劉雪莉, 胡雪峰

(福建師范大學生命科學學院,福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學重點實驗室, 福州 350117)

器官移植是治療終末期器官衰竭的有效方法。雖然我國每年有大量患者需要進行器官移植,但是在傳統(tǒng)文化、倫理道德,以及社會心理等多重綜合因素的影響下,愿意進行遺體捐贈提供供體器官的數(shù)量十分稀少。這種器官移植供需關系的嚴重失衡使患者獲得器官移植的機會很小,且等待移植的時間過長,導致許多患者至死都未能等到合適移植的器官。而異種器官移植則有望成為解決移植供需關系嚴重失衡問題的有效方案。

早在二十世紀初,就有人試圖將動物作為臨床移植器官供體。例如,在1905年,法國的Princeteau將兔腎移植到人身上,患者在術(shù)后的第16 d出現(xiàn)排斥反應死亡[1]。而由于非人靈長類動物(non-human primates,NHPs)與其他物種相比在進化上更接近人類,故在20世紀的20～90年代,科學家們進行了大量涉及NHPs(主要是黑猩猩)的移植實驗。在20世紀60年代,Reemtsma曾嘗試將黑猩猩的腎移植到患者體內(nèi);1964年,Hardy進行了第1例人類心的移植手術(shù)——將黑猩猩的心移植到人體內(nèi);1966年,Starzl進行了第1例人類肝的移植手術(shù)——將黑猩猩的肝移植到人體內(nèi)[2]。在這些實驗中,NHPs的移植物在患者體內(nèi)的存活時間非常短,最終均以失敗告終。人們逐漸意識到NHPs作為移植器官來源存在著一系列不足:(1)NHPs的數(shù)量相比于需要器官移植的龐大患者人群來說遠遠不足,且NHPs繁殖率低,世代周期長,一胎產(chǎn)仔數(shù)少;(2)飼養(yǎng)成本高;(3)器官尺寸與人類不匹配;(4)感染人畜共患病的風險較高;(5)NHPs與人類親緣關系較近會帶來倫理問題。鑒于上述問題,人們開始尋找適合的非NHPs的供體物種。而豬憑借其種類豐富,繁殖能力出色,遺傳性狀穩(wěn)定,與人相似的解剖學和生理學指標等先天優(yōu)勢,成為優(yōu)質(zhì)的移植器官供體。

1 豬作為移植器官供體的天然優(yōu)勢

小型豬是一種優(yōu)秀的實驗材料,廣泛應用于心血管疾病和消化系統(tǒng)疾病的研究以及器官異種移植等領域[3-6]。中國遼闊的國土面積和龐大的養(yǎng)豬業(yè)使得其具有豐厚的小型豬資源。此外,由于我國小型豬多產(chǎn)于偏遠山區(qū), 當?shù)鬲毺氐牡貏莸孛彩沟眯⌒拓i具有天然的封閉群特性和高度近交等先天優(yōu)勢。用于移植實驗的小型豬體型矮小(成年后一般為40～80 kg),食性廣泛,雜食,食量大,性格溫順,具有與人相似的解剖學和生理學指標(Table 1),體現(xiàn)出其他實驗動物不可替代的優(yōu)越性,國內(nèi)目前使用的小型豬主要有五指山小型豬、巴馬小型豬、陸川小型豬、貴州小型豬、版納微型豬、藏香小型豬、蕨麻小型豬等品系,而且各種品系的小型豬種源單一,長期以高度近交的方式繁殖,遺傳性狀穩(wěn)定,自然情況下平均壽命為15 年左右[7, 8]。小型豬的繁殖能力出色,初配年齡早(約為155～190 d),發(fā)情周期短(約21 d),發(fā)情持續(xù)時間長(持續(xù)約3 d),每窩產(chǎn)仔數(shù)較多(約6～8頭)且存活率高[9]。同時,由于豬和人在進化上的親緣關系相距較遠,受者患人畜共患病的風險較小,且與使用NHPs作為移植器官供體相比,使用豬引發(fā)的倫理爭議較少。

Table 1 The ratio of organ weights between pigs and human[8]

