房慧琴,王佳寧,劉永吉,劉泳,趙軍績(jī),臧運(yùn)華

1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250014; 2.青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院,青島市中醫(yī)醫(yī)院,山東 青島 266033

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性炎癥性疾病,AS斑塊的形成與不同細(xì)胞因子和脂質(zhì)介質(zhì)驅(qū)動(dòng)的免疫反應(yīng)以及影響內(nèi)皮細(xì)胞的局部血流動(dòng)力學(xué)等有關(guān)[1]。不穩(wěn)定的AS斑塊破裂、血管狹窄或血小板凝聚及栓塞所導(dǎo)致的閉塞都可能會(huì)引起嚴(yán)重的心腦血管疾病[2]。血栓形成疊加在破裂或侵蝕的AS斑塊上易導(dǎo)致各種心腦血管疾病[3-4],如冠心病、腦梗死等。目前,西醫(yī)治療AS的方法有手術(shù)治療、藥物治療等,而中醫(yī)治療AS具有一定的優(yōu)勢(shì)和特色,但其具體作用機(jī)制不明確,仍需繼續(xù)探討。

營(yíng)衛(wèi)學(xué)說(shuō)來(lái)源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》,在中醫(yī)理論上占有舉足輕重的地位?！盃I(yíng)衛(wèi)”的生成和運(yùn)行,與血液和脈絡(luò)有關(guān)。營(yíng)屬陰衛(wèi)屬陽(yáng),營(yíng)氣由水谷之精氣化生,入于脈中,循脈運(yùn)行全身,終而復(fù)始,營(yíng)周不休。經(jīng)絡(luò)是營(yíng)衛(wèi)之氣運(yùn)行的通道,氣血是營(yíng)衛(wèi)之氣的載體,營(yíng)衛(wèi)之氣依賴于臟腑的生理功能,臟腑的生理功能又依賴于營(yíng)衛(wèi)之氣的充養(yǎng)。衛(wèi)氣,水谷之悍氣,運(yùn)行于脈外,具有防御外表、濡養(yǎng)全身和調(diào)理全身腠理的作用。調(diào)和營(yíng)衛(wèi)法的代表方劑桂枝湯,最早見于《傷寒論》,由桂枝、白芍、生姜、甘草、大棗組成,已有研究表明,桂枝湯治療AS疾病有很好的效果[5-7],但作用靶點(diǎn)及機(jī)制尚未系統(tǒng)研究。本文選用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[8]對(duì)桂枝湯活性成分和AS疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選及預(yù)測(cè)分析,并用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證篩選出的有效活性成分與作用靶點(diǎn)之間的結(jié)合情況,探究桂枝湯治療AS的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 桂枝湯的活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和桂枝湯“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái) (traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://www.tcmsp.com/tcmsp.php)[9]分別檢索“桂枝”“白芍”“甘草”“生姜”“大棗”這5味藥物的化學(xué)成分,以口服生物利用度 (oral bioavailability,OB) ≥30%、類藥性指數(shù) (drug-likeness,DL) ≥0.18[10]為條件篩選活性成分,并檢索活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.uniprot.org) 實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)的規(guī)范化,設(shè)置物種為Homo spanies(智人)、reviewed(已審核),獲得桂枝湯的活性成分及靶點(diǎn)。通過(guò)Cytoscape 3.9.1[11]構(gòu)建“桂枝湯-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行拓?fù)浞治?通過(guò)對(duì)其節(jié)點(diǎn)的度中心性(degree centrality,DC)、中介中心性(betweenness centrality,BC)和接近中心性(closeness centrality,CC)進(jìn)行計(jì)算,篩選出桂枝湯治療AS的關(guān)鍵活性成分。

