呂若一,司曉慧,孫志剛,史曉敏,2*,劉曉曄,2*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室,北京 102206;2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

目前,由細菌引起的豬傳染性疾病是我國養(yǎng)豬業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)。其中,豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)感染會引起豬敗血癥、淋巴結(jié)膿腫、關(guān)節(jié)炎等癥狀,此外,S.suis還是一種常見的人畜共患性細菌,感染S.suis的人會患肺炎、腦膜炎以及敗血癥,嚴(yán)重者并發(fā)心內(nèi)膜炎、纖維炎、預(yù)后聽力受損等[1-3]。1951年荷蘭學(xué)者首次報道了S.suis,從那時起S.suis感染的報道逐漸常見于養(yǎng)豬企業(yè)以及規(guī)?；i場。最初人們根據(jù)S.suis細胞壁莢膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)對其進行血清型分型[4],至1987年,S.suis被劃分為一個新菌種且已發(fā)現(xiàn)10種血清型[5];1998年,16S RNA方法被當(dāng)作S.suis血清分型的主要方法[6],隨后血清型20型、22型、26型、32型和34型因遺傳學(xué)差異而從S.suis中獨立出來[7],迄今為止S.suis已有超過390菌種[8]。

我國規(guī)?；i場中普遍存在S.suis感染情況,目前多采用抗菌藥物以及疫苗相結(jié)合的方式來進行治療。但是隨著亞致死劑量抗菌藥物的不合理使用,對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等藥物耐受的S.suis也逐漸開始流行[9-10];S.suis在抗菌藥物存在的情況下會入侵宿主細胞內(nèi)部,從而直接導(dǎo)致抗菌藥物治療失效,加重其感染與傳播風(fēng)險。目前針對耐藥性S.suis的研究尚不透徹,新興的抗菌藥物仍在研發(fā)階段,因此本文旨在歸納總結(jié)目前耐藥性S.suis的流行情況和新興的S.suis抗菌藥物研究進展,以期對耐藥性S.suis的流行進行監(jiān)測,對下一代抗菌藥物的研發(fā)提供新思路。

1 豬鏈球菌病流行情況分析

S.suis在全球規(guī)?；i場中普遍流行。根據(jù)近年的數(shù)據(jù)報道顯示,印度[11]、泰國[12]、印度尼西亞[13]、中國[14]、韓國[15]等亞洲國家均有報道S.suis流行,且檢出率在20%～50%甚至更高;歐洲各國家豬場中也有報道S.suis流行的情況,瑞典[16]、捷克[17-18]、西班牙[19]等國家豬場中均檢出S.suis且部分國家感染率超過90%;美洲國家中,加拿大[20]和美國[21-22]一直以來均有S.suis感染報道(表1),但是南美地區(qū)則僅有巴西報道過S.suis的流行情況[23],這說明豬鏈球菌感染普遍存在于世界各地,但是各個地區(qū)的血清流行性并不相同,這與不同地區(qū)養(yǎng)殖場的種類、管理以及生物種類都有很大的關(guān)系。

表1 全球部分地區(qū)報道的規(guī)?；i場中S. suis感染情況Table 1 The infection of S. suis in the world

我國各地均有感染S.suis的報道,其中東部地區(qū)感染率最高,但是我國的普遍流行的菌株類型均為血清2型[14,24-32](表1)。這說明同一國家中流行的菌株類型相似,同一國家之間的豬產(chǎn)品運輸以及用藥習(xí)慣都使得流行性菌株的種類更為相似。

自1998年和2005年我國江蘇、四川兩省分別暴發(fā)了集中性的人感染S.suis的病例以來,我國各地均有散發(fā)的人感染S.suis的報道:2007—2018年仍有報道廣西感染S.suis的患者[33],在我國的山東省[34-35]、江蘇省[36-38]、浙江省[39]、上海市[40]、河北省[41]、廣西省[31,42-43]、貴州省[44]均有零星感染S.suis的病例出現(xiàn),這些病例的共同特點是患病人員均在接觸生豬時有傷口接觸或是接觸生豬后免疫力下降的情況。醫(yī)院則均采用抗菌藥物對患者進行治療,但是也有患者對于抗菌藥物不敏感的報道,這很可能是患者感染了耐藥性S.suis所致,所以對耐藥性S.suis進行調(diào)查研究不僅可以控制養(yǎng)殖場中耐藥菌株的流行情況,還可以保障人用抗菌藥物的有效性。

