林安娜，張正怡，劉淳，王玉先，周春鳴，江凌,3*

（1.南京工業(yè)大學食品與輕工學院，江蘇南京 211816）（2.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京 211816）（3.南京工業(yè)大學材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京 211816）

隨著食品行業(yè)的不斷發(fā)展，人體消化系統(tǒng)越來越成為研究熱點[1]。體外人胃腸模擬系統(tǒng)是一種基于人體胃腸道生理機能進行模擬食物消化行為的生物研究系統(tǒng)，常用于生物活體的替代試驗研究，具有操作簡單、便捷、安全、快速且不受醫(yī)學研究倫理限制等優(yōu)點[2-4]，在食物重金屬殘留安全性評價、食物胃腸代謝動力學、營養(yǎng)物質(zhì)生物利用度量化評估等方面有廣泛應用[5-7]。目前，體外腸道消化模型大致分為靜態(tài)單室、動態(tài)單室、動態(tài)雙室以及動態(tài)多室模型。其中，由荷蘭瓦赫寧根大學研制的TIM（TNO Intestinal Model，TIM）模型[8]是腸道模擬消化最系統(tǒng)和全面的動態(tài)多室模型，該系統(tǒng)分為胃、小腸模擬器（TIM-1）和大腸模擬器（TIM-2），可非常接近地再現(xiàn)動物和人體內(nèi)的消化動態(tài)情況。國外Venema 等[9]利用TIM-1 模型研究了乳酸桿菌和雙歧桿菌在胃和小腸內(nèi)的存活率，國內(nèi)曉東宜?。ㄌK州）儀器設備有限公司開發(fā)的第四代動態(tài)體外仿生人胃腸消化系統(tǒng)（Dynamic Human Stomach Intestine-IV，DHSI-IV）也被用來模擬食物在消化過程中對益生菌腸道存活特性的影響[10]。TIM 模型作為一種更接近人體胃腸道體內(nèi)消化的體外動態(tài)模型，廣泛應用于營養(yǎng)物質(zhì)的消化研究及功能性食品的開發(fā)。

多糖是一類存在于動植物中的生物大分子，其作為天然活性成分，如何被人體消化利用以發(fā)揮其功能逐漸成為近年來多糖領域的研究熱點[11]。一些具有生理功能的多糖常于食品工業(yè)中被用以調(diào)節(jié)腸道健康[12]。結冷膠是一種陰離子多糖，具有凝膠性能強、耐酸、熱穩(wěn)定性好的特點[13]。結冷膠與鈣離子結合可形成凝膠網(wǎng)狀結構，在藥物及生物活性物質(zhì)的緩控釋方面具有廣泛應用[14]。殼聚糖是自然界中唯一的陽離子多糖，質(zhì)子化的殼聚糖可與陰離子多糖結冷膠通過靜電作用形成復配體，加強單一結冷膠微凝膠體系的強度[15-17]。研究諸如結冷膠、殼聚糖等天然多糖在人體腸道中的消化過程對于開發(fā)這類功能性食品具有指導意義。

本研究在TIM 動態(tài)多室體外消化模擬系統(tǒng)的基礎上，通過搖床消化實驗和人工腸道模擬系統(tǒng)的對比，評估以多糖形成的微凝膠在體外的模擬消化過程。首先通過檢測無菌生理鹽水在人工腸道模擬系統(tǒng)中跟隨壓力系統(tǒng)蠕動過程是否產(chǎn)生菌體，評估該腸道消化模擬系統(tǒng)主腔室的密封性能。同時，進一步考察結冷膠、結冷膠@殼聚糖微凝膠在體外模擬胃腸道的消化情況，考察人工腸道模擬系統(tǒng)消化模式的優(yōu)缺點，以期為人工腸道模擬系統(tǒng)在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、殼聚糖（脫乙酰度≥80%）、磷酸氫二鈉、二甲基亞砜（DMSO）、羅丹明B，以上試劑均為分析純，均購于國藥集團化學試劑有限公司。結冷膠、吡啶、月桂酸二丁基錫均為化學純，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、熒光素-5-異硫氰酸酯（FITC）均為生物試劑，均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 實驗設備

