn)染體系液逐滴加入培養(yǎng)皿,置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10 h;棄液,加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h,收集上清,500 g離心10 min;取上清用0.45 μmoL·L-1過濾器過濾;加入慢病毒濃縮液,4 ℃過夜;4 ℃ 10 000 r·min-1離心30 min,用無血清培養(yǎng)基重懸,分裝后凍存于-80 ℃。

1.2.5 永生化雞骨骼肌衛(wèi)星細胞的建立 取F2代細胞,加入病毒液;12 h后抽棄一半培養(yǎng)基并加入一半新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)24～48 h;加入篩選培養(yǎng)基;顯微鏡下觀察對照組細胞全部死亡,將篩選培養(yǎng)基中的嘌呤霉素濃度減半,直至有陽性細胞的出現(xiàn);將陽性細胞不斷連續(xù)培養(yǎng)后,獲得雞骨骼肌衛(wèi)星細胞系IMSCs;將傳代至第12代的雞骨骼肌衛(wèi)星細胞系稱為IMSCs P12[17]。

1.2.6 細胞增殖分析 將細胞接種于96孔板,每孔5×102個細胞;設(shè)置8組,每組10個重復(fù);依次在1～8 d將完全培養(yǎng)基與CCK-8試劑按照9∶1的比例混合;抽棄原有培養(yǎng)基,加入CCK-8試劑的培養(yǎng)液,孵育2 h;用酶標儀測定450 nm處吸光度值并繪制生長曲線。

1.2.7 細胞周期檢測 將細胞接種于6孔板,每孔2×106個細胞;消化細胞,2 000 r·min-1離心4 min;棄上清,加入1 mL預(yù)冷的PBS,2 000 r·min-1離心4 min;棄上清,重復(fù)兩次;加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇,4 ℃固定12～24 h;1 200 r·min-1離心5 min,棄上清;加入PBS,1 200 r·min-1離心5 min;棄上清,碘化丙啶染色,37 ℃避光溫浴30 min;用流式細胞儀在488 nm波長處檢測細胞周期。

1.2.8 血清依賴性分析 將細胞接種于96孔板,培養(yǎng)12 h;配制0%、5%、10%、20%胎牛血清[18]的DMEM/F12培養(yǎng)基,加入細胞中,每個濃度至少3個重復(fù);加入10 μL CCK-8試劑,孵育2 h。用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值并繪制柱狀圖。

1.2.9 軟瓊脂分析 將1.2%的Agarose培養(yǎng)基與20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基混合,鋪到6孔板;將IMSCs P12稀釋至每毫升1 000個,HEK293T細胞稀釋到每毫升200個;將0.7%的Agarose培養(yǎng)基與20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基緩慢混合后加入細胞懸液,鋪至下層膠;每隔2 d補加200 μL培養(yǎng)基[19];培養(yǎng)2周,待HEK293T細胞長出克隆后,顯微鏡拍照保存。

1.2.10 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞誘導(dǎo)分化模型構(gòu)建及分析 將細胞接種于24孔板;將培養(yǎng)基替換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含2%馬血清[20]的DMEM/F12培養(yǎng)基),分別收取增長至 70%,分化后 1～4 d的細胞。

1.2.11 實時熒光定量PCR檢測基因的表達SV40-LT、PAX7、MyoD及MyHC的引物如表1所示,β-actin用作為內(nèi)參基因。使用SYBR Green Master Mix試劑,cDNA作為模板,在QuantStudio 5實時熒光定量儀進行實時熒光定量PCR,參數(shù)如下:95 ℃預(yù)變性30 s;聚合酶鏈式反應(yīng)95 ℃持續(xù)10 s,60 ℃持續(xù)30 s,共35個循環(huán);95 ℃持續(xù)15 s,60 ℃持續(xù)1 min,95 ℃持續(xù)15 s。采用2—ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。每組樣品至少3個生物學(xué)重復(fù)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 27.0軟件中的One-way ANOVA和多重比較進行統(tǒng)計分析,結(jié)果以“Mean±SEM”表示。0.01

2 結(jié) 果

2.1 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞細胞鑒定

在PMSCs中,有92%的細胞PAX7在細胞核中呈陽性表達(圖1),可用于后續(xù)研究。

圖1 PMSCs中PAX7免疫熒光染色結(jié)果(100×,標尺:100 μm)Fig.1 Immunofluorescence staining result of PAX7 in PMSCs (100×, Bar=100 μm)

2.2 慢病毒載體的構(gòu)建

對照GFP慢病毒包裝24 h左右后,熒光效果顯示GFP陽性率約90%以上,病毒滴度為1×108tu·mL-1(圖2)。

圖2 GFP對照病毒包裝效果(200×)Fig.2 Comparison virus packaging rendering of GFP (200×)

