李心珠，谷春梅*，于寒松，董鵬超，鮑云翔

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）（2.國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系加工研究室，吉林長春 130118）

大豆含有豐富的蛋白質(zhì)和各種必需氨基酸，是主要的工業(yè)原材料及經(jīng)濟作物。同時富含多種抗營養(yǎng)因子，其中大豆胰蛋白酶抑制因子（Soybean Trypisin Inhibitor，STI）是一種很重要的抗營養(yǎng)因子，包括Kunitz 胰蛋白酶抑制因子（Kunitz Trypsin Ihhibitor，KTI ）和 Bowman-Birk 胰蛋白酶抑制因子（Bowman-Birk Inhibitor，BBI）[1]。一方面，其與胰蛋白酶、糜蛋白酶相互作用，形成一種不易降解的穩(wěn)定復(fù)合體，導致蛋白質(zhì)的消化吸收與利用減弱。另外，因為人體蛋白酶降低，造成體內(nèi)含硫氨基酸降低，引起胰腺腫大、免疫功能下降等，危害人類及動物健康，制約各行業(yè)大豆利用率[2]，因此對其檢測勢在必行。目前對于KTI 的檢測有脲酶檢測、酶化學檢測法，酶聯(lián)免疫吸附試驗是目前最廣泛的一種免疫檢測法，用于大豆抗營養(yǎng)成分測定[3,4]，通過酶高效催化作用，使抗體的特異性結(jié)果放大。由于抗體合成成本高以及本身易受到外界環(huán)境的干擾，因此，有必要建立高效的KTI 檢測技術(shù)。

作為一種新型信號分子，核酸適配體具有高親和力、易于合成修飾、成本低、靶標范圍大等優(yōu)點[5-8]，使其在蛋白質(zhì)作用研究[9-11]、環(huán)境監(jiān)控[12-14]、食品安全檢測[15-17]等眾多領(lǐng)域受到了廣泛重視[18]。核酸適配體作為寡核苷酸片段與靶分子結(jié)合，通過構(gòu)建適配體生物傳感器將結(jié)合信號轉(zhuǎn)化為易于檢測的信號[19]，分為熒光適配體傳感器[20-22]、比色適配體傳感器[23,24]、電化學適配體傳感器[25,26]等。目前納米材料被用于多種方面[27]，由于其靈敏、操作簡單等被作為輔助元件[28]。CNPs 為其中一種，具有價格低廉、生物相容性好、無毒害等優(yōu)點[29]。由于CNPs 具有納米尺度和碳物質(zhì)特性，對平面型染料分子的作用強，利用π-π堆積作用，可以使單鏈DNA 在其表面產(chǎn)生強烈的吸附，吸附在CNPs 表面上的熒光團通過電子或能量轉(zhuǎn)移被有效淬滅，因此CNPs 作為熒光淬滅劑，將為生物分子熒光識別技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)[30]。

近年來，核酸信號放大技術(shù)廣泛用于不同物質(zhì)的分析檢測，其中ExoIII能不斷催化降解雙鏈DNA，并特異性催化其從3’末端水解[31]，其信號放大不需要特定的識別序列，適用于生物傳感平臺的構(gòu)建，已被用于核酸[32,33]、金屬離子[34]、有機物[35]等的檢測。本研究構(gòu)建一種ExoIII信號放大技術(shù)與CNPs 結(jié)合的方法，實驗原理如圖1 所示，由KTI 適配體、cDNA、SP、ExoIII和CNPs 5 個部分組成。不存在KTI 時，APT 與cDNA 產(chǎn)生互補雙鏈，SP 為單鏈結(jié)構(gòu)，加入CNPs 后，SP 被CNPs 吸附淬滅；當KTI 存在時，KTI與APT 結(jié)合，cDNA 和SP 互補成雙鏈，無法被CNPs吸附，SP 依然呈現(xiàn)熒光態(tài)，同時ExoIII在3’末端對其進行降解，并通過ExoIII的周期性切割釋放出大量熒光團，使熒光強度得到明顯提高，基于此可對KTI進行靈敏檢測。