2 豬鏈球菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機制分析

2.1 耐藥性豬鏈球菌全球流行情況

耐藥性S.suis的流行發(fā)生在世界各地[45],

2010—2019年,西班牙的加泰羅尼亞地區(qū)S.suis均對3代頭孢菌素、萬古霉素和利福平敏感,對青霉素和氟喹諾酮類藥物敏感率分別為88.9%和71.4%,并且大多數(shù)菌株對紅霉素和克林霉素耐藥[46];2016—2020年,奧地利豬群的553份豬呼吸道上皮的樣品顯示S.suis陽性,并且對四環(huán)素(66%)、克林霉素(62%)和紅霉素(58%)耐藥(圖1A)[47];2011—2018年,澳大利亞對當(dāng)?shù)匾?guī)?；i場S.suis病原分離物檢測發(fā)現(xiàn),菌株普遍存在四環(huán)素和紅霉素耐藥[48];瑞典在2020年對當(dāng)?shù)匾?guī)模化豬場病原分離物檢測發(fā)現(xiàn),多數(shù)S.suis對四環(huán)素耐藥,少部分菌株對恩諾沙星呈耐藥性[49](表2)。S.suis耐藥性的產(chǎn)生同不規(guī)范使用抗生素有關(guān),丹麥地區(qū)首次分離出耐藥性S.suis的時間在其批準(zhǔn)畜牧業(yè)使用抗生素之后[45],巴西[50]、泰國[51]、中國[14]等地區(qū)耐藥性S.suis的出現(xiàn)也同其使用抗生素作為促生長劑有關(guān)。通過對于來自不同國家的耐藥性S.suis分析發(fā)現(xiàn),其同源性可以追溯到1830年,且很可能首先出現(xiàn)在西歐地區(qū)[52]。

A. 2016—2020年間奧地利豬場的553份樣品中各耐藥性S. suis比例;B. 2013—2017年間中國16個養(yǎng)豬省份豬場病原分離物中耐藥性S. suis耐藥種類以及比例;C. 2011—2019年間中國20個省份中分離到的耐藥性S. suis耐藥種類以及比例; D. 檢出S. suis耐藥性以及相關(guān)耐藥基因的菌株遺傳進化時間軸[41,57]A. Proportion of each resistant S. suis in 553 samples from Austrian pig farms during 2016-2020; B. Proportion of resistant S. suis in pathogenic isolates from pig farms in 16 pig provinces in China during 2013-2017; C. Proportion of resistant S. suis isolated from 20 provinces in China during 2011-2019[41,57]圖1 規(guī)模化豬場S. suis耐藥性現(xiàn)狀以及耐藥基因進化軸Fig.1 Resistance of S. suis’s pathogenic isolates from large-scale pig farms

S. suis體外傳播時主要通過帶病豬經(jīng)口傳播,但也會以氣溶膠的形態(tài)在空氣中生存[42],多數(shù)集中在母豬以及保育仔豬階段[43]。S. suis在感染人的過程中主要通過傷口暴露傳播:大多數(shù)感染人員有生豬接觸[44],但是也存在沒有接觸史的S. suis感染患者[57]When S. suis is transmitted in vitro, it is mainly transmitted orally through sick pigs, but it can also survive in the air in the form of aerosols[42], most of these are concentrated in sows and nursery piglets[43]. S. suis is mainly transmitted through wound exposure in the process of infecting people: most infected people have contact with pigs[44], but there are also S. suis infected patients without a history of contact[57]圖2 S. suis耐藥機制以及感染過程示意圖Fig.2 The process of S. suis’s insistence and infection