2 豬器官移植的生理學障礙克服

豬器官移植入人類或NHPs體內(nèi)后會出現(xiàn)一系列生物學障礙,例如免疫細胞引起的排斥反應、補體對移植物的攻擊、豬異種抗原引起的排斥反應、凝血功能障礙和炎癥反應等。而這些障礙目前已通過基因工程技術(shù)和藥物抑制等手段得以克服。

2.1 抑制免疫細胞引起的排斥反應

在接受豬器官移植后,受體中的免疫細胞,例如自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)、巨噬細胞和T細胞會浸潤異種移植物,從而引發(fā)免疫排斥反應。

2.1.1 抑制NK細胞引起的排斥反應 NK細胞能區(qū)分自身細胞和異體細胞,并自發(fā)溶解異體細胞(不需免疫系統(tǒng)的指令或其他細胞的配合),這使它們能識別豬器官移植物并引發(fā)排斥反應。在豬器官移植入人體內(nèi)時,NK細胞通過直接接觸裂解或激活豬的內(nèi)皮細胞,促進促炎因子的分泌,誘導豬主動脈內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生變化[10]。此外,NK細胞也可通過表面的受體FcγRIII(CD16)識別沉積在移植物內(nèi)皮上的IgG抗體復合物,隨后釋放出細胞毒性物質(zhì)(穿孔素和顆粒酶),穿孔素在移植物細胞表面形成穿孔,使顆粒酶更易進入移植物的細胞中,誘導其凋亡[11]。

已有報道稱,在豬內(nèi)皮細胞中表達人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-Cw4,雖然降低了NK細胞黏附和細胞毒性,但不足以完全克服NK細胞的細胞毒性[12]。而在α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(glycoprotein alpha-galactosyltransferase 1,GGTA1)基因敲除豬的細胞中表達HLA-G1,可以有效抑制NK細胞的活化和增殖,減輕NK細胞對移植物的排斥[13]。此外,HLA-E與其在NK細胞上的主要受體NGK2A之間的相互作用能抑制NK細胞的細胞毒性和細胞因子的產(chǎn)生,因此,在豬心細胞中表達HLA-E能顯著降低人血灌注過程中NK細胞對心肌的浸潤,更好地保留心血管的功能[14]。

2.1.2 抑制巨噬細胞引起的排斥反應 巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)的一部分,存在于許多人體器官中(例如肺、腎、骨髓和心血管)。巨噬細胞主要通過兩種機制在豬器官進入受體后引發(fā)排斥反應[15]:一種是通過激活T細胞促進異種移植排斥反應的發(fā)生。經(jīng)巨噬細胞處理并呈遞的抗原能激活部分T細胞,促使T細胞產(chǎn)生能促進巨噬細胞滲透、破壞異種移植物的趨化因子或細胞因子。另一種是通過巨噬細胞自身的細胞毒性促使排斥反應的發(fā)生。巨噬細胞能通過一氧化氮以及自身分泌的細胞因子,例如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素(interleukin, IL)-1β等介導自身的細胞毒性[16, 17]。

Kogata等人[18]在豬主動脈內(nèi)皮細胞中表達人類CD177,有效地抑制了M1巨噬細胞介導的異源性排斥反應。此外,在豬內(nèi)皮細胞上表達HLA-E亦能使移植物免受巨噬細胞的細胞毒性[19]。而Sakai等人[20]的體外研究結(jié)果表明,在豬細胞上表達人CD200能抑制巨噬細胞介導的吞噬作用和細胞毒性。Toyama等人[21]發(fā)現(xiàn),將人表面活性劑蛋白A在豬內(nèi)皮細胞上異位表達,能有效抑制異種移植中巨噬細胞介導的排斥反應。

2.1.3 抑制T細胞介導的排斥反應 將豬的器官移植入NHPs體內(nèi)后,受者體內(nèi)會產(chǎn)生由T細胞介導的排斥反應,這種反應將導致移植物中T細胞的滲透。而免疫抑制劑不能很好地抑制T細胞介導的排斥反應,且過度使用免疫抑制劑(例如抗人胸腺淋巴細胞球蛋白)容易增大細菌感染的風險。共刺激阻滯劑(例如抗CD154單克隆抗體,抗CD40抗體等)雖然能通過阻斷CD40-CD154信號通路抑制T細胞介導的排斥反應,但是它們的使用容易增大出現(xiàn)并發(fā)癥的風險。