圖1 熒光適配體生物傳感器檢測原理圖Fig.1 Fluorescence aptamer biosensor detection schematic

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KTI、BBI、SBA標準品，均購于美國Sigma-Aldrich公司；碳納米顆粒，購于北京德科島金；核酸外切酶III，購于蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；豆?jié){；DNA 序列，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。據(jù)文獻報道，在3’-端的雙鏈DNA 必須至少有4 個不匹配的堿基，以阻止ExoIII的水解[36]。因此將4 個胸腺嘧啶T 添加到APT 與cDNA 的3’-端，以阻止ExoIII的DNA 水解，表1 是用于實驗的所有序列。

表1 DNA 序列Table 1 DNA sequences

1.2 儀器與設(shè)備

MB-102 恒溫金屬振蕩浴，杭州博日科技有限公司；YHZ-112B 恒溫振蕩培養(yǎng)搖床，蘇州市國飛儀器有限公司；infinitieM200型多功能酶標儀，Nano Quant；TGL-16 型高速臺式離心機，上海安亭儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 熒光適配體生物傳感器檢測KTI

首先，將APT、cDNA、SP 的濃度分別配置為0.2、0.2、1 μmol/L，取50 μL APT 與50 μL 的KTI 溶液進行混合，其中KTI 的質(zhì)量濃度為200 ng/mL，室溫反應(yīng)1 h；然后分別取50 μL cDNA 和50 μL SP 加入到上述混合物中，在室溫下反應(yīng)30 min；最后，添加含40 U ExoIII的緩沖液100 μL，對SP進行消化，在37 ℃條件下反應(yīng)2 h；當酶解結(jié)束以后，將體系加熱到75 ℃進行5 min 后停止反應(yīng)；然后，在反應(yīng)混合物中添加200 μL 的CNPs 溶液，最后的體積是500 μL，并在37 ℃黑暗的條件下培養(yǎng)該混合物30 min[37]。熒光發(fā)射光譜測試條件為：激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長范圍為500～640 nm，入射狹縫以及出射狹縫寬度為5 nm。依照523 nm 處的峰值強度對KTI 的濃度做定量分析。

1.3.2 CNPs 質(zhì)量濃度的優(yōu)化

CNPs 在本研究中用作檢測平臺，它的質(zhì)量濃度是影響檢測結(jié)果的主要因素。如果系統(tǒng)中CNPs 質(zhì)量濃度太低，無法有效地消除未被水解的信號探針SP的熒光，從而使背景熒光強度太高影響檢測限；在質(zhì)量高濃度下淬滅過大會使測定結(jié)果不精確，所以必須優(yōu)化CNPs 的質(zhì)量濃度。CNPs 的添加質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL，采用與上述1.3.1 熒光適配體生物傳感器檢測KTI 相同的方法進行測定。

1.3.3 可行性試驗

核酸外切酶III作為一種切割酶，具有高效的酶催化活性，對靶標循環(huán)有促進作用[38]。為了增加檢測的靈敏度，使用ExoIII對熒光信號進行輔助放大，為了驗證該方法是否可行需對其進行試驗分析，試驗共分為a、b、c、d 四組，試劑組合如下表2 所示，其中沒有添加的試劑被ddH2O 取代，KTI 的質(zhì)量濃度是200 ng/mL，最終體積為500 μL，反應(yīng)過程同1.3.1。

表2 試劑及組合Table 2 Reagent and combination

1.3.4 特異性研究

為了檢驗該方法對KTI 的特異性，分別加入質(zhì)量濃度為200 ng/mL 的KTI、BBI、SBA 標準溶液，其余操作與1.3.1 相同。通過比較不同種類的KTI 類似物存在時，體系的相對熒光強度大小來判斷本方法的選擇性。