2.3 嘌呤霉素篩選陽性細胞

雞骨骼肌衛(wèi)星細胞系連續(xù)傳至12代(IMSCs P12)后仍具有與PMSCs相似的形態(tài)(圖3),且SV40-LT基因在IMSCs P12中的表達是PMSCs的15倍(圖4)。

A.PMSCs生長近融合狀態(tài);B.IMSCs P12生長狀態(tài)A.PMSCs growth near fusion state; B.Growth state of IMSCs P12圖3 PMSCs和IMSCs P12形態(tài)圖(100×,標尺:100 μm)Fig.3 The morphology of PMSCs and IMSCs P12(100×, Bar=100 μm)

圖4 IMSCs P12中SV40-LT mRNA表達Fig.4 SV40-LT mRNA expression in IMSCs P12

2.4 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞生長曲線分析

將PMSCs與IMSCs P12連續(xù)培養(yǎng)8 d,在1～5 d細胞處于生長潛伏期,5～6 d處于對數(shù)生長期,然后細胞進入平臺期(圖5)。

圖5 PMSCs和IMSCs P12增殖曲線Fig.5 The growth curves of PMSCs and IMSCs P12

2.5 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞周期分析

IMSCs P12處在S期的細胞明顯多于PMSCs,二者差異極顯著(P<0.01);IMSCs P12處在G2M期的細胞明顯多于PMSCs,二者差異極顯著(P<0.000 1)(圖6)。說明與PMSCs相比,IMSCs P12具有更高的增殖活性。

圖6 PMSCs和IMSCs P12細胞周期檢測Fig.6 Cell cycle detection of PMSCs and IMSCs P12

2.6 永生化雞骨骼肌衛(wèi)星細胞血清依賴性分析

本試驗采用不同血清濃度來培養(yǎng)IMSCs P12,結(jié)果如圖7所示,在無血清時,IMSCs P12不能正常生長;血清濃度為5%、10%、20%時,IMSCs P12能夠增殖,且20%的血清濃度促進增殖的能力要明顯高于5%的血清濃度,兩者差異極顯著(P<0.000 1);15%、20%的血清濃度促進細胞增殖的能力極顯著高于5%時細胞增殖的能力(P<0.000 1)。

圖7 IMSCs P12血清依賴性分析Fig.7 Serum dependence analysis in IMSCs P12

2.7 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞軟瓊脂分析

在培養(yǎng)5D、10D、14D后,顯微鏡下鏡檢結(jié)果表明,IMSCs P12在軟瓊脂中均為單獨的細胞(圖8A、B、C),沒有形成細胞克隆,而HEK293T細胞形成了明顯的獨立細胞克隆團(圖8D、E、F)。

A.軟瓊脂培養(yǎng)2 d的IMSCs P12;B.軟瓊脂培養(yǎng)5 d的IMSCs P12;C.軟瓊脂培養(yǎng)2周的IMSCs P12;D.軟瓊脂培養(yǎng)2 d的HEK293T細胞;E.軟瓊脂培養(yǎng)5 d的HEK293T細胞;F.軟瓊脂培養(yǎng)2周的HEK293T細胞A.Culture IMSCs P12 in soft agar for 2 days; B.Culture IMSCs P12 in soft agar for 5 days; C.Culture IMSCs P12 in soft agar for 2 weeks; D.Culture HEK293T in soft agar for 2 days; E.Culture HEK293T in soft agar for 5 days; F.Culture HEK293T in soft agar for 2 weeks圖8 PMSCs和IMSCs P12軟瓊脂分析(100×,標尺:100 μm)Fig.8 Soft agar analysis of PMSCs and IMSCs P12 (100×, Bar=100 μm)

2.8 雞骨骼肌衛(wèi)星細胞誘導(dǎo)分化模型構(gòu)建及分析

雞骨骼肌衛(wèi)星細胞經(jīng)2%馬血清誘導(dǎo)處理后,可以向成肌細胞、肌纖維進行分化。PAX7、MyoD、MyHC分別為雞骨骼肌衛(wèi)星細胞、成肌細胞、肌纖維的標志基因。PAX7在PMSCs與IMSCs P12增殖到70%、誘導(dǎo)分化1 d、2 d的表達趨勢是一致的,先下降后上升(圖9A);MyoD在PMSCs與IMSCs P12增殖到70%、誘導(dǎo)分化1 d的基因表達趨勢一致,都是上升(圖9B);MyHC在PMSCs與IMSCs P12增殖到70%、誘導(dǎo)分化1～3 d的基因表達趨勢一致,都是上升(圖9C)。

