郭彩茹, 劉欣欣, 牛宇杰, 賈富鑫

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)發(fā)病急,病死率高,嚴(yán)重威脅人類健康。再灌注治療可使AMI患者預(yù)后得到改善,但缺血再灌注也會(huì)損傷機(jī)體組織。有研究發(fā)現(xiàn),AMI患者即使接受及時(shí)的再灌注治療,住院死亡率仍有5.4%,住院期間心力衰竭發(fā)生率達(dá)14.2%,缺血再灌注損傷是影響患者最終梗死面積和預(yù)后的重要因素[1]。因此,減輕AMI患者缺血再灌注損傷,改善患者的預(yù)后,是目前心血管領(lǐng)域亟待解決的難題。有研究顯示,人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomes,Exosome-HADSCs)可通過促細(xì)胞存活,促進(jìn)血管生成、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抑制纖維化,改善心肌功能,在預(yù)防或治療心血管疾病方面具有巨大的應(yīng)用潛力[2-4]。但是,Exosome-HADSCs治療仍存在治療靶向性欠佳的問題,且在心肌缺血、缺氧的環(huán)境下,僅憑少量的外泌體難以從根本上改善心肌梗死區(qū)以及梗死邊緣區(qū)惡劣的微環(huán)境。黃芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是從豆科植物黃芪干燥根莖中提取的一種水溶性雜多糖,已被證實(shí)具有降血脂、抗炎和抗氧化等作用[5]。本課題組的前期研究表明APS對(duì)心肌細(xì)胞過氧化氫損傷有保護(hù)作用[6]。也有研究應(yīng)用APS來干預(yù)干細(xì)胞,結(jié)果顯示APS可通過動(dòng)員干細(xì)胞遷移、促進(jìn)增殖、誘導(dǎo)分化及干預(yù)外泌體的方式,增強(qiáng)干細(xì)胞移植修復(fù)梗死心肌的治療效果,改善心臟功能[7-9]。因此推測APS有可能通過改善局部微環(huán)境的炎癥反應(yīng)、降低細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管再生等方面,提高Exosome-HADSCs治療的有效率,從而加強(qiáng)Exosome-HADSCs的心肌保護(hù)作用。本研究通過心肌細(xì)胞AC16體外氯化鈷(CoCl2)損傷模型探索Exosome-HADSCs聯(lián)合APS在心肌損傷修復(fù)中的作用,旨在為進(jìn)一步改善AMI患者預(yù)后提供新的思路和治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要試劑 AC16細(xì)胞購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。DMEMF/12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Gibco公司。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose mesenchymal stem cells,HADSCs)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),以及無外泌體的HADSCs專用培養(yǎng)基、HUVECs專用培養(yǎng)基購自O(shè)riCell賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司。外泌體提取試劑盒購自于鄭州貝貝生物科技有限公司。CD63、腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)、CD9一抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)、蘇氨酸-絲氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,Akt)、GAPDH一抗,以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG H&L購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自蘇州新賽美生物科技有限公司。APS、CoCl2、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、CCK8試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)購自北京索萊寶科技有限公司。細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PVDF膜購自Millipore公司。Matrigel基質(zhì)膠購自于美國BD公司。

1.2主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,型號(hào):3111)。透射電鏡(Hitachi,型號(hào):HT7700)。熒光顯微鏡(徠卡,型號(hào):DMI4000B)。酶標(biāo)儀(PerkinElmer,型號(hào):VICTOR X3)。電泳儀(Bio-Rad,型號(hào):Bio-Rad Mini-PROTEANTetra Systems)。蛋白轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad,型號(hào):Bio-Rad Mini Trans-Blot)。凝膠成像儀(上海天能,型號(hào):Tanon 5200 Multi)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) AC16細(xì)胞使用含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEMF/12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),HADSCs和HUVECs使用對(duì)應(yīng)的專用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃,5% CO2。每2～3 d換一次液,待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4Exosome-HADSCs提取、鑒定及內(nèi)化實(shí)驗(yàn) 收集傳代培養(yǎng)48 h、處于對(duì)數(shù)生長期的HADSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照外泌體提取試劑盒說明書步驟提取Exosome-HADSCs。使用透射電鏡對(duì)提取的Exosome-HADSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測Exosome-HADSCs特異性標(biāo)志物CD9、CD63、TSG101的表達(dá)情況。按照細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)說明書步驟標(biāo)記外泌體,將標(biāo)記的外泌體與AC16細(xì)胞共孵育4 h,棄上清。以DAPI核染5 min,PBS清洗3次,熒光顯微鏡下拍照,觀察AC16內(nèi)化外泌體情況。