1.3.5 豆?jié){樣品中KTI 加標回收測定

取豆?jié){樣品作為檢測對象，驗證體系在實際樣品中的實用性，具體方法如下：用ddH2O 將豆?jié){配置為φ=1%的緩沖體系，加入不同量的KTI 溶液，KTI 的質(zhì)量濃度為50、100、500 ng/mL，獲得了一系列濃度的加標KTI 標準溶液。將APT、cDNA、SP 的濃度分別配置為0.2、0.2、1 μmol/L，取50 μL APT 與50 μL 加標KTI 溶液進行混合，室溫反應(yīng)1 h；分別取50 μL cDNA 和50 μL SP 加入到上述混合物中，在室溫下反應(yīng)30 min；然后，添加含40 U ExoIII的緩沖液100 μL，消化SP，在37 ℃條件下反應(yīng)2 h；當酶解結(jié)束以后，將體系加熱到75 ℃進行5 min 后停止反應(yīng)；最后，在反應(yīng)混合物中添加200 μL 的CNPs 溶液，反應(yīng)總體積為500 μL，并在37 ℃黑暗的條件下培養(yǎng)該混合物30 min，測試條件同1.3.1。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗中的分析數(shù)值均采用三次平行試驗進行處理，以“平均值±標準差”表示；采用Origin 2021 和GraphPad Prism 8 軟件繪圖；采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 CNPs 質(zhì)量濃度優(yōu)化結(jié)果

CNPs 是傳感器的檢測平臺，其質(zhì)量濃度對檢測結(jié)果有重要影響[39]，因此需要對其質(zhì)量濃度進行優(yōu)化。圖2 為體系中加入不同濃度的CNPs，KTI 是否存在的條件下熒光強度值的變化，其中紅色柱狀為添加KTI 溶液時的熒光強度，黃色柱狀為未添加KTI 時的熒光強度。從圖2 中可以看到，CNPs 質(zhì)量濃度越來越高，系統(tǒng)的熒光強度逐漸降低，CNPs 質(zhì)量濃度為40 μg/mL 時，熒光強度顯著高于其他更高質(zhì)量濃度（P＜0.05），當CNPs 質(zhì)量濃度達到60 μg/mL 后，質(zhì)量濃度增大對熒光強度的變化影響不顯著，逐漸趨于平穩(wěn)。是因為隨著CNPs 質(zhì)量濃度的增加，熒光信號被大量淬滅。

圖2 CNPs 在不同質(zhì)量濃度下的熒光強度對照圖Fig.2 Comparison of fluorescence intensity of CNPs at different mass concentrations

如圖3 所示為體系的相對熒光強度，呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，當CNPs 質(zhì)量濃度為60 μg/mL 時，相對熒光強度值最高，為1.0 左右，與其他數(shù)據(jù)之間具有顯著差異（P＜0.05），之后的相對熒光強度沒有顯著差異（P＞0.05），因此選擇60 μg/mL 作為最終的優(yōu)化結(jié)果。與馮婷婷等[40]基于CNPs 傳感器檢測腺苷脫氨酶實驗結(jié)果相比，CNPs 優(yōu)化質(zhì)量濃度相似。

圖3 CNPs 在不同質(zhì)量濃度下的相對熒光強度Fig.3 The relative fluorescence intensity of CNPs at different mass concentrations

2.2 方法可行性分析

為了考察實驗方法的有效性，該實驗采用了檢測體系中是否出現(xiàn)ExoIII時對熒光強度的影響來檢驗實驗方法的準確性，如圖4 所示。在體系中不具有ExoIII時，加入KTI 與不加入KTI 的熒光強度對比有較小范圍的不同（圖4 中的b、c），但KTI 的引入使適配體與KTI 結(jié)合，cDNA 與信號探針SP 互補，由此產(chǎn)生了雙鏈DNA，不能完全被CNPs 吸附，從而增加了溶液的熒光強度；當體系中加入ExoIII時，體系與CNPs 進行酶促切割，從而使檢測信號放大，熒光強度顯著增加（圖4 中的a、d），但是體系的背景熒光沒有太大變化，此時的熒光信號是背景信號的3 倍左右。相對于沒有ExoIII的情況下，添加之后熒光信號增加約80%（圖4 中的b、d）。實驗結(jié)果顯示，利用ExoIII循環(huán)放大技術(shù)可以提高熒光信號的強度，與趙陽陽[41]實驗關(guān)于適配體生物傳感器檢測赭曲霉毒素A的可行性分析中的結(jié)果基本相同，說明此方法可行。