人工腸道模擬系統(tǒng)由實驗室自制的腸道反應器（圖1）和開發(fā)的軟件系統(tǒng)（圖2）組成，主要硬件設施包括：水路電磁閥（型號2SA）、氣動控制電磁閥（型號多種），亞德客（中國）有限公司；G301K pH電極，上海漢興機電有限公司；TX215 蠕動泵，保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司；S7-1200 可編程邏輯控制器，西門子；腸道反應器的模塊搭建設計圖紙詳見已授權專利[18,19]。其它實驗設備有：DF-101S 集熱式加熱磁力攪拌器，南京文爾儀器設備有限公司；Scientz-18N 真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A 旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；PHS-25 pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；BKQ-B50ll高壓滅菌鍋，濟南童鑫生物科技有限公司；Biolum 手持式ATP 熒光檢測儀，西安天隆科技有限公司；WMS-1037 生物顯微鏡，上海無陌光學儀器有限公司；HT-211C 臥式恒溫搖床，江蘇新春蘭科學儀器有限公司；Leica TCS SP8 激光共聚焦掃描顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；Malvern Mastersizer 2000激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；Malvern Zetasizer Nano ZS90 納米粒度及Zeta 電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司。

圖1 人工腸道模擬系統(tǒng)機械加工組裝模型圖（左）和實物圖（右）Fig.1 Schematic diagram (left) and physical map (right) of mechanical assembly of in vitro intestinal digestion simulation system

圖2 人工腸道模擬系統(tǒng)軟件界面Fig.2 Software interface of in vitro intestinal digestion simulation system

1.3 實驗方法

1.3.1 生理鹽水無菌驗證實驗

在如圖2 的計算機界面進行人工腸道模擬系統(tǒng)的軟件操作，實驗具體操作如下：首先，關閉出料口，向軟管中通入φ=75%的乙醇，使其充滿軟管，再用保鮮膜將進料口頂部密封靜置20 min。然后，同時打開進料口和出料口，向進料口通入無菌生理鹽水（121 ℃滅菌20 min）至乙醇被全部排出。最后，關閉出料口，讓生理鹽水充滿軟管內(nèi)部，打開全自動開關，使得無菌生理鹽水充分洗滌硅膠軟管內(nèi)部，2 min 后關閉，生理鹽水靜置其中24 h。期間使用ATP 檢測儀測量三個階段的微生物含量，分別是剛倒入生理鹽水時，實驗12 h 后，實驗結束時。后續(xù)測量值與第一次ATP檢測儀測得的值做對比，如果相差較大，則需要使用電子顯微鏡觀察是否染菌。實驗結束后，再次灌入75%的乙醇進行消毒滅菌。滅菌結束后，通入3 min 氮氣，然后關閉進料口與出料口，從而達到保護的效果。

1.3.2 微凝膠的體外消化模擬實驗

1.3.2.1 微凝膠的制備

根據(jù)文獻[20]的方法，用霧化噴嘴將1%的結冷膠溶液（m/V）擠出到3%的CaCl2（m/V）溶液中，200 r/min磁力攪拌30 min 制備微凝膠。然后，通過0.037 mm的篩子過濾收集備用。

將制備得到的結冷膠微凝膠，加入到0.5%的殼聚糖溶液（m/V）中攪拌30 min，分散均勻，制備得到結冷膠@殼聚糖微凝膠，通過0.037 mm 的篩孔過濾收集備用。

1.3.2.2 微凝膠的體外消化模擬

采用文獻方法配置模擬胃液和腸液：取3.1 g NaCl、1.1 g KCl、0.12 g CaCl2、0.6 g NaHCO3和0.236 g胃蛋白酶（酶活約為2 500 U/mg）溶于1 L 蒸餾水中，用0.1 mol/L 的HCl 將pH 值調(diào)為3，獲得模擬胃液[17]。取5.4 g NaCl、0.65 g KCl、0.33 g CaCl2·2H2O、1.4 g胰酶（約為1 000 U/mg）、0.13 g 胰蛋白酶（約為2 500 U/mg）、40 g 膽鹽溶于1 L 蒸餾水，6 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.1 mol/L NaOH 溶液將pH值調(diào)至7.5，獲得模擬腸液[21]。

將微凝膠和模擬胃液按1:4 的質(zhì)量比混合，在搖床（37 ℃，150 r/min）和人工腸道模擬系統(tǒng)中，分別進行2 h 的胃部模擬消化。取上述模擬腸液按微凝膠:模擬胃液:模擬腸液為1:2:3 的質(zhì)量比配置好后，進行4 h 的腸道模擬消化反應。

