董鑫蕓，謝一嘉，劉媛媛，王清瑤，肖性龍

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

生乳是未經(jīng)生產(chǎn)加工的原料奶，目前生乳執(zhí)行的是GB 19301-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 生乳》，其中要求菌落總數(shù)≤2×106CFU/g（mL）[1]，標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)菌落總數(shù)限量較寬泛，且未對(duì)大腸菌群限制。但生乳中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，極容易受到動(dòng)物體及擠奶環(huán)境微生物的污染[3]，而不合格的生乳是不允許進(jìn)入生產(chǎn)環(huán)節(jié)的。菌落總數(shù)和大腸菌群作為食品衛(wèi)生的指示性指標(biāo)[4]，因此對(duì)于大腸菌群與菌落總數(shù)的檢測(cè)則顯得尤為重要。

大腸菌群（Coliform）是指在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌[5]。目前依照GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[6]的最可能數(shù)法（Most Probable Number，MPN）和GB 4789.2-2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[7]的平板計(jì)數(shù)法對(duì)食品中的大腸菌群和菌落總數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)，需要分別進(jìn)行測(cè)定，一方面操作繁瑣、效率低，同時(shí)也增加了人力物力的消耗。而其他方法，如生物傳感器法[8]、分子生物學(xué)法[9]、免疫學(xué)法[10]等，基于它們具有快速與高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于細(xì)菌檢測(cè)，然而，這些方法需要使用精密的實(shí)驗(yàn)儀器、復(fù)雜的樣品處理與分析程序，且檢測(cè)成本高。此外，由于生乳基質(zhì)成分的復(fù)雜性，在其中檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量，難以達(dá)到理想效果，在多場(chǎng)景檢測(cè)應(yīng)用上存在較大限制?，F(xiàn)研究的復(fù)合顯色培養(yǎng)基致力于實(shí)現(xiàn)大腸桿菌和大腸菌群的同時(shí)計(jì)數(shù)[11,12]，對(duì)于大腸菌群和菌落總數(shù)同時(shí)計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基研究較少。因此，本論文意在開(kāi)發(fā)一種同時(shí)檢測(cè)大腸菌群和菌落總數(shù)的復(fù)合顯色培養(yǎng)基，以較低的成本實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高效性、簡(jiǎn)單可操作性，從而對(duì)生乳的衛(wèi)生情況進(jìn)行監(jiān)控。

傳統(tǒng)的大腸菌群監(jiān)測(cè)是基于lacZ 基因編碼的β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase，β-Gal）通過(guò)“酶-底物反應(yīng)法”進(jìn)行大腸菌群的檢測(cè)[13,14]，本研究基于該原理選用結(jié)構(gòu)與乳糖類似的鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（2-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside，ONPG）作為β-Gal 的顯色底物，ONPG 無(wú)需滲透酶存在可迅速進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，被β-Gal 水解后釋放出黃色的鄰位硝基苯酚（Orthonitrphenyl，ONP）[15]，使得平板上的大腸菌群菌落呈現(xiàn)出區(qū)分于一般菌株的顏色，以此同時(shí)進(jìn)行大腸菌群和菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)。本研究在傳統(tǒng)大腸菌群和菌落總數(shù)的平板計(jì)數(shù)方法基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了一款基于ONPG的同時(shí)計(jì)數(shù)大腸菌群與菌落總數(shù)的復(fù)合顯色培養(yǎng)基方法，提高了大腸菌群與菌落總數(shù)的檢測(cè)效率，為同時(shí)測(cè)定大腸菌群和菌落總數(shù)提供一種有效的檢測(cè)方案。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與儀器

1.1.1 菌種

本章所用菌株共13 株，具體包括大腸菌群菌株：大腸桿菌（Escherichiacoli）ATCC 25922、大腸桿菌（Escherichiacoli）O157:H7、肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）CICC 10781、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii）CMCC 48007、陰溝腸桿菌（Enterobactercloacae）CICC 21539、阪崎腸桿菌（Enterobactersakazakii）ATCC 29544、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes）CICC 10293；非大腸菌群菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC 29213、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC 6538、沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）ATCC 14028、單增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）ATCC 19117、蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）CMCC 70331、副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）ATCC 17802。均為華南理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全檢測(cè)中心保存菌株，均保存于φ=50%的甘油中，凍存在-80 ℃冰箱中。其中，大腸桿菌（Escherichiacoli）ATCC 25922、大腸桿菌（Escherichiacoli）O157:H7 作為該平板培養(yǎng)基的質(zhì)控菌株。