與使用共刺激阻滯劑相比,對豬進行基因修飾能更安全地抑制T細胞介導的排斥反應。通過在GGTA1基因敲除豬的細胞中表達HLA-G1,從而抑制T細胞的活化和增殖,減少移植物受到的由T細胞介導的排斥反應[13]。研究證明,敲除豬的β2M和CIITA基因會顯著降低它對人T細胞應答的免疫原性,從而有效緩解異基因免疫應答[22]。體內(nèi)表達突變的人類CIITA基因能減少豬的血管內(nèi)皮細胞上豬白細胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA)II類的表達,從而抑制T細胞介導的排斥反應[23]。敲除豬的主要組織相容性復合體I(major histocompatibility complex I,MHC I)類蛋白質(zhì)也被證明能抑制T細胞介導的排斥反應[24]。

2.2 抑制人類補體的激活

補體調(diào)節(jié)蛋白(complement regulatory protein,CRP)能保護細胞免受補體的攻擊,但其具有物種特異性,故豬的CPR無法阻止人類補體攻擊移植物。研究表明,在人體內(nèi)預先存在的抗體與豬內(nèi)皮細胞結(jié)合后,補體系統(tǒng)被激活,進而引起免疫排斥反應攻擊移植物[25]。

環(huán)孢菌素、甲基潑尼龍等藥物能耗盡或抑制補體的激活,但同時會顯著提高人體感染的風險[26]。與藥物相比,基因工程技術(shù)能更好地使豬器官免受補體系統(tǒng)的攻擊——將人類CRP的基因引入豬體內(nèi)能在很大程度上阻止靈長類(包括人類和NHPs)補體對移植物的損害,例如,在GGTA1基因敲除豬的主動脈內(nèi)皮細胞上表達人類的CD46,能有效抑制全身補體激活,防止補體介導的細胞裂解,保護移植物免受補體依賴的細胞毒性的影響[27]。人類CD55在調(diào)節(jié)由抗原—抗體復合物通過經(jīng)典途徑引起的補體活化中發(fā)揮重要作用,故人類CD55在豬上的表達能保護移植物免受補體介導的裂解或溶血[28, 29]。

2.3 維持凝血系統(tǒng)平衡

凝血功能失調(diào)是阻礙豬移植物存活的一個主要障礙,豬器官移植入受體后,抗體和補體介導內(nèi)皮激活,使豬的血管內(nèi)皮細胞從正?？鼓隣顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌隣顟B(tài),導致凝血功能失調(diào)。凝血功能失調(diào)會引起血栓性微血管病,該病表現(xiàn)為纖維蛋白沉積和血小板聚集,移植器官的血管被血栓阻塞,最終導致組織缺血性壞死。隨著凝血功能失調(diào)愈發(fā)嚴重,凝血因子被耗盡,可能會發(fā)生足以致命的消耗性凝血障礙[30]。

通過對豬進行基因工程使其免受凝血功能失調(diào)的影響:將人類凝血調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)基因(例如血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin,TBM)、內(nèi)皮蛋白C受體、組織因子抑制物、CD39)導入豬體內(nèi),從而維持移植物中的促凝與抗凝系統(tǒng)平衡[29, 31-33]。例如在表達人類CD39的豬的富血小板血漿中,由ADP和膠原誘導的血小板聚集顯著延遲,即人類CD39在豬上的表達有效預防了血小板介導的血栓形成[29]。因為豬血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)與靈長類動物血小板糖蛋白Ib不相容,所以,患者移植豬器官后體內(nèi)血小板活化和消耗增加,最終導致血小板減少癥。據(jù)報道,人VWF在豬肺和肝中的表達顯著抑制了血小板粘附和活化,進而減輕了血小板減少癥和凝血失調(diào)的癥狀[34]。

此外,古古甾酮和阿托伐他汀可以抑制血管細胞中組織因子(tissue factor,TF)的表達和血栓形成,即具有抗凝血作用[35, 36]。Cimeno等人[37]將基因修飾和藥物治療結(jié)合,將表達人類內(nèi)皮細胞蛋白C受體、TBM、CD47、CD46、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的基因并敲除GGTA1基因的豬,用去氨加壓素和氯膦酸鹽脂質(zhì)體進行預處理,使得灌注人血的豬肝在體外能維持較長時間的生理學活性和促凝與抗凝系統(tǒng)的平衡,說明該組合方案能有效保護移植入人體的豬肝移植物。