表2 耐藥性S. suis的種類情況Table 2 Type of tolerance S. suis

2.2 我國豬鏈球菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機制

我國規(guī)模化豬場中普遍存在S.suis耐藥情況。從我國16個主要養(yǎng)豬省采集的樣品中分離出19 673個感染S.suis的病原分離物,這些病料均對8種常用抗生素(β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類、四環(huán)素類、喹諾酮類、多黏菌素類和磺胺類)表現(xiàn)出非常高的抗生素耐藥率(圖1B)[53]。江西豬場的豬鼻拭子樣本顯示S.suis的陽性分離率為34.08%,80%以上的分離樣本對萬古霉素、青霉素、米諾環(huán)素和氯霉素敏感[54]。黑龍江豬場中的采集樣品則對紅霉素、四環(huán)素、氯霉素等抗生素耐藥率高達80%以上[55]。

近年來多數(shù)研究表明,S.suis的耐藥性同其耐藥基因有關(guān)[58],2011—2019年,中國的20個省中收集到的436個S.suis分離物中發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的erm(B)基因和介導(dǎo)四環(huán)素類耐藥的tet(O)抗性基因(圖1C)[14];2016—2018年,從中國6個省份豬場的鼻腔樣本中分離出的S.suis染色體上和質(zhì)粒上有對噁唑烷酮類和酚類抗生素抗性的optrA基因[59];2022年,我國廣東地區(qū)規(guī)?；i場中收集到的150個分離菌株中四環(huán)素耐藥基因tet(M)的檢測率最高,其次是四環(huán)素介導(dǎo)的tet(O)基因[60],34株S.suis對四環(huán)素的耐藥率高達100%,其次為米諾環(huán)素82.4%、多西環(huán)素47.1%,其中3重耐藥菌株占比44.1%、2重耐藥菌株占比41.1%。tet(A)、tet(C)、tet(D)、tet(M)、tet(O)和tet(X)等耐藥基因均有檢出[61]。通過對從我國分離的366株臨床S.suis進行人類相關(guān)進化枝分析發(fā)現(xiàn),中國特有的ST7型豬鏈球菌含有許多抗生素抗性基因,包括tet(O)、mef(A)、erm(B)、msr(D)和aph(3’)-Ⅲ等,這些抗生素抗性基因也顯示出很強的可移動遺傳元件相關(guān)性,說明這些基因可以在不同菌株之間傳播[52]。表3中歸納了6個國家耐藥菌株的發(fā)生發(fā)展和攜帶的耐藥基因情況。

表3 6國耐藥性S. suis的發(fā)生發(fā)展Table 3 Development of drug-resistant S. suis in six countries

2.3 耐藥性S. suis主要傳播方式以及感染定殖

S.suis中獲得耐藥性菌株的耐藥基因如erm(B)和tet(O)在質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子介導(dǎo)下傳播[65]。在豬感染S.suis的過程中,菌株借助生物被膜(bacterial biofilm,BF)定殖于呼吸道上皮細胞分泌的黏液層[57],穿透黏液層后,黏附素(adhesin)協(xié)助S.suis黏附到呼吸道上皮細胞和細胞外基質(zhì)中[66],隨后S.suis會侵入宿主上皮細胞,進入宿主血液流經(jīng)全身并引起宿主敗血癥[67],或是穿過血腦屏障進入中樞系統(tǒng)進而引起腦膜炎[68-69];在S.suis感染宿主的過程中,耐藥機制使菌株帶有耐藥性,例如其主動外排、鈍化酶的產(chǎn)生以及藥物作用靶點改變等方式(圖1B、C)。

在S.suis相關(guān)疾病暴發(fā)初期,水平傳播是其主要傳染方式。目前,研究人員普遍認為S.suis感染人的方式為開放性傷口的接觸以及誤食生豬肉[70];我國作為生豬養(yǎng)殖大國,仍有大量潛在S.suis感染的高危人群,更需要加強對S.suis感染的監(jiān)測。

3 耐藥性豬鏈球菌病的防治措施

3.1 精確檢測防控耐藥菌株傳播

我國規(guī)?；i場在診斷S.suis時多采用生化試驗、凝集試驗、免疫印跡試驗、多重PCR等快速檢測方法。我國對于S.suis快速檢測技術(shù)的研究已較為成熟,這可以更準(zhǔn)確地幫助獸醫(yī)進行臨床診斷[71-79](表4)。通過這些精準(zhǔn)檢測方式,可以在第一時間得知病原體的基因水平信息,有助于人們對病原體分類甄別。對于耐藥性豬鏈球菌,也可以采用耐藥基因作為靶點基因進行檢測,這對了解和控制耐藥性豬鏈球菌的傳播有很大作用。