1.3.2.3 微凝膠的表征

使用激光粒度儀通過激光衍射技術測定微凝膠粒徑大小。使用生物顯微鏡觀察微凝膠的表面形態(tài)。

根據(jù)文獻[22]的方法，使用熒光素-5-異硫氰酸酯（FITC）與結冷膠共價標記，羅丹明B 染料與殼聚糖共價標記，用488 nm 和543 nm 激光線分別激發(fā)FITC和羅丹明B 熒光團，采集圖像。

根據(jù)文獻[21]的方法，使用Zeta 電位分析儀進行動態(tài)光散射測定。為了保證微粒的穩(wěn)定性，將10%（m/m）微凝膠分散在水溶液中制備懸浮液。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

以上實驗測定均重復3 次，結果以平均值±標準差（Mean±SD）表示。采用軟件SPSS 進行單因素方差分析，P＜0.05 為樣本平均值之間存在顯著性差異，使用Origin 軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行評估。

2 結果與討論

2.1 生理鹽水無菌驗證實驗分析

如表1 所示，在第0、12 和24 小時使用ATP 檢測儀檢測出的RLU 值均為0，一般認為人體腸道消化模擬系統(tǒng)處于無菌狀態(tài)[23]。由圖3 可知，在第0、12和24 h取出的樣品經(jīng)過培養(yǎng)后在培養(yǎng)基上均無菌落形成，說明人工腸道模擬系統(tǒng)具有良好的密封性、抗菌性，具備體外消化模擬系統(tǒng)的使用條件。

表1 ATP 檢測儀的RLU 值Table 1 RLU value of ATP detector

圖3 無菌實驗驗證結果Fig.3 Verification results of sterility test

2.2 微凝膠的結構表征

圖4 為結冷膠微凝膠和結冷膠@殼聚糖微凝膠在不同pH 值下的Zeta 電位圖。由圖可知，結冷膠微凝膠表面的Zeta 電位值為負值，隨著pH 的升高，Zeta 電位絕對值增大，說明微凝膠體系越穩(wěn)定[24]。但因為殼聚糖是一種聚陽離子多糖，殼聚糖包覆結冷膠表面后，微凝膠的Zeta 電位為正值，且pH 值越高，所帶正電荷越少，說明殼聚糖與結冷膠結合更緊密。在pH 值為6 時，結冷膠微凝膠的Zeta 電位為-14.30 mV；殼聚糖包覆后，Zeta 電位值為22.43 mV，通過對比包裹前后Zeta 電位由負變正，充分的說明了殼聚糖成功包覆在了結冷膠微凝膠的表面，結冷膠@殼聚糖微凝膠制備成功。圖5 為微凝膠熒光標記后的激光共聚焦顯微鏡圖，488 nm 光源下結冷膠呈現(xiàn)綠色（圖5a），543 nm光源下殼聚糖呈現(xiàn)紅色（圖5b），自然光源下的微凝膠的顯微鏡圖片如圖5c 所示，微凝膠熒光顯微鏡圖很好的證實了殼聚糖包覆在結冷膠表面[20]。

圖4 結冷膠微凝膠和結冷膠@殼聚糖微凝膠在不同pH 值下的Zeta 電位圖Fig.4 Zeta potentials of gellan gum gel microgel and gellangum@chitosan gel microgel at different pH value

圖5 微凝膠的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.5 Confocal laser microscopy of microgel

2.3 微凝膠的體外消化模擬實驗

2.3.1 兩種體外模擬消化系統(tǒng)消化時的Zeta電位變化

圖6a 所示為結冷膠微凝膠在搖床和體外模擬消化系統(tǒng)中反應的Zeta 電位變化。在消化的前2 h，即模擬胃部消化，結冷膠微凝膠的Zeta 電位呈緩慢變化趨勢。在消化的后4 h，即模擬腸道消化，結冷膠微凝膠的Zeta電位下降明顯加快，說明結冷膠在人體消化過程的反應大多集中在腸道中。在整個模擬胃腸道連續(xù)消化的反應過程中，結冷膠微凝膠，在搖床反應中的Zeta 電位從-3.56 mV 降低到-16.10 mV；人工腸道模擬消化系統(tǒng)中的Zeta 電位從-3.26 mV 降低到-17.97 mV，可知在人工模擬腸道消化系統(tǒng)對結冷膠微凝膠的消化程度更高，消化更徹底。