1.1.2 試劑

乳糖（Lactose，Lac）、葡萄糖（Glucose，Glu）、胰蛋白胨（Casein Tryptone，CT）、酵母膏粉（Yeast Extract Fermentation，YEF）、瓊脂（Agar）、氯化鈉（NaCl）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4），均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG）、ONPG，均購(gòu)自上海瑞永生物科技有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（VEBR），均購(gòu)自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器

FA-2104 分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SPX-2508-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-F100 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；XW-80A 微型漩渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠有限公司；YXQ-LS-100Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；5424 小型高速離心機(jī)，上海成貫儀器有限公司；Synergy Neo2多功能酶標(biāo)儀，北京德利卡生物技術(shù)有限公司；UV-1801紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京瑞利儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化及培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取少量-80 ℃甘油保藏的菌液后在平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床180 r/min 培養(yǎng)12 h 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)上述操作完成對(duì)13 株菌株的活化。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液經(jīng)離心并重懸至生理鹽水中，進(jìn)行梯度稀釋，獲得終濃度為101～109CFU/mL 的菌懸液。將濃度為108CFU/mL 的大腸菌群菌株混合制備大腸菌群懸液，記為“Mix1”，另將濃度為108CFU/mL 的13 株菌液混合，記為“Mix2”，置于4 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方選擇

參考GB 4789.3-2016 和GB 4789.2-2016 中培養(yǎng)基以及常規(guī)培養(yǎng)基的配方，如表1 所示，選定胰蛋白胨、酵母膏粉、NaCl、K2HPO4和KH2PO4作為本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分，其中胰蛋白胨提供氮源，酵母膏粉提供B 族維生素等生長(zhǎng)因子，NaCl 維持滲透壓平衡。由于大腸菌群會(huì)利用乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，因此需要緩沖體系來(lái)維持增菌過(guò)程中體系的酸堿平衡。最終，確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：CT 10.0 g/L、YEF 3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、K2HPO42.75 g、KH2PO41.75 g/L、ONPG 0.1 g/L，最終pH 值為6.8。培養(yǎng)基配制完成后經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌后待用，ONPG 使用0.22 μm 微孔濾膜后加入。

表1 培養(yǎng)基配方成分比較Table 1 Comparison of formula components of each culture medium

1.2.3 誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶表達(dá)的條件優(yōu)化

ONPG 是一種結(jié)構(gòu)與乳糖類似的化合物[16]，無(wú)需滲透酶的存在可迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)[17]，經(jīng)β-Gal水解生成半乳糖和黃色化合物ONP[18]。顏色的深淺與β-Gal 的活力成正比，即當(dāng)培養(yǎng)基中的大腸菌群所合成的β-Gal 含量越多，大腸菌群菌體就可以更快速地生長(zhǎng)為明顯的黃色菌體。因此，為了更優(yōu)地對(duì)大腸菌群菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，本培養(yǎng)基中需要加入合適的大腸菌群β-Gal 誘導(dǎo)劑，促進(jìn)大腸菌群乳糖操縱子的啟動(dòng)與表達(dá)。IPTG、Lac 是lacZ 的誘導(dǎo)劑，且低濃度的Glu有益于lacZ 的轉(zhuǎn)錄，因此下面將分別對(duì)上述三種物質(zhì)的影響進(jìn)行探究。

1.2.3.1 ONP 最佳波長(zhǎng)和濃度的確定

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入一定量的ONPG母液和預(yù)先配置好的菌液濃度均為1.0×108CFU/mL 大腸菌群菌液。將各組樣品置于搖床（37 ℃，180 r/min）中培養(yǎng)12 h。為測(cè)定該顯色體系對(duì)不同波長(zhǎng)的吸收大小，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)該黃色產(chǎn)物溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)（300～700 nm）掃描。