2.4 抑制炎癥反應

即使是很小的豬移植物(例如動脈補片)也會引起受體的炎癥反應,且炎癥反應被證明會增強凝血功能失調(diào)[38]。某些藥物可以減少炎癥反應,例如治療自身免疫性疾病的藥物(甲氨蝶呤,他克莫司等)、IL-1受體拮抗劑(阿那白滯素)、靶向抑制IL-1β的單克隆抗體(卡那單抗)、他汀類藥物(例如瑞舒伐他汀、西利伐他汀等)、組蛋白去乙?；敢种苿?例如ITF2357、SAHA、ITF2357等)、抗凝劑和溶栓劑(例如活化蛋白C、肝素等)、補體激活抑制劑(例如依庫珠單抗、甲磺酸萘莫司他等),但這些藥物在抑制炎癥反應的同時也會降低宿主抵御感染的能力[39]。

人和豬的TBM之間存在分子不相容,故在豬細胞上的表達人TBM對維持抗凝狀態(tài)和抑制移植后的炎癥有重要意義[40]。HO-1及其衍生物具有抗凋亡和抗炎作用。人類TNF-α誘導蛋白3(TNF alpha induced protein 3, TNFAIP3)具有雙重的細胞保護功能,即防止TNF誘導的細胞凋亡和阻斷NF-kB活化以抑制炎癥反應[41]。故將人TNFAIP3或HO-1基因引入豬體內(nèi)能保護移植物免受全身炎癥反應[42, 43]。

2.5 滅活豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒

接受同種器官移植有較大的病毒感染風險,例如巨細胞病毒,BK病毒、乙肝病毒和HIV病毒等均可能隨供體器官進入人體,引發(fā)嚴重后果[44]。而與由人類提供的同種器官相比,專門為器官移植而準備的豬器官更加安全,供體豬在指定的無病原體室內(nèi)設施中繁殖、飼養(yǎng)和管理,以確保所有已知并被認為有害的微生物沒有隨器官轉(zhuǎn)移。

但即便如此,豬器官中仍可能有潛在的病毒,例如豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retroviruses,PERVs)。PERV是一種在豬的各種組織和器官中均有表達的RNA病毒,該病毒可能會導致宿主出現(xiàn)免疫缺陷,PERV在體外可以感染人的某些細胞系(例如T細胞、B細胞系等),故人們擔心PERV會通過豬的器官轉(zhuǎn)移到人體內(nèi),進而致人患病[45]。雖然暫無PERV致人患病的報道,但是,目前豬器官移植的臨床案例較少,不能完全排除PERV在豬器官移植過程中感染人體的可能。目前已能通過基因工程滅活PERV,例如運用CRISPR-Cas9技術(shù)滅活PERV,用小干擾RNA技術(shù)抑制PERV的激活等[46, 47]。

3 基因工程技術(shù)優(yōu)化了異種移植適用豬的構(gòu)建方案

在過去二十年間,基因工程技術(shù)迅速發(fā)展,該技術(shù)是構(gòu)建異種移植適用豬的優(yōu)質(zhì)方案,常用于修飾異種移植供體豬的基因(Table 2),例如用于敲除3種在豬器官和組織中大量表達且引起異種移植免疫排斥的主要抗原GGTA1,胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase, CMAH)和β1,4 N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶2(β-1,4-N- acetylgalactosyltransferase 2, β4GalNT2)。