圖6 搖床和體外模擬消化系統(tǒng)消化微凝膠前后Zeta 電位變化Fig.6 Zeta potential changes before and after gellan microgel was digested by the shaking table and in vitro simulated digestive system

圖6b 所示為搖床和體外模擬消化系統(tǒng)消化結冷膠@殼聚糖微凝膠前后Zeta 電位變化。由圖可知，在消化的前2 h，即模擬胃部消化，在體外模擬消化系統(tǒng)消化系統(tǒng)中結冷膠@殼聚糖微凝膠的Zeta電位沒有顯著性變化，而搖床消化系統(tǒng)中結冷膠@殼聚糖微凝膠的Zeta 電位顯著下降，說明包裹在結冷膠表面的殼聚糖已經(jīng)開始被消化。在消化的后4 h，即模擬腸道消化，體外模擬消化系統(tǒng)中結冷膠@殼聚糖微凝膠的Zeta電位顯著下降；而搖床消化系統(tǒng)中的Zeta 電位下降較緩。在消化結束時，兩種模擬消化系統(tǒng)中結冷膠@殼聚糖微凝膠的Zeta 電位均從開始的正值變?yōu)樨撝?，在搖床反應中，結冷膠@殼聚糖微凝膠Zeta 電位從31.57 mV 降低到-9.37 mV；人工模擬腸道消化系統(tǒng)中，Zeta 電位從31.97 mV 降低到-11.26 mV，電位下降值更大，這說明微凝膠的破碎程度更大，導致表面暴露的電荷更多。

2.3.2 兩種體外模擬消化系統(tǒng)消化時的粒徑變化

圖7 所示為兩種消化系統(tǒng)中結冷膠微凝膠和結冷膠@殼聚糖微凝膠隨時間改變的微凝膠粒徑分布。可以看出在消化過程中，凝膠的粒徑隨著消化時間的延長而變小。如圖7a 所示，在搖床消化系統(tǒng)消化中結冷膠微凝膠所占百分比最多的粒徑，從初始的114 μm（0 h）減小到94 μm（6 h），而在搖床消化系統(tǒng)中結冷膠@殼聚糖微凝膠分布最多的粒徑從109 μm（0 h）減小到83 μm（6 h）。在人工腸道體外模擬消化系統(tǒng)消化中，結冷膠微凝膠分布最多的粒徑從127 μm（0 h）減小到79 μm（6 h）。與圖6a 搖床消化結果相比，人體腸道體外模擬消化系統(tǒng)消化的結冷膠微凝膠粒徑變化更大，說明人工腸道體外模擬消化系統(tǒng)消化更加充分，使得微凝膠粒徑可以變得更小，這與Zeta 電位變化結果相一致。圖7d 為人工腸道體外模擬消化系統(tǒng)消化結冷膠@殼聚糖微凝膠粒徑變化圖，與圖7b 搖床消化結果相比，粒徑同樣呈減小趨勢，也說明人工腸道體外模擬消化系統(tǒng)消化更加充分；且與人工腸道體外模擬消化系統(tǒng)消化結冷膠微凝膠對比，最終的粒徑并無較大差距，說明人工腸道體外模擬消化系統(tǒng)的消化功能較穩(wěn)定。

圖7 兩種消化系統(tǒng)中結冷膠微凝膠和結冷膠@殼聚糖微凝膠最大粒徑的變化趨勢Fig.7 Variation trend of maximum particle size of gellan gum gel microgel and gellangum@chitosan gel microgel digested by two digestive systems

圖8 所示為搖床和體外模擬消化系統(tǒng)消化兩種微凝膠前后體積平均粒徑（D32）變化。在兩種模擬消化系統(tǒng)中，結冷膠微凝膠和結冷膠@殼聚糖微凝膠的平均尺寸大小均呈現(xiàn)下降趨勢，這也與zeta 電位的變化規(guī)律一致，微凝膠被消化破碎后平均尺寸變小。由圖可知，在包裹殼聚糖后，結冷膠@殼聚糖微凝膠的平均尺寸與結冷膠微凝膠相比顯著變小，這與文獻[22]中報道的結論一致。在消化結束時，搖床消化系統(tǒng)中的微凝膠與體外模擬消化系統(tǒng)中的平均尺寸相比更大，這說明體外模擬消化系統(tǒng)對于微凝膠的消化更徹底。