1.2 AS相關(guān)靶點(diǎn)的搜集及桂枝湯治療AS的潛在靶點(diǎn)的獲取通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)[12]、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/search/)[13]和DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)[14]搜索“Atherosclerosis”,分別獲取AS的靶點(diǎn),整合去重后獲得AS的相關(guān)靶點(diǎn)。將中藥活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),獲取交集靶點(diǎn),即為桂枝湯治療AS的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)互作 (protein-protein interaction,PPI) 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將桂枝湯治療AS的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi/input.pl)中,將生物類型設(shè)為“Homo sapiens”,最低要求的交互分?jǐn)?shù)>0.7高置信度,且隱藏游離節(jié)點(diǎn),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape 3.9.1軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?以DC、BC、CC中位數(shù)的2倍為條件重復(fù)篩選兩次,獲得核心靶點(diǎn)。

1.4 富集分析及“核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建使用R軟件對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析,并繪制出氣泡圖,進(jìn)一步闡明桂枝湯治療AS的作用機(jī)制。使用Cytoscape 3.9.1軟件研究桂枝湯治療AS的核心靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系,構(gòu)建 “核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖,拓?fù)浞治龊Y選核心信號(hào)通路及關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 分子對(duì)接從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)獲取核心靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu),利用PyMol 2.4.0執(zhí)行“remove solvent” “remove organic”命令,并將其導(dǎo)入到AutoDockTools-1.5.6中加氫保存,再?gòu)腜ubchem數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取活性成分的2D結(jié)構(gòu)。利用AutoDock_Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬,并根據(jù)結(jié)合能評(píng)估最終對(duì)接結(jié)構(gòu),將其導(dǎo)入到PyMol2.4.0中進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 桂枝湯的有效成分、相關(guān)靶點(diǎn)及桂枝湯“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)基于TCMSP檢索“桂枝”“白芍”“甘草”“生姜”“大棗”這5味藥物的化學(xué)成分,以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件進(jìn)行篩選,共得到桂枝湯146種活性成分,并檢索到活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)2 476個(gè),整合去重后得到240個(gè)靶點(diǎn)?；钚猿煞旨跋嚓P(guān)靶點(diǎn)的分布信息見表1。通過(guò)Cytoscape 3.9.1構(gòu)建桂枝湯“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),如圖1所示,分別用不同形狀、顏色代表中藥成分及靶點(diǎn),其中菱形為靶點(diǎn),六邊形為藥物有效成分。圖中共包含281個(gè)節(jié)點(diǎn)和671條邊。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選得到槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、β-胡蘿卜素等為桂枝湯治療AS的關(guān)鍵活性成分,見表2。

表1 桂枝湯組方中藥活性成分及靶點(diǎn)分布信息表

注:BS:白芍;GZ:桂枝;GC:甘草;SJ:生姜;DZ:大棗;A1:白芍、桂枝、大棗、生姜的共有成分;B2:白芍、桂枝、大棗的共有成分;C3:白芍、甘草的共有成分;D1:大棗、生姜的共有成分;D2、D3:大棗、甘草的共有成分;E1:桂枝、甘草的共有成分。圖1 桂枝湯“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 中藥關(guān)鍵活性成分相關(guān)參數(shù)表

2.2 AS相關(guān)靶點(diǎn)及桂枝湯治療AS的潛在靶點(diǎn)通過(guò)GeneCards、DisGeNET、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出AS的相關(guān)靶點(diǎn),將三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)匯總后去除重復(fù)值共得到333個(gè)AS相關(guān)靶點(diǎn)。將桂枝湯活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與AS相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0制作成韋恩圖,獲得交集靶點(diǎn)62個(gè),即桂枝湯治療AS有62個(gè)潛在靶點(diǎn),見圖2。

圖2 桂枝湯活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與AS靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)將桂枝湯治療AS的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)中,將生物類型設(shè)為“Homo sapiens”,最低要求的交互分?jǐn)?shù)>0.7高置信度,隱藏游離節(jié)點(diǎn),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共有127個(gè)節(jié)點(diǎn)和547條邊。運(yùn)用 Cytoscape 3.9.1軟件分析桂枝湯活性成分與AS靶點(diǎn)之間的相互作用,利用Cytohubba插件根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的DC、BC、CC值得到9個(gè)核心靶點(diǎn),見表3、圖4。