圖4 不同體系的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of different systems

2.3 標準曲線的繪制

方法可行性和CNPs 質(zhì)量濃度優(yōu)化試驗條件確定后，將不同質(zhì)量濃度的KTI（100～600 ng/mL）加入到檢測體系，以研究適配體生物傳感器對于KTI 檢測的靈敏度。如圖5 所示，實驗結(jié)果表明，隨著KTI 濃度的增加熒光強度逐漸增加，在此范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，檢測限（LOD）設(shè)定為三倍空白溶液的熒光信號的標準偏差，因此得出適配體生物傳感器檢測限（LOD）為12.59 ng/mL。對照現(xiàn)有KTI 檢測技術(shù)，如表3 所示，本方法對于KTI 的檢測優(yōu)于文獻報道[42]，具有更低的檢測限，靈敏度較高。

表3 本方法與現(xiàn)有檢測技術(shù)對比Table 3 This method is compared with existing detection techniques

圖5 傳感器在不同KTI 質(zhì)量濃度下的標準曲線Fig.5 The standard curve of the sensor at different KTI mass concentrations

2.4 特異性研究

選擇以下兩種KTI 類似物BBI、SBA 進行特異性試驗，通過對KTI 適配體生物傳感器的特異檢測，是測定其可靠性的一個重要參數(shù)。主要在于檢測其能特異性結(jié)合KTI 外，是否還與其他KTI 結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)結(jié)合。如圖6 所示，實驗結(jié)果表明，與其他兩種類似物BBI、SBA 相比，KTI 體系中相對熒光強度最高，為0.9 左右，與其他兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異（P＜0.05），兩種類似物的相對熒光強度較小，核酸適配體不能識別，兩者數(shù)據(jù)間沒有顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，KTI 適配體能夠進行KTI 的特異性識別，因此驗證了該適配體生物傳感器對KTI具有良好的選擇性和特異性。

圖6 KTI 的特異性試驗Fig.6 Specificity test of KTI

2.5 豆?jié){樣品中KTI 回收率試驗結(jié)果

基于這種適配體生物傳感器具有良好的檢測能力和良好的選擇性，在實際樣本中評價其檢測方法的可行性。用ddH2O 將豆?jié){配置為1%的緩沖體系，加入不同量的KTI 溶液用于分析測定，KTI 的質(zhì)量濃度分別為50、100、500 ng/mL，采用加標回收法對三種不同KTI 質(zhì)量濃度的回收率進行測定，如表4 所示。回收率介于97.42%～102.85%范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異（P＞0.05），相對標準偏差（RSD）在0.61%～2.36%之間，檢測準確度良好。結(jié)果表明ExoIII輔助放大信號檢測法對于實際樣品中的KTI表現(xiàn)出良好的檢測性能，能有效用于實際樣品的檢測。

表4 適配體生物傳感器用于豆?jié){樣品中KTI 的測定Table 4 Aptamer biosensor for the determination of KTI in soybean milk samples

3 結(jié)論

開發(fā)了一種以核酸適配體作為識別單元，核酸外切酶III作為信號放大元件以及碳納米顆粒作為信號開關(guān)的熒光型適配體生物傳感器，利用ExoIII不斷降解-雜交循環(huán)，結(jié)合CNPs 的熒光淬滅效果對檢測信號進行放大，可以有效提高KTI 檢測的靈敏度。KTI 的熒光強度與KTI 濃度之間存在著一定的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，檢測限（LOD）為12.59 ng/mL，所設(shè)計的核酸適配體生物傳感器顯示出良好的選擇性。以豆?jié){作為樣品，采用加標回收法測得回收率為97.42%～102.85%，相對標準偏差（RSD）在0.61%～2.36%之間。相對于常規(guī)的測定方法，該方法具有操作簡便、靈敏度高、專一性良好等優(yōu)點，可以作為一種新的測定方法用于實際樣品中KTI 的檢測。