圖8 搖床和體外模擬消化系統(tǒng)消化微凝膠前后體積平均尺寸的變化Fig.8 Average size changes of microgel before and after digestion on a rotary shaker and in vitro simulated digestive system

2.3.3 兩種模擬消化系統(tǒng)消化前后的光學顯微鏡圖的對比

圖9a 和9c 所示為體外模擬消化系統(tǒng)和搖床中結冷膠微凝膠光學顯微鏡圖。由圖可知，結冷膠微凝膠消化前在顯微鏡下呈現(xiàn)透明的圓形，搖床模擬系統(tǒng)消化后1 h，凝膠形態(tài)變化不明顯；2 h 后凝膠形狀明顯變小，但仍呈現(xiàn)圓形；在第3～6 h，凝膠破碎，呈無規(guī)則形狀，結果說明結冷膠微凝膠在胃反應下較穩(wěn)定，反應集中在腸道中。

圖9 搖床和體外模擬消化系統(tǒng)消化過程中微凝膠的顯微鏡圖Fig.9 Microscopic images of a rotary shaker and in vitro microgels simulating digestion of the digestive system

圖9 b和9 d所示為體外模擬消化系統(tǒng)和搖床中結冷膠@殼聚糖微凝膠光學顯微鏡圖。結冷膠@殼聚糖微凝膠消化前在顯微鏡下同樣呈現(xiàn)圓形、透明，大小均勻。搖床模擬系統(tǒng)消化后2 h 內(nèi)，凝膠形態(tài)變化不明顯；在第3 h，凝膠形態(tài)變小，在顯微鏡下仍呈現(xiàn)圓形；在消化后的第6 h，凝膠形態(tài)明顯變小，凝膠部分破碎，但仍可見凝膠邊緣。這是由于殼聚糖涂層結冷膠微凝膠后，正負電荷之間相互結合，使得微凝膠結構更加穩(wěn)定。

關于模擬腸道消化步驟對殼聚糖-結冷膠微凝膠的影響，可以觀察到兩個過程。首先，模擬腸液的pH值可以破壞殼聚糖-結冷膠微凝膠的表面電荷，之后隨著殼聚糖的水解，凝膠發(fā)生了崩解。雖然所有樣品在腸道消化后都出現(xiàn)了結構破壞，但粒徑分布、光學顯微鏡觀察和Zeta 電位結果都表明殼聚糖包裹微凝膠的破碎程度較低。因此，外層殼聚糖層的存在減少了微凝膠顆粒的崩解，延緩了微凝膠被模擬腸液的消化。

3 結論

本研究提供了一種接近動態(tài)生理條件下的TIM動態(tài)多室體外模擬消化評估系統(tǒng)，與傳統(tǒng)體外消化模式相比，本研究所用模型具有高仿真、易于操作、體系穩(wěn)定等特點。研究結果顯示，該人體腸道消化模擬系統(tǒng)具有良好的密封性、抗菌性，具備體外消化模擬系統(tǒng)的使用條件。接著，結冷膠和殼聚糖制備的微凝膠在模擬消化過程中Zeta 電位、粒徑大小以及微觀結構的變化結果表明，結冷膠微凝膠在胃部消化時部分水解，而結冷膠@殼聚糖微凝膠在胃部模擬消化時不易水解，說明結冷膠@殼聚糖具有良好的耐胃酸性能；經(jīng)過腸道消化后的微凝膠結構均有破碎，結冷膠微凝膠破碎程度更大。其中，經(jīng)過人工腸道模擬系統(tǒng)的結冷膠和結冷膠@殼聚糖微凝膠的尺寸、形貌都發(fā)生明顯變化，表明人工腸道體外模擬系統(tǒng)對微凝膠形式的活性多糖的消化更為徹底。綜上所述，本研究所使用的人工腸道消化模擬系統(tǒng)可用于食品營養(yǎng)物質(zhì)的消化研究，在人體消化過程中未消化成分的去向及腸道管腔內(nèi)微生物代謝和生態(tài)的影響方面具有良好的應用前景。