1.2.3.2 IPTG 對(duì)β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)效果的測(cè)定

為探究IPTG 對(duì)大腸菌群β-Gal 的誘導(dǎo)表達(dá)效果，設(shè)計(jì)IPTG 濃度的單因素實(shí)驗(yàn)。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同量的IPTG，再加入配置好的Mix1，使各組培養(yǎng)基中IPTG 質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 g/L。將各組樣品置于搖床（37 ℃，180 r/min）中培養(yǎng)12 h。然后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定410 nm 處的光密度。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.3.3 Lac 對(duì)β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)效果的測(cè)定結(jié)果

Lac 是β-Gal 的天然底物和間接誘導(dǎo)劑[19]，可以誘導(dǎo)大腸菌群β-Gal 的表達(dá)。為探究Lac 對(duì)大腸菌群β-Gal 的誘導(dǎo)表達(dá)效果，設(shè)計(jì)Lac 質(zhì)量濃度的單因素實(shí)驗(yàn)。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同量的Lac，再加入配置好的Mix1，使各組培養(yǎng)基中Lac 的終質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L。將各組樣品置于搖床（37 ℃，180 r/min）中培養(yǎng)12 h。然后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定410 nm 處的光密度。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.3.4 Glu 對(duì)β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)效果的測(cè)定結(jié)果

較低質(zhì)量濃度的Glu 可以促進(jìn)大腸菌群β-Gal 的表達(dá)[20]，為探究Glu 對(duì)大腸菌群β-Gal 的誘導(dǎo)表達(dá)效果，設(shè)計(jì)Glu 質(zhì)量濃度的單因素實(shí)驗(yàn)。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同量的Glu，再加入配置好的Mix1，使各組培養(yǎng)基中Glu 的終質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L。將各組樣品置于搖床（37 ℃，180 r/min）中培養(yǎng)12 h。然后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定410 nm 處的光密度。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.4 菌落生長(zhǎng)的單因素條件優(yōu)化

1.2.4.1 CT 質(zhì)量濃度的優(yōu)化

為尋求本培養(yǎng)基中合適的CT 質(zhì)量濃度，設(shè)計(jì)CT質(zhì)量濃度的單因素實(shí)驗(yàn)。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同量的CT，再加入Mix2，使各組培養(yǎng)基中CT 終質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/L。將各組樣品置于37 ℃搖床（180 r/min）中培養(yǎng)12 h。然后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 處菌懸液的光密度，以此判定該培養(yǎng)基的增菌效果。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.4.2 YEF 質(zhì)量濃度的優(yōu)化

為尋求本培養(yǎng)基中合適的YEF 質(zhì)量濃度，設(shè)計(jì)YEF 濃度的單因素實(shí)驗(yàn)。向優(yōu)化后的CT 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同量的YEF，再加入Mix2，使各組培養(yǎng)基中YEF 終質(zhì)量濃度分別為0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L。置于37 ℃搖床（180 r/min）中培養(yǎng)12 h，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 處菌懸液的光密度，以此判定該培養(yǎng)基的增菌效果。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.4.3 NaCl 質(zhì)量濃度的優(yōu)化

為尋求本培養(yǎng)基中合適的NaCl 質(zhì)量濃度，設(shè)計(jì)NaCl 的單因素實(shí)驗(yàn)。根據(jù)優(yōu)化后的CT、YEF 質(zhì)量濃度，向各組培養(yǎng)基加入Mix2，使各組培養(yǎng)基中NaCl終質(zhì)量濃度分別為0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 g/L，將各組中培養(yǎng)基分別置于37 ℃、搖床（180 r/min）中培養(yǎng)12 h。然后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 處菌懸液的光密度，以此判定該培養(yǎng)基的增菌效果。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.4.4 緩沖體系pH 值的優(yōu)化

為尋求本培養(yǎng)基中合適的pH 值，設(shè)計(jì)pH 值的單因素實(shí)驗(yàn)。用0.1 mol/L NaOH 溶液調(diào)整各組培養(yǎng)基的pH 值，再加入配置好的Mix2，使各組中pH 值分別為7.0、8.0、9.0、10.0。將各組樣品置于37 ℃搖床（180 r/min）中培養(yǎng)12 h。然后，在600 nm 和410 nm下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌的光密度。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.5 顯色培養(yǎng)基的特異性驗(yàn)證