A.PAX7 mRNA在PMSCs和IMSCs P12中的表達變化;B.MyoD mRNA在PMSCs和IMSCs P12中的表達變化;C.MyHC mRNA 在PMSCs和IMSCs P12中的表達變化A. PAX7 mRNA expression in PMSCs and IMSCs P12; B.MyoD mRNA expression in PMSCs and IMSCs P12; C.MyHC mRNA expression in PMSCs and IMSCs P12圖9 PMSCs和IMSCs P12誘導(dǎo)分化Fig.9 Induced differentiation of PMSCs and IMSCs P12

3 討 論

一般而言,原代細胞增殖傳代到一定的代數(shù)后會停止分裂并伴有衰老、死亡[21]。原代細胞的分離過程比較復(fù)雜且不同批次的細胞會帶來異質(zhì)性,影響試驗結(jié)果[22]。永生化細胞系因其可以提供均質(zhì)的細胞材料、可重復(fù)的試驗結(jié)果、避免了內(nèi)源性污染的風(fēng)險[23]并且具有更好的增殖特性等優(yōu)勢[24]。本研究成功培養(yǎng)了一種雞骨骼肌衛(wèi)星細胞系,其生長曲線與細胞周期結(jié)果顯示增殖趨勢與PMSCs保持一致,且IMSCs P12具有更高的增殖活性。

軟瓊脂試驗是檢測永生化細胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的標準之一,正常的細胞在軟瓊脂中并不會生長,而腫瘤細胞可以在軟瓊脂中生長形成集落[25-27]。HEK293T細胞作為包裝慢病毒載體常用的細胞系之一,比較適合作為軟瓊脂分析的的陽性對照[28]。血清依賴性分析是鑒定細胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的另一標準,腫瘤細胞即使在低血清培養(yǎng)基中也會增殖[29]。SV40法構(gòu)建的細胞系在低血清培養(yǎng)基中很難形成集落,增加血清濃度后,可見細胞增殖[30]。本研究中,IMSCs P12在軟瓊脂培養(yǎng)2周后,依舊為單獨的細胞克隆,且隨著血清濃度的升高,IMSCs P12的增殖能力在逐漸升高,可見IMSCs P12沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

干細胞具有多能分化潛能,可以通過外部因素誘導(dǎo)分化成其他細胞,這種能力使得干細胞的研究非常有價值[31-33]。在構(gòu)建永生化細胞時,干細胞優(yōu)先作為選擇的對象之一[34]。已有許多研究表明,骨骼肌衛(wèi)細胞可以向成肌、成脂等細胞分化,永生化細胞系的建立將為肌肉、脂肪分化相關(guān)調(diào)控過程提供體外細胞模型[35-39]。骨骼肌衛(wèi)星細胞在未分化時主要表達PAX7基因,而MyoD、MyHC低表達;在分化過程中,PAX7的表達下調(diào),MyoD、MyHC的表達上調(diào)[40-43]。本研究通過對IMSCs P12誘導(dǎo)分化,當IMSCs P12增殖到70%到誘導(dǎo)分化第1天這一段時期,PAX7基因表達下調(diào),MyoD、MyHC基因表達上調(diào)?；谶@些結(jié)果,該細胞系具有與PMSCs相似的分化能力。SV40-LT基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以使細胞越過復(fù)制衰老期,同時也保留許多原代細胞的分化特性[44-45]。有研究表明,轉(zhuǎn)染SV40-LT可建立永生化細胞系[46],但由于宿主具有特異性,SV40-LT能否在雞細胞中發(fā)揮作用還是未可知的[47]。在研究家禽骨骼肌功能方面,可供使用的細胞系相對有限[48-49]。本研究成功地建立了一種穩(wěn)定傳代至12代的雞骨骼肌衛(wèi)星細胞系,下一步將利用其來探究與骨骼肌發(fā)育和功能相關(guān)基因的表達和功能。但所建立的細胞系培養(yǎng)傳代至后期細胞增殖較慢,并且在誘導(dǎo)分化2 d后,IMSCs P12中PAX7、MyoD、MyHC基因的表達顯著高于PMSCs。由此推斷,SV40-LT基因并不適用于雞骨骼肌衛(wèi)星細胞永生化的建立。

4 結(jié) 論

本研究通過慢病毒包裝SV40-LT基因轉(zhuǎn)染PMSCs得到連續(xù)傳代、生長良好的雞骨骼肌衛(wèi)星細胞系,這為研究家禽骨骼肌相關(guān)的功能基因提供了新的細胞模型,也為家禽永生化細胞系的建立提供了研究依據(jù)。