表4 S. suis的快速檢測方法Table 4 The rapid detection methods of S. suis

3.2 豬鏈球菌疫苗用于預(yù)防細菌流行和耐藥性出現(xiàn)

我國目前已研制出多種用于預(yù)防S.suis的滅活苗。新型疫苗例如針對S.suis的免疫性膜相關(guān)蛋白的重組亞單位疫苗[80]、基因缺失疫苗[81]等都具有很強的抗原特異性(表5)。

表5 我國應(yīng)用的S. suis疫苗*Table 5 The vaccine application of S. suis in China

除過傳統(tǒng)的疫苗接種方式,也有研究發(fā)現(xiàn)茶多酚(green tea polyphenols , GTP)可以影響S.suis的重要代謝途徑,例如嘧啶代謝、蛋白質(zhì)消化和吸收[82];雙黃酮類化合物可以降低S.suis毒力因子(virulence factor, SLY)的活性、減少了炎癥因子的產(chǎn)生和細胞自噬[83]。穿心蓮內(nèi)酯亞抑菌濃度的干預(yù)可抑制S.suis生物被膜的形成,并且可致毒力基因表達水平差異[84]。這些新興的中藥治療方法為預(yù)防和控制耐藥性S.suis的感染提供了新的見解。

3.3 耐藥性豬鏈球菌病的治療措施

抗菌藥物一直被認為是治療細菌感染的特效藥,然而抗菌藥物的亞致死劑量使用會促使S.suis的耐藥性發(fā)生。目前開發(fā)出高效的新型抗菌藥物仍然是治療耐藥性S.suis感染的最有效策略。

一方面,可以采用聯(lián)合用藥、穿梭用藥等經(jīng)典手段來抑制耐藥性的進一步發(fā)展,例如常規(guī)抗菌劑 (anti-microbiology bacterial, AMB)與精油(essential oil, EO)的組合比單獨使用AMBs對抑制S.suis效果更佳[85-86];利用體外殺傷曲線和體內(nèi)處理試驗聯(lián)合得出氨芐青霉素+安普霉素和替莫林+大觀霉素的聯(lián)合治療方案對S.suis有較單一抗生素使用更為有效的治療效果[87-89];我國傳統(tǒng)的中藥有效成分例如黃酮類化合物黃酮類化合物在抗細菌共感染方面具有明顯效果[90],實驗室前期研究成果已經(jīng)顯示黃酮類中藥具有良好的抗S.suis溶血素作用[91],該類中藥主要通過抑制溶血素基因編碼、基因轉(zhuǎn)錄等途徑抑制其活性[92],這也為今后中藥治療S.suis感染提供參考。

另一方面,雖然抗菌藥物一直以來被認為是細菌感染的特效藥,但是隨著抗菌藥物的不合理和大規(guī)模使用,抗菌藥物的耐藥性大大提高。受到宿主因素影響的細菌藥物耐受行為直接導(dǎo)致抗菌藥物治療策略失效[93]。S.suis作為革蘭陽性菌可以侵入宿主的上皮細胞并在其中存活,這使得S.suis對多種抗生素均有耐受性產(chǎn)生[85]。通過依從S.suis的主要毒力因子例如自溶素(autolysins, Atl)、豬溶血素(suilysin, SLY)介導(dǎo)的侵入方式[87,90],研發(fā)靶向細菌毒力因子的抗菌藥物,降低細菌黏附、避免病原菌入侵細胞[94];S.suis的中和性抗體也可以作為阻斷細菌入侵的候選因子;通過設(shè)計作用于宿主的抗菌化合物(host-acting antibacterial compounds, HACs)也可以用于抗S.suis[95]:模擬甘露糖受體C型1型(mannose receptor C-1, MRC-1)的多肽作用于肺炎鏈球菌的溶血素可以抑制鏈球菌內(nèi)化[96];砷酸鹽、異霉素和過氧化氫等可以通過重塑宿主膜來調(diào)節(jié)酸性鞘蛋白酶,從而減少細菌黏附[93];25-羥基膽固醇通過靶向膜重塑,來改變膜的膽固醇從而減少細菌內(nèi)化[97]?？傊?阻斷病原體的黏附或內(nèi)化是開發(fā)新HACs和消除細菌感染的一種高效策略[86,88,95,98]。

