雷 振, 楊小兵, 唐柳生

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一種慢性疾病,是全球死亡人數(shù)最多的單一病原體所致的傳染病,也是全球十大死因之一[1]。隨著結(jié)核病研究的不斷深入,由非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)引起的疾病也不斷被發(fā)現(xiàn),NTM感染與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似,如果不能及時準確鑒定極易造成誤診[2],并且大多數(shù)NTM對常見的抗結(jié)核藥物耐藥,常規(guī)的抗結(jié)核藥物治療達不到理想的療效。因此,尋找一種簡便、快速及可靠的檢測方法來進行分枝桿菌感染的診斷是目前研究的熱點[3]。本研究應用PCR-熒光探針法、BD960液體培養(yǎng)法和直接涂片熒光染色法檢測分枝桿菌,分析三種方法檢測分枝桿菌感染的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年1月至2021年4月在廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院就診的104例疑似分枝桿菌感染患者的標本,其中痰42份,支氣管灌洗液42份,穿刺液8份,腦脊液8份,骨髓3份,膿液1份。104例患者中,男69例,女35例,年齡15～82歲。納入標準:臨床診斷有結(jié)核癥狀,影像學診斷有結(jié)核病灶。排除標準:患者標本檢測失敗或者標本污染。本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(NO.2021-014)。

1.2儀器及試劑 全自動分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測儀(BACTECTMMGITTM960)、分枝桿菌培養(yǎng)管(1313823)和分枝桿菌培養(yǎng)添加試劑盒(2034928)均購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。PCR-熒光探針法所使用的FQD-96C實時熒光定量PCR分析儀購自杭州博日科技股份有限公司,試劑盒購自成都博奧晶芯生物科技有限公司?？顾崛旧噭?C210803)、硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基(20201218)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基(20201218)及中性羅氏培養(yǎng)基(20201222)購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3結(jié)核病診斷標準 依據(jù)《肺結(jié)核診斷:WS288-2017》[4]進行診斷。

1.4診斷方法

1.4.1 直接涂片熒光染色法 按照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[5]及試劑說明書進行操作。小心打開標本容器,用折斷的竹簽茬端挑取標本的可疑部分0.05～0.1 ml,在玻片正面的右側(cè)2/3中央處均勻涂抹成1.0 cm×2.0 cm大小的卵圓形痰膜,待自然干燥后用熒光染液進行染色,自然干燥后鏡檢。

1.4.2 PCR-熒光探針法 嚴格按照試劑說明書進行操作,首先在無菌杯內(nèi)加入等量的4% NaOH溶液對標本進行消化處理30 min,然后取1 ml液體加入1.5 ml EP管中,12 000 r/min離心5 min,去上清液后加入50 μl核酸提取液,充分渦旋后95 ℃水浴鍋中放置5 min,5 000 r/min離心1 min。取2 μl核酸樣本加入含有引物、探針、酶的18 μl擴增反應液中后放入實時熒光定量PCR儀。設(shè)置PCR擴增程序:37 ℃ 5 min、94 ℃ 3 min后,94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,40個循環(huán),50 ℃10 s。檢測通道同時選擇羧基熒光素(carboxyfluorescein,FAM)和六氯熒光素(hexachlorofluorescein,HEX)通道,熒光采集點選擇60 ℃ 30 s。樣本擴增曲線呈S型,且循環(huán)閾值(Ct值)<40判定為陽性,擴增曲線不呈S型或Ct值≥40(或無任何數(shù)值)判定為陰性。FAM通道陽性,HEX通道陽性或陰性,判定為MTB。FAM通道陰性,HEX通道陽性,判定為NTM。FAM通道陰性,HEX通道陰性判定為分枝桿菌核酸檢測陰性。

1.4.3 BD960液體培養(yǎng)法 按照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[5]進行操作,首先配制4% N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉(N-acetyl-L-cysteine-NaOH,NALC-NaOH)標本前處理液,往50 ml離心管中加入1～2 ml標本及等量現(xiàn)配標本前處理液消化處理15～20 min,加無菌pH 6.8的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)至約50 ml,蓋緊蓋子,混合后以3 000 g離心15 min,去上清液,加1～3 ml PBS懸浮沉淀,加0.5 ml懸浮液至提前加入0.8 ml分枝桿菌培養(yǎng)添加劑的分枝桿菌培養(yǎng)管中,使用BACTECTMMGITTM960全自動分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測儀進行檢測。儀器報陽后用萋尼氏染液染色鏡檢,確定為抗酸桿菌后用PNB/TCH培養(yǎng)基進行初步菌種鑒定。PNB和TCH培養(yǎng)基均有分枝桿菌生長判斷為NTM;PNB培養(yǎng)基無菌生長,而TCH培養(yǎng)基有分枝桿菌生長或無菌生長判斷為MTB。每批試驗以MTB標準株H37Rv為敏感參考菌株進行質(zhì)控。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分率)[n(%)]表示,采用配對χ2檢驗分析不同檢測結(jié)果的差異情況。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1三種檢測方法分枝桿菌檢出情況 104份標本,PCR-熒光探針法檢測陽性率為22.12%(23/104),其中MTB占56.52%(13/23),NTM占43.48%(10/23),見表1。直接涂片熒光染色法檢測陽性率為18.27%(19/104);BD960液體培養(yǎng)法檢測陽性率為32.69%(34/104),其中MTB占47.06%(16/34),NTM占52.94%(18/34)。見表2。

表1 104例PCR-熒光探針法檢測情況

表2 各類樣本檢測情況

2.2三種檢測方法檢測結(jié)果比較 根據(jù)三種檢測方法的檢測結(jié)果,以BD960液體培養(yǎng)法為參照標準,BD960液體培養(yǎng)法與PCR-熒光探針法陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.013),BD960液體培養(yǎng)法與直接涂片熒光染色法陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表3,4。

