馬 穎, 李琴福, 祁麗霞

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,患病率逐年升高,已成為神經(jīng)殘疾的主要原因之一[1]。高齡是患PD最重要的危險因素,且男性患病率高于女性[2-3]。盡管部分PD患者的臨床特征已完全顯現(xiàn),但其臨床診斷的準(zhǔn)確性不高,需進(jìn)一步探索新的生物標(biāo)志物。既往研究顯示,DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制均不同程度地參與調(diào)控PD的發(fā)病和發(fā)展過程[4]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在維持DNA甲基化中具有重要作用,其表達(dá)異常可能影響基因組的穩(wěn)定性[5]。龜板提取物可通過DNMT1核易位和α-突觸核蛋白(synuclein-alpha,SNCA)甲基化對PD模型多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用[6]。長鏈非編碼RNA人類母系表達(dá)基因3[long non-coding ribonucleic acid(RNA) human maternally expressed gene 3,lncRNA MEG3]在PD患者血漿中表達(dá)降低[7]。但目前關(guān)于DNMT1、lncRNA MEG3在PD發(fā)病中的診斷價值尚不清楚。鑒此,本研究旨在探討PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3表達(dá)水平及其臨床意義,現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象 招募2020年3月至2023年1月青海紅十字醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的PD患者106例作為PD組,其中男75例,女31例,年齡40.00～82.00(65.71±11.39)歲。另選擇同期本院健康體檢者103名作為對照組,其中男68名,女35名,年齡40～85(65.42±10.16)歲。本研究獲青海紅十字醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號:H20191015),研究對象簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者符合原發(fā)性PD診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)病歷資料完整;(3)健康體檢者性別、年齡與PD患者相匹配,體格檢查正常,無器質(zhì)性疾病及認(rèn)知障礙,無精神疾病或精神疾病史,腦CT檢查無異常。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并繼發(fā)性PD、其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腦血管病、癡呆或腦外傷者;(2)合并免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、嚴(yán)重臟器功能不全或惡性腫瘤者;(3)有藥物濫用史、急慢性毒物接觸史或精神疾病史者;(4)無法配合研究者。

1.2血清DNMT1表達(dá)水平測定 采用真空采血管收集研究對象治療前晨起空腹靜脈血3 ml,室溫靜置30 min后以3 000 r/min離心15 min,取上層血清,-80 ℃保存?zhèn)錂z。采用酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測血清DNMT1水平,試劑盒購自上?；钌锟萍加邢薰?。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3血清lncRNA MEG3表達(dá)水平測定 采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測血清lncRNA MEG3水平。采用Trizol法提取總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系:cDNA(50 ng/μl)4 μl,qPCR SYBR Green Master Mix(上?？道噬锟萍加邢薰?20 μl,上、下游引物(10 μmol/L)各1.6 μl,ddH2O 12.8 μl。lncRNA MEG3上游引物5′-CGGAGAGGCCTATGTTGGT-3′,下游引物5′-GAGACGGTGAGGCTCCTG-3′;GAPDH上游引物5′-CTACGAGCTCAGCTGCAGTAT-3′,下游引物5′-GTAGCGAGTGGCATCTCGG-3′。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-△△CT法計算血清lncRNA MEG3的相對表達(dá)量。

1.4臨床資料收集 通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集研究對象的臨床資料,包括性別、年齡、受教育年限、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、吸煙、飲酒、家族史、高血壓、糖尿病等一般人口學(xué)資料。采用美國Beckman公司AU680全自動生化分析儀檢測高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