2.4 GO富集分析GO富集分析共獲得1 595個(gè)條目,其中分子功能(molecular function,MF)91個(gè)條目,細(xì)胞組分(cellular component,CC)31個(gè)條目,生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)1 473個(gè)條目,根據(jù)“p value Filter=0.05,q value Filter=0.05”條件進(jìn)行篩選,并對(duì)每個(gè)條目的前10位結(jié)果做柱狀圖表示,橫坐標(biāo)代表基因組數(shù)目,縱坐標(biāo)代表具體的GO 條目,顏色代表GO富集的顯著性,顏色越紅代表基因富集越明顯,見圖5。分析顯示,BP包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stres)、對(duì)缺氧的反應(yīng)(response to hypoxia)、對(duì)外源性刺激的反應(yīng)(response to xenobiotic stimulus)、對(duì)肽的反應(yīng)(response to peptide)等;CC主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、囊泡腔(vesicle lumen)、肽酶抑制劑復(fù)合物(peptidase inhibitor complexe)、絲氨酸型肽酶復(fù)合物(serine-type peptidase complexe)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)等;MF主要涉及過(guò)氧化物酶活性(peroxidase activity)、氧化還原酶的活性,作用于過(guò)氧化物作為受體(oxidoreductase activity,acting on peroxides as receptors,cytokine activity)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、抗氧化活性(antioxidant activity)、蛋白酶結(jié)合(protease binding)等。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 核心靶點(diǎn)相關(guān)信息

圖4 核心靶點(diǎn)篩選過(guò)程相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 桂枝湯治療AS潛在靶點(diǎn)GO富集分析

2.5 KEGG信號(hào)通路富集分析KEGG富集分析共得到119條通路,并根據(jù)“p value Cutoff =1,q value Cutoff =1”條件進(jìn)行篩選,對(duì)其前30條富集分析結(jié)果進(jìn)行氣泡圖展示,見圖6。KEGG富集分析結(jié)果顯示,核心靶點(diǎn)主要與以下幾類有關(guān),如與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、癌癥中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、人巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)(transcriptional misregulation in cancer)、非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、酒精性肝疾病(alcoholic liver disease)等有關(guān);與傳染性疾病相關(guān),如美洲錐蟲病(chagas disease)、變形蟲病(amoebiasis)、乙型肝炎(hepatitis B)、瘧疾(malaria)、弓形體病(toxoplasmosis)、丙型肝炎(hepatitis C)、甲型H1N1流感(influenza A)、百日咳(pertussis)、非洲錐蟲病(African trypanosomiasis)、軍團(tuán)桿菌病(legionellosis)等;與癌癥相關(guān),如前列腺癌(prostate cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等;以及與信號(hào)通路有關(guān),如糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、C-型凝集素受體信號(hào)通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、NF-κB信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、松弛素信號(hào)通路(relaxin signaling pathway)等。以上結(jié)果表明,桂枝湯可通過(guò)多條信號(hào)通路參與治療動(dòng)脈粥樣硬化,見圖6。

圖6 潛在靶點(diǎn)KEGG富集分析氣泡圖

2.6 “核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)對(duì)桂枝湯治療AS核心靶點(diǎn)與通路之間的關(guān)系進(jìn)行可視化分析,得到“核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò),由圖可知,節(jié)點(diǎn)上自由度最大的通路為脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化,而自由度最大的靶點(diǎn)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6),提示該通路與該靶點(diǎn)可能在桂枝湯治療AS過(guò)程中起到關(guān)鍵作用,見圖7。