1.5血管形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估HUVECs成管能力 將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1∶2稀釋,在冰上鋪于96孔板內(nèi),60～70 μl/孔,置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。取對(duì)數(shù)生長期HUVECs,分別用培養(yǎng)基(control組)、含20 μg/ml Exosome-HADSCs培養(yǎng)基(Exo組)、含100 μg/ml APS培養(yǎng)基(APS組)、含20 μg/ml Exosome-HADSCs+100 μg/ml APS培養(yǎng)基(Exo+APS組)進(jìn)行重懸,調(diào)整密度為4×105cells/ml,取100 μl接種于Matrigel基質(zhì)凝膠表面,培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后在顯微鏡下觀察、拍照。使用ImageJ軟件對(duì)各組形成血管網(wǎng)格數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),每組3個(gè)復(fù)孔,行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估HUVECs細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長期HUVECs進(jìn)行胰酶消化,離心后按方法1.5的分組方法進(jìn)行處理,調(diào)整細(xì)胞密度為3×105cells/ml,每孔2 ml,種植于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后用無菌1 ml移液槍頭在細(xì)胞中央均勻劃1條痕,用PBS洗去漂浮細(xì)胞,換新鮮培養(yǎng)基,顯微鏡下拍照記錄。將6孔板放置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),于24 h、48 h時(shí)間點(diǎn)在顯微鏡下拍照記錄。使用ImageJ軟件計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積,48 h細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕面積-培養(yǎng)48 h后劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。每組3個(gè)復(fù)孔,行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.7心肌缺氧損傷構(gòu)建與修復(fù)實(shí)驗(yàn)分組 通過500 μmol/L氯化鈷(CoCl2)處理AC16心肌細(xì)胞12 h構(gòu)建心肌缺氧損傷模型。取對(duì)數(shù)生長期AC16細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的DMEMF/12培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理12 h后按下述方法進(jìn)行干預(yù)。(1)control組:正常培養(yǎng)AC16細(xì)胞,不進(jìn)行CoCl2損傷處理;(2)CoCl2組:CoCl2(500 μmol/L)損傷處理12 h后,用不含Exosome-HADSCs和APS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h;(3)CoCl2+Exo組:CoCl2(500 μmol/L)損傷處理12 h后,用含Exosome-HADSCs(20 μg/ml)的培養(yǎng)基修復(fù)48 h;(4)CoCl2+APS組:CoCl2(500 μmol/L)損傷處理12 h后,用含APS(100 μg/ml)的培養(yǎng)基修復(fù)48 h;(5)CoCl2+Exo+APS組:用CoCl2(500 μmol/L)損傷處理12 h后,用含Exosome-HADSCs(20 μg/ml)和APS(100 μg/ml)培養(yǎng)基修復(fù)48 h。

1.8CCK8實(shí)驗(yàn)評(píng)估AC16細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長期AC16細(xì)胞5×104cells/ml,100 μl/孔接種至96孔板,按照方法1.7的分組及干預(yù)方法進(jìn)行處理,結(jié)束后每孔加10 μl CCK8試劑,培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度值(OD值)。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(control組OD值-空白孔OD值)×100%。每組3個(gè)復(fù)孔,行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.9Tunel細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測AC16細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長期AC16細(xì)胞1×105cells/ml,1 ml/孔接種至24孔板,按照方法1.7的分組及干預(yù)方法進(jìn)行處理,結(jié)束后棄上清液,PBS清洗3次。加入200 μl/孔Tunel工作液,室溫下避光孵育30 min,棄工作液。加入DAPI,室溫避光染色5 min,PBS清洗3次。立即于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照,視野中DAPI藍(lán)染為細(xì)胞核,Tunel紅染為發(fā)生凋亡的細(xì)胞。使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量,細(xì)胞凋亡率=每個(gè)視野中紅染凋亡細(xì)胞數(shù)/藍(lán)染細(xì)胞數(shù)×100%。每組細(xì)胞計(jì)數(shù)5個(gè)視野,取平均值。每組3個(gè)復(fù)孔,行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.10Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長期AC16細(xì)胞按照6×105cells/孔接種于6孔板中,按照方法1.7的分組及干預(yù)方法進(jìn)行處理AC16細(xì)胞,胰酶消化細(xì)胞。按照全蛋白提取試劑盒步驟提取各組細(xì)胞蛋白,使用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度,調(diào)整各組蛋白濃度一致。取15 μg蛋白,用10%的SDS-PAGE凝膠電泳(80～120 V)分離蛋白,在300 mA、90 min的條件下將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉處理PVDF膜1 h。加入caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、GAPDH一抗液(1∶1 000稀釋),4 ℃條件下避光孵育過夜。TBST液洗膜3次,10 min/次,加入二抗液(1∶1 000稀釋),室溫避光孵育1 h。TBST溶液洗膜3次,10 min/次。滴加ECL發(fā)光液后用凝膠成像儀進(jìn)行拍照,以GAPDH為內(nèi)參,使用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Exosome-HADSCs鑒定及內(nèi)化結(jié)果 經(jīng)過磷鎢酸染色,透射電子顯微鏡下可見的Exosome-HADSCs直徑70～150 nm,呈圓形或橢圓形,呈“杯托”樣結(jié)構(gòu)的囊形小泡,見圖1?。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其外泌體標(biāo)記蛋白CD9、CD63和TSG101呈陽性表達(dá),見圖1?。提示成功提取到外泌體。紅色熒光染料DiI標(biāo)記的外泌體與AC16細(xì)胞共孵育4 h后,熒光顯微鏡下顯示外泌體分布在AC16細(xì)胞核周圍,提示外泌體被AC16細(xì)胞攝取,見圖2。