選取13 種生乳中常見(jiàn)致病菌進(jìn)行復(fù)合顯色平板培養(yǎng)基的特異性驗(yàn)證。將活化至對(duì)數(shù)期的13 株菌株分別接種至顯色培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h、48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況及出現(xiàn)黃色產(chǎn)物情況，進(jìn)一步驗(yàn)證該復(fù)合顯色培養(yǎng)基的選擇性與特異性。

1.2.6 顯色培養(yǎng)基在生乳中的實(shí)際應(yīng)用

將Mix1和Mix2菌液離心重懸至同等體積的經(jīng)滅菌處理的生乳中制備加標(biāo)樣品，充分振勻，梯度稀釋至終濃度未102、104、106、108CFU/mL，分別接種至顯色培養(yǎng)基、PCA 培養(yǎng)基和VEBR 培養(yǎng)基中，其中，以PCA 培養(yǎng)結(jié)果記為菌落總數(shù)，以VEBR 培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果記為大腸菌群數(shù)，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法，將本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基與國(guó)標(biāo)方法中計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行比較，以此驗(yàn)證本研究研制培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSSAU 軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一致性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 大腸菌群顯色底物的最佳吸收波長(zhǎng)

黃色化合物ONP 的全波長(zhǎng)吸收情況如圖1，結(jié)果顯示該黃色化合物在波長(zhǎng)為410 nm 處有最大吸收值。顯色程度越深則表明β-Gal 的活力越高，且在該培養(yǎng)條件下對(duì)大腸菌群β-Gal 的誘導(dǎo)表達(dá)效果越佳。因此，選擇OD410作為ONP 的最佳吸收波長(zhǎng)，來(lái)判斷大腸菌群β-Gal 的誘導(dǎo)表達(dá)效果。

圖1 黃色體系的吸收光譜Fig.1 The absorption spectrum of the yellow system

2.1.2 IPTG 對(duì)β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)效果的測(cè)定結(jié)果

IPTG 是一種異丙乳糖模擬物[21]，是活性極強(qiáng)的活性誘導(dǎo)物質(zhì)[22]，因其半乳糖苷鍵中的氧被硫取代失去了水解活性，能夠不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，在缺乏滲透酶基因（lacY）的情況下也能被有效抄送至細(xì)胞內(nèi)[23]，因而能夠高效誘導(dǎo)乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。如圖2 所示，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為0.05 g/L 的IPTG，其對(duì)于β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)效果最佳。

圖2 IPTG 對(duì)大腸菌群誘導(dǎo)β-Gal 表達(dá)的效果Fig.2 Effect of IPTG on induced expression of coliform β-Gal

2.1.3 Lac對(duì)β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)效果的測(cè)定結(jié)果

乳糖經(jīng)β-Gal 作用，異構(gòu)化為異丙乳糖[24]，異丙乳糖與阻遏蛋白結(jié)合[25]致其失活，停止抑制結(jié)構(gòu)基因（lacZ）的表達(dá)，阻遏蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制作用得到解除，因此可以通過(guò)增加誘導(dǎo)劑的濃度來(lái)促進(jìn)乳糖操縱子的表達(dá)[26]。如圖3 所示，當(dāng)Lac 的添加終濃度為2.0 g/L，OD410達(dá)到最大值，則說(shuō)明此時(shí)該濃度的乳糖最有利于乳糖操縱子的表達(dá)。

圖3 Lac 對(duì)大腸菌群誘導(dǎo)β-Gal 表達(dá)的效果Fig.3 Effect of Lac on induced expression of coliform β-Gal

2.1.4 Glu對(duì)β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)效果的測(cè)定結(jié)果

Glu 可通過(guò)兩條路徑調(diào)節(jié)β-Gal 轉(zhuǎn)錄，一是通過(guò)誘導(dǎo)劑排除[25]，外源Glu 會(huì)降低乳糖滲透酶運(yùn)輸Lac的效率；二是分解代謝抑制[27]，在缺乏Glu 的情況下，腺苷酸環(huán)化酶（AC）活躍，產(chǎn)生的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）與分解代謝激活蛋白（CAP）結(jié)合，CAP 被激活后與啟動(dòng)子上游結(jié)合（這是穩(wěn)定的RNA 聚合酶結(jié)合所必須的）[28]，增加DNA 聚合酶和啟動(dòng)子的親和力，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，在缺乏Glu 的情況下，腺苷酸環(huán)化酶/cAMP/CAP 軸被激活。如圖4 所示，隨著Glu 添加濃度的增加，OD410均呈現(xiàn)不同程度的下降，因此確定培養(yǎng)基在不添加葡萄糖的情況下，對(duì)β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)效果較佳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合分解代謝抑制的原理，與Szeberenyi[28]研究結(jié)果一致。