2.7 分子對(duì)接分子對(duì)接結(jié)果表明,槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等為與核心靶點(diǎn)結(jié)合活性較高的活性成分;而基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)等是活性成分作用較好的核心靶點(diǎn)。小分子配體與蛋白受體結(jié)合能越低,結(jié)合分子之間穩(wěn)定性越高,提示分子之間發(fā)生相互作用的可能性越大,核心成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能見表4。圖8展示對(duì)接結(jié)果較好的8組,其中以MMP-9、PTGS2、ICAM1與其對(duì)應(yīng)的化合物結(jié)合更穩(wěn)定。槲皮素與MMP-9結(jié)合能最低,其結(jié)合能為-10.7 kcal·mol-1,推測(cè)其可能是潛在靶點(diǎn)抑制劑,且其潛在的結(jié)合位點(diǎn)有LEU-243、GLN-227、ALA-189氨基酸殘基,與之形成氫鍵,氫鍵距離依次是2.7?、2.3?、2.0?、2.4?,隨著氫鍵距離的縮短,其結(jié)合親和力則會(huì)越強(qiáng);斯特法林、(-)-二氫槲皮素、左旋山槐素、β-谷甾醇與PTGS2有良好的結(jié)合力,結(jié)合力強(qiáng)弱大小依次是:左旋山槐素>(-)-二氫槲皮素>β-谷甾醇>斯特法林。槲皮素與ICAM-1的潛在結(jié)合位點(diǎn)是SER-176氨基酸殘基,二氫槲皮素與ICAM-1的潛在結(jié)合位點(diǎn)THR-300、LYS-360氨基酸殘基,山柰酚與ICAM-1的潛在結(jié)合位點(diǎn)是HIS-201、MET-202、SER-176氨基酸殘基,3種化合物與氨基酸殘基形成氫鍵的平均距離為2.3?,證實(shí)3種物質(zhì)能夠與靶點(diǎn)蛋白穩(wěn)定地結(jié)合。

注:外圈紅色菱形為信號(hào)通路;內(nèi)圈長(zhǎng)方形為核心靶點(diǎn)。圖7 “核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表4 分子對(duì)接結(jié)果

圖8 桂枝湯治療AS的核心靶點(diǎn)與活性成分的分子對(duì)接模式圖

3 討論

AS屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“中風(fēng)”“脈痹”等范疇,以本虛標(biāo)實(shí)為主,常以益氣活血法治療,其作為心腦血管病變的主要病理基礎(chǔ),動(dòng)脈內(nèi)膜處于關(guān)鍵地位,受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開始,先后出現(xiàn)多種病變,包括脂質(zhì)條紋、纖維斑塊和粥樣斑塊。近年來(lái),AS“由外向內(nèi)”的發(fā)病機(jī)制成了新的研究熱點(diǎn)[15]。血管外膜含有多種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞,如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滋養(yǎng)血管(vasa vasorum,VV)等,在血管應(yīng)激或受損時(shí),外膜細(xì)胞通常最先被活化,參與調(diào)節(jié)血管張力并重塑血管的結(jié)構(gòu)。有研究表明,在高膽固醇飲食喂養(yǎng)的豬的冠狀動(dòng)脈中,外源性VV密度的顯著增加先于內(nèi)皮功能障礙[16]。因此,對(duì)于AS的治療需要注意內(nèi)外膜的保護(hù)。

營(yíng)衛(wèi)學(xué)說(shuō)中,脈是營(yíng)衛(wèi)運(yùn)行的通道,《靈樞·營(yíng)衛(wèi)生會(huì)》記載:“營(yíng)行脈內(nèi),衛(wèi)行脈外,營(yíng)周不休。”營(yíng)衛(wèi)是由水谷精微所化,其運(yùn)行及功能均與脈息息相關(guān)。若營(yíng)衛(wèi)功能失衡則氣血運(yùn)行阻滯,造成血液凝滯不通?！秱摗け婷}法》云“榮衛(wèi)不通,血凝不流”。孫絡(luò)亦與營(yíng)衛(wèi)運(yùn)行不暢相關(guān),張景岳曰:“表里之氣,由絡(luò)以通,故以通營(yíng)衛(wèi)?！睂O絡(luò)是營(yíng)衛(wèi)之氣交會(huì)之處。而孫絡(luò)病變與微血管的功能異常也有極大的相似性,應(yīng)將外膜微血管歸于孫絡(luò)范疇。營(yíng)衛(wèi)以氣血的形式存在,營(yíng)衛(wèi)相和運(yùn)行促進(jìn)脈絡(luò)中血液通暢;營(yíng)衛(wèi)不和致痰瘀阻絡(luò),與AS病理過(guò)程中的高脂血癥及血液高凝有關(guān)。無(wú)論從中醫(yī)還是西醫(yī)上,營(yíng)衛(wèi)失調(diào),都是AS形成的重要原因,而桂枝湯作為調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的基本代表方,也從側(cè)面驗(yàn)證了調(diào)和營(yíng)衛(wèi)法可以治療AS。