20世紀90年代初,人們通過顯微注射技術(shù)生產(chǎn)出一只表達人類CD55蛋白的豬,這首次證明了對豬進行基因工程是克服異種移植中產(chǎn)生的生物學障礙的有效手段[48]。顯微注射涉及將數(shù)千個 DNA 拷貝注射到受精卵的原核中;將受精卵轉(zhuǎn)移到受體中,并篩選后代的外源 DNA 整合和表達,其存在低效(只能獲得1%～4%的轉(zhuǎn)基因后代)、耗時、需要大量財力物力等缺點,這些問題極大地阻礙了這項技術(shù)在豬基因修飾上的應用。此后,研究人員開始使用人造核酸酶,例如鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN),對豬基因進行修飾,二者都是通過蛋白質(zhì)識別特定的DNA序列,再用核酸酶切割該序列,該過程利用細胞的同源重組和非同源末端連接機制,引入或刪去靶序列上的特定DNA片段。Hauschild等人和Xin等人就曾分別通過ZFN和TALEN技術(shù)敲除了豬的GGTA1基因[49, 50]。而Lutz等人更是運用ZFN技術(shù)實現(xiàn)了豬GGTA1和CMAH基因的雙敲除,與僅敲除GGTA1基因的豬外周血單個核細胞相比,雙敲除GGTA1和CMAH基因的豬外周血單個核細胞與人IgG的結(jié)合減少,人血清對其的毒性降低,說明在敲除GGTA1基因的基礎上,進一步敲除CMAH基因可以更好地抑制豬器官移植后出現(xiàn)的排斥反應[51]。

Table 2 Benefits of genetic engineering techniques for xenotransplantation in pigs

Table 3 Experiments of pig organ transplantation into the human body

但大量活性ZFN的設計和組裝過程復雜,工程量大,基因打靶效率相對較低;而與ZFN相比,TALEN具有較為容易的構(gòu)建過程和較高的基因編輯成功率,但要克隆出大且重復性高的TALE蛋白序列仍很困難[52]。2013年,Church的研究組首次使用成規(guī)律的間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)技術(shù),完成了RNA介導的人類基因組編輯[53]。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)更是為3基因敲除豬(GGTA1,CMAH和β4GalNT2)的構(gòu)建提供了更加高效、安全的方案,最大限度地減少異種移植的抗體屏障[54]。近年來,CRISPR基因編輯技術(shù)作為一種新的基因組編輯技術(shù),被證明能用更短的時間、更高的效率對一只豬的一個或多個基因進行修飾,以解決豬器官移植中逆轉(zhuǎn)錄病毒傳播、免疫排斥、凝血功能失調(diào)和炎癥反應等問題[55, 56]。日漸成熟的基因工程技術(shù)降低了構(gòu)建異種移植適用豬的成本,使對豬基因進行的修飾更加高效和安全,顯著優(yōu)化了異種移植適用豬的構(gòu)建方案。

4 問題與展望

綜上所述,目前已能應用基因工程和免疫抑制藥物等手段,克服豬移植物進入受者體內(nèi)后出現(xiàn)的生物學障礙,且基因工程技術(shù)的日漸完善顯著優(yōu)化了異種移植適用豬的構(gòu)建方案。但至今所做的異種移植實驗大多是將豬器官移植到非人類靈長類動物(例如狒狒[57]、黑猩猩[2])體內(nèi),而這些實驗尚不能完美地模擬豬器官移植入人體的狀況,所以人們開始嘗試臨床實驗——將基因修飾豬的器官移植入人體(Table 3)。在這些研究中豬器官在患者體內(nèi)的存活時間顯著延長,且發(fā)揮出了一定的生物學功能,例如2021年,Porrett與其同事將轉(zhuǎn)基因豬的雙腎移植到腦死亡的患者身上,在術(shù)后的72小時內(nèi),右腎能產(chǎn)生尿液,但腎小球濾過率很低,且隨著時間的推移尿流量減少[62]。這次研究顯示了豬器官異種移植的巨大進展,并為豬器官移植進入臨床研究提供了科學依據(jù),但與此同時也提出了新的問題——腦死亡患者是否可以用作人體試驗的中間過渡模型,即這類患者是否能正確反映人體正常生理指標。

最近,在美國食品和藥物管理局咨詢委員會上,大多數(shù)與會者的態(tài)度預示著基因工程豬的異種移植有望迎來臨床試驗階段。但在豬器官異種移植真正進入臨床實驗階段前,尚需一些準備,除了要繼續(xù)完善科學技術(shù)以維持移植物的生理學活性和存活時間外,還要國家制定異種移植相關的法律法規(guī),確保豬器官異種移植進入臨床后的規(guī)范化操作,最終實現(xiàn)豬器官移植到人體的臨床應用,為終末期器官衰竭患者的治療提供有效方案。