圖4 Glu 對(duì)大腸菌群誘導(dǎo)β-Gal 表達(dá)的效果Fig.4 Effect of Glu on induced expression of coliform β-Gal

2.2 菌落生長(zhǎng)的單因素條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 CT 質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果

胰蛋白胨不僅能夠?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)提供所需氮源[29]，同時(shí)還能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系的pH 值[30]，能夠?qū)τ诖竽c菌群產(chǎn)酸導(dǎo)致體系pH 值降低起到一定緩沖作用，使得培養(yǎng)體系中除大腸菌群外的菌株能夠正常增殖。另一方面，胰蛋白胨較蛋白胨顏色淺，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾較小。如圖5 所示，隨CT 濃度的增加，細(xì)菌的生長(zhǎng)情況逐漸向好，當(dāng)CT 的添加量≥12.5 g/L，CT 添加濃度增加，細(xì)菌的光密度基本保持不變。因此，將12.5 g/L 確定為培養(yǎng)基CT 的最佳添加濃度。

圖5 CT 質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effect of CT on bacterial growth

2.2.2 YEF 質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果

酵母浸粉含有促生長(zhǎng)因子[31]，因此有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。如圖6 所示，隨YEF 濃度的增加，細(xì)菌的生長(zhǎng)情況逐漸向好，當(dāng)YEF 的添加量≥2.5 g/L，YEF 添加濃度增加，細(xì)菌的光密度基本保持不變，基于酵母浸粉黃色，添加過(guò)量會(huì)影響菌落的觀察，因此，將2.5 g/L確定為培養(yǎng)基YEF 的最佳添加濃度。

圖6 YEF 質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 The effect of YEF on bacterial growth

2.2.3 NaCl 質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果

NaCl 為細(xì)菌生命活動(dòng)提供無(wú)機(jī)鹽，對(duì)維持細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡具有重要作用[32]。NaCl 濃度較低時(shí)，不足以提供給細(xì)菌生命活動(dòng)足量的無(wú)機(jī)鹽，同時(shí)細(xì)菌細(xì)胞吸水膨脹；濃度過(guò)高時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞處于失水狀態(tài)。合適的NaCl 濃度對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖具有重要意義。如圖7 所示，當(dāng)NaCl 濃度為5.0 g/L 時(shí)，細(xì)菌表現(xiàn)出較為良好的生長(zhǎng)情況。

圖7 NaCl 質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 The effect of NaCl on bacterial growth

2.2.4 緩沖體系pH 值的優(yōu)化結(jié)果

中性及堿性條件下，ONP 顯黃色，但大腸菌群發(fā)酵產(chǎn)酸，因此選擇合適的緩沖體系對(duì)顯色結(jié)果尤為重要。初始pH 值會(huì)影響ONP 的顯色效果，但同時(shí)也會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。如圖8 所示，當(dāng)緩沖體系的pH值為8.0 時(shí)，410 nm 處吸光度值達(dá)到最大值，但pH值8.0 不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此最終仍選擇（7.0±0.2）作為培養(yǎng)基緩沖體系的pH 值。

圖8 緩沖體系pH 值對(duì)顯色結(jié)果的影響Fig.8 The effect of buffer system pH on coloration

2.3 顯色培養(yǎng)基特異性驗(yàn)證結(jié)果

如表2 所示，利用復(fù)合顯色培養(yǎng)基對(duì)13 株細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，僅7 株大腸菌群菌株的顯色培養(yǎng)基形成黃色至橙色的菌落（圖9b、9c），其它6 株種牛奶中常見(jiàn)的致病菌在該培養(yǎng)基上均能夠正常生長(zhǎng)，但其菌落均為乳白色（圖9a）。因此，該復(fù)合顯色培養(yǎng)基對(duì)于大腸菌群具有特異性。