4 小結(jié)與展望

S.suis作為規(guī)?；i場中常見的細菌,其菌株血清型類型眾多,在感染中常出現(xiàn)不同血清型混合感染的情況[83];近年來隨著飼養(yǎng)過程中大量不規(guī)范使用抗生素,使得S.suis耐藥性也逐年增加,多數(shù)規(guī)模化豬場中分離的S.suis菌株對于四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類抗生素耐藥性已達80%以上,所以進行S.suis耐藥性分析是目前防控的重中之重。S.suis自1951年初次報道后,在全球范圍內(nèi)廣泛流行,菌株也在不斷發(fā)生基因重組、基因整合等過程,這些都會對菌株的耐藥性以及感染能力等帶來改變:我國豬場中一直以來廣泛流行2型S.suis菌株,7型S.suis菌株雖然同2型的毒力基因差異較大,但是其實際的毒力不容小覷,且其中不乏新興的耐藥基因出現(xiàn)[88],這對防控耐藥性豬鏈球菌提出了新的挑戰(zhàn),因此在防控過程中,歸納分析菌株之間的耐藥基因差異十分重要。S.suis感染宿主過程中的機制蛋白在協(xié)助其免疫逃避中發(fā)揮著重要作用,影響著宿主的免疫能力:蛋白質(zhì)內(nèi)肽酶O(S.suisprotein endopeptidase O, SsPepO)是新型纖連蛋白結(jié)合蛋白,它可以協(xié)助S.suis逃避宿主免疫[99];胞壁質(zhì)酶釋放蛋白(muramidase-released protein, MRP)是新型纖維蛋白原結(jié)合蛋白,它可增強S.suis在宿主血液中的存活率,從而使得其腦膜炎加重[100];細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白作為S.suis和宿主之間連接的橋梁,已經(jīng)被證明可以同S.suis相互作用、促進機體感染菌株[101]。所以,在預(yù)防S.suis感染的過程中,要注意豬場的環(huán)境衛(wèi)生、通風(fēng)情況,這些都會對豬群的免疫能力造成影響。

除了宿主免疫能力方面,按時對豬群進行免疫接種從而預(yù)防S.suis感染的方式在我國已經(jīng)發(fā)展較為成熟:研究人員在疫苗開發(fā)過程中采用ECM蛋白、與宿主體內(nèi)纖維蛋白或漿膜蛋白相互作用的S.suis蛋白作為潛在目標(biāo)蛋白制備亞單位疫苗來進行防控,根據(jù)此設(shè)計靶向中和SsPepO蛋白的治療S.suis方法、制備亞單位疫苗已經(jīng)被證實具有可行性[102]。

目前為止,廣泛應(yīng)用廣譜類抗生素的治療方法在不合理用藥情況下易引發(fā)耐藥性S.suis的大流行[98,100],新興的抗菌藥物研發(fā)迫在眉睫,研發(fā)通過靶向針對S.suis毒力因子[91-92]、中和性抗體和宿主作用的抗菌藥物來阻斷S.suis的黏附和入侵[93-95,97]都是可行的方法。本文通過總結(jié)國內(nèi)外已報道的部分規(guī)?；i場的S.suis感染情況以及菌株的耐藥性情況,一方面,定期對豬場病原分離物進行血清型鑒定和流行病學(xué)調(diào)查能及時了解S.suis的流行情況和基因組變化,有助于預(yù)防S.suis相關(guān)疾病;另一方面對S.suis病原分離物進行耐藥性分析可以對規(guī)?；i場中的用藥情況、藥品使用情況有一定的了解,進而指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥,來控制耐藥性菌株的進一步發(fā)展,同時也能為抗菌化合物的研發(fā)提供一定的參考。