本研究表明,在桂枝湯活性成分中Degree排前3名的依次是槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚。槲皮素在對(duì)抗AS中有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用、脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)、抗炎活性、抗細(xì)胞凋亡等作用[17];槲皮素還可通過(guò)升高一氧化氮(nitric oxide,NO)合成酶水平來(lái)阻止AS斑塊的形成[18],降低基質(zhì)金屬蛋白酶1 (matrix metalloproteinase 1,MMP-1) 來(lái)穩(wěn)定內(nèi)皮AS斑塊[19]等。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、降脂、抑制癌癥發(fā)展等作用[20]。Koo等[21]用β-谷甾醇防治載脂蛋白E缺乏癥小鼠的AS,并通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞NO和活性氧(reactive oxygen species,ROS)所產(chǎn)生的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶表達(dá)改變黏附分子的表達(dá),從而降低血管增厚及血漿總膽固醇、氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)和C反應(yīng)蛋白水平,進(jìn)而降低AS病變程度。山柰酚具有良好的抗氧化效果,可以清除超氧陰離子、羥基自由基,并抑制活性氧酶的活性等[22],并且山柰酚可降低大鼠高脂飲食中的脂質(zhì)含量,通過(guò)調(diào)節(jié)OPN-CD44通路來(lái)減輕AS癥狀[23]。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析得到9個(gè)核心靶點(diǎn),分別為TNF、IL-6、IL-1β、IL-10、CXCL8、MMP-9、VEGFA、ICAM-1、PTGS2,TNF、IL-6是Degree值較高的兩個(gè)靶點(diǎn)。在分子對(duì)接中,MMP-9結(jié)合能最低,結(jié)合力最強(qiáng),TNF、IL-6、MMP-9這3個(gè)靶點(diǎn)可能在桂枝湯治療AS中起到關(guān)鍵作用。TNF-α能夠促使LDL向ox-LDL的轉(zhuǎn)移,激活單核細(xì)胞因子,促進(jìn)細(xì)胞激素的正常釋放;IL-6還可以直接促使外周血T細(xì)胞增殖和輔助性B型細(xì)胞的分化生長(zhǎng),并能使外周血中性粒細(xì)胞迅速向周圍血管內(nèi)膜滲透,從而參與AS形成[24];衰老可引起線粒體功能下降和線粒體自噬破壞,與升主動(dòng)脈中的炎性細(xì)胞因子 IL-6 水平的大幅上升有關(guān);同時(shí) IL-6 也可與受損細(xì)胞中的血管線粒體功能水平發(fā)生關(guān)聯(lián),從而導(dǎo)致AS斑塊的形成[25]。在小鼠實(shí)驗(yàn)中,IL-1β 并不能使病變形成,但在高膽固醇喂養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中,外源性IL-1β可使內(nèi)膜的中層加厚[26]。NLRP3炎性小體激活了IL-1β,使其能夠驅(qū)動(dòng) IL-6 信號(hào)通路,這也是AS血栓形成的另一種可能因素[27]?；|(zhì)金屬蛋白酶則能夠調(diào)節(jié)AS中的各種細(xì)胞和信號(hào)通路,從而促使AS斑塊的生成和破壞[28]。MMP-9是穩(wěn)定型冠心病病人AS斑塊不穩(wěn)定的最強(qiáng)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,其水平與冠狀A(yù)S斑塊壞死核心的大小呈正相關(guān)[29]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族是控制血液和淋巴管的調(diào)節(jié)因子,VEGF-A與VEGFR-1、VEGFR-2一起調(diào)控血管形成、血管滲透性和炎癥反應(yīng)。VEGF-A是組織血運(yùn)重建過(guò)程中形成血管過(guò)程的核心,研究表明,在 ST段抬高型心肌梗死期間,VEGF-A 水平與微血管閉塞獨(dú)立相關(guān),且與中期左心室射血分?jǐn)?shù)相關(guān)[30]。ICAM-1促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互黏附,進(jìn)而引起免疫和炎癥反應(yīng),在AS病變中ICAM-1的作用尤為關(guān)鍵,可促使單核細(xì)胞遷入內(nèi)皮,攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,從而形成AS斑塊[31]。IL-10調(diào)控巨噬細(xì)胞活化及脂質(zhì)負(fù)載和活化的泡沫細(xì)胞中的MMP、促炎性細(xì)胞因子和環(huán)氧合酶-2的表達(dá)[32]。在AS病變中,巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生新的IL-10,參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的局部炎癥反應(yīng),減輕病變部位炎癥程度,減緩AS的進(jìn)程[33]。在泡沫細(xì)胞生成之前的局部炎癥階段PTGS2下調(diào),且PTGS2在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)低密度脂蛋白受體 (low density lipoprotein receptor,LDLR) 缺陷小鼠AS病變的形成有一定的促進(jìn)作用[34]。上述靶點(diǎn)在調(diào)控細(xì)胞因子、炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)免疫、脂質(zhì)代謝等方面起到了重要作用,同時(shí)也證實(shí)了桂枝湯在AS的治療中存在多靶點(diǎn)協(xié)同效應(yīng)。