表3 PCR-熒光探針法與BD960液體培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較

表4 直接涂片熒光染色法與BD960液體培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較

3 討論

3.1本研究分析比較了三種不同原理檢測分枝桿菌感染的檢測效能。BD960液體培養(yǎng)技術(shù)是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)認可的結(jié)核病診斷“金標準”,可反映分枝桿菌的存活能力,并能做菌種鑒定和藥敏試驗[6],但培養(yǎng)周期長,BD960液體培養(yǎng)陰性需要6周才能報告,且對實驗室的生物安全級別要求較高。PCR-熒光探針法是采用雙重PCR技術(shù)和Tagman探針(一種檢測寡核苷酸的熒光探針)技術(shù)相結(jié)合,分別針對MTB復合群和分枝桿菌的特異性序列設(shè)計引物和探針,兩個探針分別標記不同的熒光發(fā)光基團。檢測時,當反應體系中有目的基因存在時,隨著PCR反應的進行就會釋放出熒光,通過監(jiān)測不同通道的熒光信號變化,進而實現(xiàn)對MTB復合群和NTM的檢測[7-8]。直接涂片熒光染色法只需要涂片干燥進行熒光染色,操作簡單、快速,但檢出率和靈敏度太低。

3.2三種方法檢測結(jié)果顯示,BD960液體培養(yǎng)法、PCR-熒光探針法和直接涂片熒光染色法的陽性率分別為32.69%、22.12%、18.27%。以BD960液體培養(yǎng)法為參照標準,BD960液體培養(yǎng)法與PCR-熒光探針法及直接涂片熒光染色法的檢測結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。直接涂片熒光染色法檢出率與國內(nèi)文獻報道相似。PCR-熒光探針法近年來已廣泛應用于檢測分枝桿菌,其優(yōu)點已在很多研究中得以證明。郭莉娜等[9]報道在不同臨床標本中用PCR-熒光探針法檢測分枝桿菌,檢出率為10.66%,低于本研究結(jié)果(22.12%)。陽紅梅等[7]和陳靜等[10]的報道結(jié)果中MTB檢出率分別為48.8%和39.2%,高于本研究結(jié)果[MTB檢出率12.50%(13/104)]。另外,郭莉娜等[9]報道PCR-熒光探針法陽性檢出率略高于傳統(tǒng)培養(yǎng)及鏡檢方法,差異的原因可能與隨機抽樣有關(guān),需要進一步研究。

3.3本研究中有7例PCR-熒光探針法檢測陰性而BD960液體培養(yǎng)法和涂片均為陽性(NTM 6例,MTB 1例),原因可能是引物和探針設(shè)計區(qū)出現(xiàn)新的突變而造成的假陰性,另外樣本的含血量過大(超過5%)也容易出現(xiàn)假陰性。本研究中還有3例PCR-熒光探針法檢測陽性而BD960液體培養(yǎng)法和直接涂片熒光染色法均為陰性(NTM 2例,MTB 1例),可能是由于PCR-熒光探針法檢測是分枝桿菌的DNA,不論死菌或活菌均能檢測,而BD960液體培養(yǎng)法僅能檢測活菌,造成死菌的原因可能是培養(yǎng)操作時處理不當或患者經(jīng)藥物治療時排出的是死菌(或低活力),有待進一步研究。通過PCR-熒光探針法和BD960液體培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),有1例為BD960液體培養(yǎng)法檢測出NTM而PCR-熒光探針法檢測出MTB,PCR-熒光探針法檢測的陽性結(jié)果依據(jù)為FAM和HEX通道均陽性,可能是因為MTB和NTM混合生長所致。當MTB和NTM混合生長時,只能表達MTB,這也是PCR-熒光探針法檢測的局限性。PCR-熒光探針法需要實驗室及操作人員具有專業(yè)的核酸檢測能力,且前期設(shè)備儀器投入較大,造成檢測成本相對較高,在基層實驗室推廣使用尚需時日[11]。而直接涂片熒光染色法只有在標本菌數(shù)量>5 000～10 000條/ml才有可能檢測為陽性[12],所以對取材和涂片的質(zhì)量要求比較高,檢驗人員人工鏡檢的經(jīng)驗對結(jié)果也有很大影響,容易造成誤診和漏診。

3.4不同樣本的檢測結(jié)果顯示,PCR-熒光探針法檢測出的23例分枝桿菌中有22例為痰和支氣管灌洗液標本檢測出的陽性結(jié)果,說明分枝桿菌引起人體各部位的感染以肺部感染最為常見[13-14]。3份骨髓標本檢測,PCR-熒光探針法和直接涂片熒光染色法均未檢測出分枝桿菌,而BD960液體培養(yǎng)法檢測出1例MTB和1例NTM。由此可見,PCR-熒光探針法和直接涂片熒光染色法檢測非痰標本分枝桿菌的效果不及BD960液體培養(yǎng)法。

總之,三種方法均可用于分枝桿菌的檢測,各具優(yōu)勢。PCR-熒光探針法可快速區(qū)分MTB和NTM,適合具有核酸檢測能力的實驗室使用。BD960液體培養(yǎng)法可檢測活菌,能作為臨床治療效果的觀察。直接涂片熒光染色法操作簡單,但無法區(qū)分MTB和NTM。應用PCR-熒光探針法、BD960液體培養(yǎng)法和直接涂片熒光染色法聯(lián)合檢測分枝桿菌,可優(yōu)勢互補,提高檢出率,為分枝桿菌感染的早期發(fā)現(xiàn)和有效控制提供理想的檢測方法。