?透射電子顯微鏡下所見(箭頭所指為Exosome-HADSCs);?Werstern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

圖2 DiI標(biāo)記的Exosome-HADSCs內(nèi)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(×400)

2.2Exosome-HADSCs聯(lián)合APS對(duì)HUVECs血管形成的影響結(jié)果 與control組相比,Exo組、APS組和Exo+APS組形成血管網(wǎng)格數(shù)量顯著增多(P<0.05),且Exo+APS組形成血管網(wǎng)格的數(shù)量顯著多于Exo組和APS組(P<0.05)。見圖3。

?HUVECs細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(×100);?四組形成血管網(wǎng)格數(shù)量比較(F=312.400,P<0.001;*P<0.05)

2.3Exosome-HADSCs聯(lián)合APS對(duì)HUVECs遷移能力的影響結(jié)果 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control組相比,Exo組、APS組和Exo+APS組的HUVECs細(xì)胞遷移率更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且Exo+APS組細(xì)胞遷移率較Exo組和APS組更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

?劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(×50);?四組細(xì)胞遷移率比較(F=87.010,P<0.001;*P<0.05)

2.4Exosome-HADSCs聯(lián)合APS對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響結(jié)果 與control組相比,CoCl2組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。與CoCl2組相比,CoCl2+Exo組、CoCl2+APS組和CoCl2+Exo+APS組的細(xì)胞存活率提高,且CoCl2+Exo+APS組的細(xì)胞存活率較CoCl2+Exo組和CoCl2+APS組更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注:F=175.600,P<0.001;*P<0.05

2.5Exosome-HADSCs聯(lián)合APS對(duì)AC16心肌細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果 Tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control組相比,CoCl2組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01),提示心肌缺氧損傷模型構(gòu)建成功。與CoCl2組相比,CoCl2+Exo組、CoCl2+APS組和CoCl2+Exo+APS組的細(xì)胞凋亡率更低,且CoCl2+Exo+APS組的細(xì)胞凋亡率較CoCl2+Exo組和CoCl2+APS組更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control組相比,CoCl2組caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平增高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CoCl2組相比,CoCl2+Exo組、CoCl2+APS組、CoCl2+Exo+APS組caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),且CoCl2+Exo+APS組表達(dá)水平變化趨勢更明顯。見圖7。

?Tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(×100);?五組細(xì)胞凋亡率比較(F=250.700,P<0.001;*P<0.05)

?Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖;?五組caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較(F=632.200,P<0.001;F=194.600,P<0.001;F=260.300,P<0.001;*P<0.05,ns為P>0.05)

2.6Exosome-HADSCs聯(lián)合APS對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路的影響結(jié)果 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與CoCl2組相比,CoCl2+Exo組、CoCl2+APS組和CoCl2+Exo+APS組的PI3K、p-PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05),且CoCl2+Exo+APS組的表達(dá)水平上升趨勢更明顯(P<0.01)。見圖8。

?Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖;?五組Akt、PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)水平比較(F=184.400,P<0.001;F=25.240,P<0.001;F=236.500,P<0.001;*P<0.05,ns為P>0.05)