GO富集分析中,BP多以對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源的分子的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)等為主。有研究發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)具有促AS的作用,使用ELISA和免疫組化檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),AS患者血清中的LPS水平顯著升高,頸動(dòng)脈斑塊組織切片LPS呈陽(yáng)性[35]。CC多以膜筏、膜微區(qū)等為主,膜筏主要與介導(dǎo)和擴(kuò)增各種細(xì)胞信號(hào)有關(guān),并參與細(xì)胞吞噬、生長(zhǎng)、遷移等多種生理過(guò)程。膜筏中的膽固醇動(dòng)態(tài)組裝可能是內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷因素作出反應(yīng)的重要機(jī)制,膜筏中的膽固醇聚集會(huì)引發(fā)一系列信號(hào)通路,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng),繼而導(dǎo)致AS等形成[36-37]。MF中多以受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性等為主,參與AS過(guò)程的細(xì)胞產(chǎn)生并被可溶性因子所活化,且有研究指出促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子失調(diào)可能會(huì)是AS發(fā)展的原因之一[38]。

KEGG富集分析核心通路中,以脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等為主。流體剪切應(yīng)力可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的數(shù)量增多,影響單核巨噬細(xì)胞的募集,維持炎癥反應(yīng),影響巨噬細(xì)胞的吞噬作用和細(xì)胞極化等,參與AS過(guò)程[39]。AGE與RAGE相互作用產(chǎn)生的ROS可激活NF-κB,從而激活如TNF-α、IL-6等促炎因子。ROS本身也能促使ICAM-1、VCAM-1的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)AS發(fā)生所需的生物分子的表達(dá)[40]。NF-κB信號(hào)通路主要是對(duì)TNF-α、IL-1和IL-18等促炎性細(xì)胞因子作出應(yīng)答,Kanters等[41]使用IKK2缺失的LDLR缺陷小鼠研究發(fā)現(xiàn),抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB通路活化可導(dǎo)致小鼠AS病變更加嚴(yán)重。這一結(jié)果與抗炎和抗AS細(xì)胞因子IL-10的顯著減少密切相關(guān),表明一定水平的NF-κB激活對(duì)控制炎癥反應(yīng)和抵消原AS過(guò)程是必要的。

本研究表明桂枝湯的核心有效成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇等通過(guò)對(duì)脂多糖反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)缺氧反應(yīng)等過(guò)程的調(diào)控作用啟動(dòng)AGE-RAGE信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、流體剪切力和動(dòng)脈粥樣硬化、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等發(fā)揮對(duì)AS的改善作用,體現(xiàn)出桂枝湯從多通道多角度治療AS的特點(diǎn),同時(shí)也從分子機(jī)制上論證了調(diào)和營(yíng)衛(wèi)法確實(shí)能夠治療AS,為后續(xù)通過(guò)調(diào)和營(yíng)衛(wèi)法治療AS提供依據(jù)。