圖9 不同細(xì)菌的培養(yǎng)和顯色情況Fig.9 Culture and chromogenic results of different bacteria

圖10 實(shí)驗(yàn)方法和國(guó)標(biāo)方法的Bland-Altman 圖Fig.10 Bland-Altman plot of experimental method and national GB method

表2 顯色培養(yǎng)基對(duì)于牛奶中常見(jiàn)治病菌的特異性驗(yàn)證Table 2 Specificity verification of chromogenic medium for common bacteria in milk

表3 本方法與國(guó)標(biāo)方法的比較Table 3 Comparison between this method and national standard method

2.4 顯色培養(yǎng)基在生乳中的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果

將Mix1和Mix2與生乳進(jìn)行混合模擬自然污染生乳，將梯度稀釋至合適濃度的加標(biāo)樣品分別與實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基和國(guó)標(biāo)培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，如圖 10 所示，Bland-Altman 圖中所有散點(diǎn)均分布在基本均落在95%一致性區(qū)間（即1.96 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)），說(shuō)明兩種方法的一致性情況良好，即該復(fù)合顯色培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果和國(guó)標(biāo)方法之間沒(méi)有顯著差異，可以相互替換。在相對(duì)準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上，該復(fù)合顯色培養(yǎng)基同時(shí)能夠進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)，具有較強(qiáng)的操作性和實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，這將有助于更為高效的評(píng)估生乳的衛(wèi)生情況。

3 結(jié)論

大腸菌群具有l(wèi)acZ 基因，該基因表達(dá)生成β-Gal，研究結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加ONPG可使大腸菌群菌落呈現(xiàn)黃色至橙色，而非大腸菌群菌株，如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等，培養(yǎng)后均能正常生長(zhǎng)且菌落則呈現(xiàn)乳白色，無(wú)明顯黃色物質(zhì)產(chǎn)生，因此確定該復(fù)合顯色培養(yǎng)基具備同時(shí)進(jìn)行大腸菌群和菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的可操作性條件。經(jīng)優(yōu)化，確定該復(fù)合顯色培養(yǎng)基的最佳配方為CT 12.5 g/L、YEF 2.5 g/L、K2HPO42.75 g/L、KH2PO41.75 g/L、NaCl 5.0 g/L、Agar 15.0 g/L、ONPG 0.10 g/L，pH 值為7.0，在此基礎(chǔ)上，添加0.05 g/L IPTG或2.0 g/L Lac 均能夠促進(jìn)β-Gal 的表達(dá)，使得黃色產(chǎn)物ONP 能夠得快速富集，從而縮短達(dá)到可觀測(cè)結(jié)果的培養(yǎng)時(shí)間，這對(duì)于提高檢測(cè)效率具有重要意義，相反若培養(yǎng)基中添加Glu，Glu 則會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)劑排除（乳糖運(yùn)輸）和分解代謝抑制兩條途徑抑制β-Gal 的表達(dá)，從而導(dǎo)致大腸菌群菌落的顯色效果不佳，因此本研究將不考慮使用一般作為細(xì)菌培養(yǎng)基中首選碳源的Glu作為該復(fù)合顯色培養(yǎng)基的碳源。優(yōu)化后的培養(yǎng)基能達(dá)到與國(guó)標(biāo)計(jì)數(shù)方法較為一致的準(zhǔn)確性，因此能夠應(yīng)用于生乳中衛(wèi)生指示性指標(biāo)（大腸菌群和菌落總數(shù)）的計(jì)數(shù)，具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

基于酶學(xué)的方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確，復(fù)合顯色培養(yǎng)基可以通過(guò)肉眼直接觀察菌落顏色，同時(shí)進(jìn)行大腸菌群和菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)和鑒定，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。但本研究未對(duì)誘導(dǎo)lacZ 基因表達(dá)的單因素進(jìn)行混合驗(yàn)證，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行完善，同時(shí)由于ONPG 具有較強(qiáng)的膜透過(guò)性，因此存在釋放產(chǎn)物ONP外泄至細(xì)胞外，延長(zhǎng)菌落顏色識(shí)別的時(shí)間，因此未來(lái)可討論表面活性劑對(duì)于此的影響。