1.5統(tǒng)一帕金森病評定量表(the Unified Parkinson′s Disease Rating Scale,UPDRS)評分及Hoehn-Yahr(H-Y)分期 (1)收集PD組患者治療前UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分[9]。UPDRS Ⅰ評分為精神、行為和情緒評估,包括智力損害、思維障礙、抑郁、動力或始動力。UPDRS Ⅱ評分為日常生活活動評估,包括言語、唾液分泌、吞咽、書寫、切割食物和使用餐具、著裝、個人衛(wèi)生、翻身和整理床單、跌跤、行走中凍結(jié)、行走、震顫、與PD有關(guān)的感覺主訴。UPDRS Ⅲ評分為運(yùn)動檢查評估,包括言語表達(dá)、面部表情、靜止性震顫(面部、嘴唇、頜、右上肢、左上肢、右下肢、左下肢)、手部動作性或姿勢性震顫、強(qiáng)直、手指拍打試驗(yàn)、手運(yùn)動、輪替運(yùn)動、腿部靈活性、起立、姿勢、步態(tài)、姿勢的穩(wěn)定性、軀體少動。三種評分均為0～4級,分級越高患者越嚴(yán)重。(2)治療前H-Y分期[10]。0期:無癥狀;1期:單側(cè)疾病;1.5期:單側(cè)和軀干受累;2期:雙側(cè)疾病和無平衡障礙;2.5期:輕微雙側(cè)疾病和后拉試驗(yàn)可恢復(fù);3期:輕中度雙側(cè)疾病、某種姿勢不穩(wěn)、獨(dú)立生活;4期:嚴(yán)重殘疾和仍可獨(dú)立站立和行走;5期:無幫助則只能臥床或坐輪椅。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料及血清DNMT1、lncRNA MEG3表達(dá)水平比較 PD組病程為(6.69±1.26)年;UPDRS Ⅰ評分(3.62±1.04)分,UPDRS Ⅱ評分(19.78±6.35)分,UPDRS Ⅲ評分(36.03±9.85)分;H-Y分期為0期者16例(15.09%),1～1.5期者32例(30.19%),2～3期者39例(36.79%),4～5期者19例(17.93%)。PD組血清DNMT1水平高于對照組,TC、TG、LDL-C及l(fā)ncRNA MEG3水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、家族史、高血壓、糖尿病、HDL-C水平、受教育年限比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料及血清DNMT1、lncRNA MEG3表達(dá)水平比較

2.2PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,PD患者血清DNMT1水平與TC、TG、LDL-C水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分、H-Y分期呈正相關(guān)(P<0.05)。lncRNA MEG3水平與TC、TG、LDL-C水平呈正相關(guān)(P<0.05),與UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分、H-Y分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.3PD發(fā)生的多因素logistic回歸分析結(jié)果 以發(fā)生PD情況為因變量(發(fā)生=1;未發(fā)生=0),將表1中有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析,結(jié)果顯示,較高的血清DNMT1水平是促進(jìn)PD發(fā)生的獨(dú)立危險因素(P<0.05),較高的lncRNA MEG3水平是抑制PD發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表3。

表3 PD發(fā)生的多因素logistic回歸分析結(jié)果

2.4血清DNMT1、lncRNA MEG3水平對PD的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清DNMT1、lncRNA MEG3水平具有診斷PD的應(yīng)用價值(P<0.05),且兩指標(biāo)聯(lián)合可進(jìn)一步提高診斷效能[AUC(95%CI)=0.906(0.865～0.947)],靈敏度和特異度分別為80.21%、89.34%。見圖1,表4。

圖1 血清DNMT1、lncRNA MEG3水平診斷PD的ROC曲線圖

表4 血清DNMT1、lncRNA MEG3水平診斷PD的ROC曲線分析結(jié)果

3 討論

3.1PD的病理特征包括路易體和路易神經(jīng)炎形式的神經(jīng)內(nèi)含物,黑質(zhì)和其他腦區(qū)細(xì)胞丟失[11]。盡管PD的發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)研究已取得一定進(jìn)展,但對其病因仍不十分明確,且尚未發(fā)現(xiàn)有效的治愈或預(yù)防方法[12-13]。由于PD的臨床特征與其他神經(jīng)退行性疾病有重疊,因此PD診斷仍是目前臨床面臨的一個挑戰(zhàn)[14]。