3 討論

3.1外泌體是主動(dòng)或被動(dòng)釋放到細(xì)胞外的直徑30～150 nm的納米級(jí)囊泡,其生成以后便以胞吐形式從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外[10-12]。干細(xì)胞主要是通過旁分泌途徑發(fā)揮作用,其中外泌體起到重要作用,外泌體通過介導(dǎo)miRNA與相關(guān)蛋白或靶基因的表達(dá),在抑制心肌細(xì)胞凋亡、抗心肌組織纖維化、促進(jìn)血管新生、促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞修復(fù)、減緩心室重構(gòu)、改善心功能方面發(fā)揮作用[13-15]。APS由豆科植物蒙古黃芪的干燥根莖無菌提取,具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗病毒等多重作用[16-18]。

3.2AMI是一種危重疾病,通常伴有血管生成功能障礙[19]。在心肌缺血期間,為心臟供血的血管變窄,導(dǎo)致心臟血液和營養(yǎng)供應(yīng)不足[2]。有研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中的缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)過表達(dá)能夠促進(jìn)受損的血管生成、遷移和增殖,并通過上調(diào)促血管生成因子和促進(jìn)新血管形成來發(fā)揮心臟保護(hù)作用[19]。本研究HUVECs血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control組相比,Exosome-HADSCs、APS干預(yù)均可增加HUVECs生成血管網(wǎng)格的數(shù)量,且Exosome-HADSCs聯(lián)合APS處理的效果更加顯著。HUVECs劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與control組相比,Exosome-HADSCs、APS均可促進(jìn)HUVECs的遷移,Exosome-HADSCs聯(lián)合APS干預(yù)可進(jìn)一步促進(jìn)HUVECs遷移。因此推測在心肌缺血再灌注損傷過程中,Exosome-HADSCs聯(lián)合APS可能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和遷移,從而減少心肌細(xì)胞凋亡。

3.3細(xì)胞凋亡是由多基因調(diào)控的細(xì)胞自主的有序的死亡過程。其中Bcl-2為抑凋亡因子,Bax為促凋亡因子。Bcl-2主要在凋亡的上游發(fā)揮作用,它能夠與Bax蛋白結(jié)合形成異二聚體,抑制Bax蛋白的促凋亡作用[20]。caspases家族是細(xì)胞凋亡過程中的調(diào)控因子,其中caspase-3被認(rèn)為是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因子之一[21]。有研究顯示,間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可顯著降低凋亡標(biāo)志物caspase-3、Bcl-2關(guān)聯(lián)死亡啟動(dòng)子(Bcl-2 associated death promoter,Bad)和Bax的表達(dá)水平,并上調(diào)心肌梗死大鼠的抗凋亡因子Bcl-2的水平[22]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)APS能夠有效降低過氧化氫引起的心肌細(xì)胞凋亡并調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)[6]。本研究也得出相似的結(jié)論,Exosome-HADSCs聯(lián)合APS干預(yù)可降低經(jīng)CoCl2損傷處理的AC16心肌細(xì)胞的凋亡率,且作用效果較單獨(dú)使用Exosome-HADSCs或APS干預(yù)更加顯著。這可能是因?yàn)锳PS具有抗炎、抗氧化應(yīng)激作用,可以協(xié)同提高Exosome-HADSCs抗心肌細(xì)胞凋亡的效果。

3.4PI3K/Akt途徑是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào),促進(jìn)代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成等生物學(xué)行為。有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過PI3K/Akt途徑減輕過氧化氫誘導(dǎo)的心肌損傷[23]。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可通過提升腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)水平,減少氧化應(yīng)激并激活PI3K/Akt通路增強(qiáng)心肌活力,減輕缺血再灌注后的不良心臟重塑[24]。陳廣琴等[25]的研究發(fā)現(xiàn)APS可通過PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路抑制自噬改善心肌細(xì)胞凋亡。本研究也觀察到Exosome-HADSCs聯(lián)合APS在修復(fù)CoCl2損傷的心肌細(xì)胞過程中,PI3K、p-PI3K、Akt蛋白的表達(dá)水平均顯著升高,說明Exosome-HADSCs聯(lián)合APS可能通過PI3K/Akt途徑抑制心肌細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。

綜上所述,Exosome-HADSCs聯(lián)合APS可能是一種潛在的心血管疾病治療方式,其保護(hù)作用可能是通過激活PI3K/Akt通路實(shí)現(xiàn),研究結(jié)果為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療缺血再灌注后的心肌損傷提供了理論依據(jù)。