3.2既往研究顯示,環(huán)境因素可能通過誘導(dǎo)表觀遺傳修飾(如DNA甲基化)導(dǎo)致神經(jīng)退行性變,且此過程是由DNMT1等酶進(jìn)行調(diào)控的[15]。Saxena等[16]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元中過表達(dá)DNMT1可造成精神分裂癥相關(guān)基因失調(diào)。Zhang等[17]研究表明,在PD模型細(xì)胞和小鼠中DNMT1蛋白表達(dá)水平顯著降低。而本研究結(jié)果中PD患者血清DNMT1表達(dá)上調(diào),與Zhang等[17]的研究結(jié)果相反。分析認(rèn)為在炎癥等病理狀態(tài)可能導(dǎo)致細(xì)胞破裂增加,DNMT1可能經(jīng)細(xì)胞釋放進(jìn)入血液,使得血清DNMT1的檢測濃度升高,值得擴(kuò)大樣本量對此進(jìn)一步驗(yàn)證。lncRNA廣泛參與代謝和免疫等關(guān)鍵生理過程,并與腫瘤、心血管疾病、腎病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18]。Zhao等[19]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3在神經(jīng)元細(xì)胞死亡,以及缺氧、缺血條件下血管生成等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.3有研究顯示,DNMT1可以通過招募甲基轉(zhuǎn)移酶來促進(jìn)lncRNA MEG3啟動子甲基化以抑制lncRNA MEG3表達(dá)[20]。推測DNMT1、lncRNA MEG3可能共同參與PD患者神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Huang等[21]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3在PD患者中表達(dá)降低,lncRNA MEG3可通過調(diào)節(jié)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中富含亮氨酸重復(fù)激酶2的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞生存能力和凋亡?；诩韧芯糠治稣J(rèn)為,病理因素造成患者體內(nèi)血清DNMT1表達(dá)異常升高,促進(jìn)DNA甲基化的作用增加,進(jìn)而通過招募甲基轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)lncRNA MEG3啟動子甲基化,抑制血清lncRNA MEG3表達(dá)。另外,DNMT1、lncRNA MEG3可能共同影響PD患者神經(jīng)炎癥。Meng等[22]研究表明,lncRNA MEG3可通過靶向相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥。推測DNMT1可能通過調(diào)控lncRNA MEG3表達(dá),調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥,通過影響神經(jīng)炎癥參與PD患者腦損傷。本研究多因素logistic回歸分析及ROC曲線分析結(jié)果提示,DNMT1、lncRNA MEG3可能參與PD發(fā)病,且兩指標(biāo)聯(lián)合檢測有助于臨床早期確診PD。

3.4本研究結(jié)果顯示PD患者TC、TG、LDL-C水平較健康人群低,這與張展輿等[23]研究結(jié)果相似,且各指標(biāo)水平與血清DNMT1水平呈負(fù)相關(guān),與lncRNA MEG3水平呈正相關(guān)。分析PD患者血脂水平降低的可能原因?yàn)?(1)PD患者往往伴隨著交感神經(jīng)活動降低,皮質(zhì)醇和兒茶酚胺產(chǎn)生量減少,最終造成血脂水平降低。(2)在PD發(fā)展初期可能已伴隨血脂水平降低,脂質(zhì)水平降低可進(jìn)一步降低輔酶Q的水平,而輔酶Q主要功能為神經(jīng)保護(hù)和降低氧化應(yīng)激,進(jìn)而延遲或減少多巴胺的進(jìn)一步消耗[24]。既往研究表明,DNA甲基化是環(huán)境因素(如飲食)和復(fù)雜疾病(如酒精性脂肪肝)之間的表觀遺傳學(xué)聯(lián)系,其在肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用,進(jìn)而導(dǎo)致脂肪肝變性的發(fā)展[25]。Zou等[26]研究結(jié)果表明,lncRNA MEG3相關(guān)信號通路可通過控制參與脂質(zhì)代謝和炎癥的基因的表達(dá),參與體內(nèi)脂質(zhì)積聚和炎癥發(fā)應(yīng)。因此推測DNMT1、lncRNA MEG3也可能通過調(diào)控體內(nèi)血脂代謝的方式參與PD的疾病進(jìn)展,其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,PD患者血清DNMT1呈高表達(dá),lncRNA MEG3呈低表達(dá),二者聯(lián)合檢測有助于臨床診斷PD。但本文未進(jìn)一步探討PD不同亞型中血清DNMT1、lncRNA MEG3的表達(dá)水平差異,有待后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以研究,為PD患者的個體化治療方法研發(fā)提供參考。