高立芳，曾新安，金可沆，范土貴，彭名軍，曾巧輝*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省食品智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528225）（2.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

蛋白質(zhì)是人體所必須的重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一。通常，蛋白質(zhì)進(jìn)入人體后，經(jīng)過胃腸道消化酶的降解才能被機(jī)體吸收，其在人體不是僅以氨基酸形式被吸收，更多是以肽的形式被吸收[1]。小分子生物肽的分子量小、結(jié)構(gòu)簡單，且可快速透過小腸黏膜被吸收，相較于游離氨基酸，吸收耗能低、轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、載體不易飽和[2]。因此，食品蛋白質(zhì)源的小分子活性肽的吸收、轉(zhuǎn)化和利用具有高效性[3]。海洋生物中存在豐富的生物活性天然產(chǎn)物可以用于開發(fā)治療多種人類疾病[4]。近年來，人們?cè)桨l(fā)關(guān)注從魚類、藻類、甲殼類動(dòng)物和海綿中分離和鑒定具有廣泛生物活性的蛋白質(zhì)和多肽。

藻類蛋白是人類重要的海洋蛋白質(zhì)來源，且其經(jīng)酶解后能釋放出具有生物活性的小分子肽。研究表明，大豆、牛奶、帶魚等食物的酶解產(chǎn)物具有降血脂、抗炎癥、降血糖、抗抑郁等多種生物活性[5-7]。蛋白酶激活受體（PARs）是G 蛋白偶聯(lián)受體家族的一員，與人體內(nèi)許多的生理反應(yīng)相關(guān)[8]，且參與誘發(fā)多種疾病的發(fā)生，如各種炎癥、癌癥、冠心病和糖尿病等[9-11]。通常情況下，PARs 的N 末端序列被絲氨酸蛋白酶水解切割而發(fā)生不可逆的激活，暴露含有系鎖配體的新的N 末端，新的N 末端作為系鎖配體可與PARs 進(jìn)行分子內(nèi)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)自發(fā)激活，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞級(jí)偶聯(lián)反應(yīng)以響應(yīng)炎癥信號(hào)和其它刺激反應(yīng)[12]。PARs 包含有四種亞型，分別為PAR1、PAR2、PAR3、PAR4，其中蛋白酶激活受體2（PAR2）比較特殊，且不能被凝血酶激活[13]，而PAR2 主要激活劑包括胰蛋白酶、類胰蛋白酶和彈性蛋白酶，其中胰蛋白酶是最有效的PAR-2 激活劑[14]。

我國是藻類生產(chǎn)消費(fèi)大國，常見的藻類品種有海帶（Laminariajaponica）、紫菜（Porphyra）、裙帶菜（UndariapinnatifidaSuringar）、江蘺（Gracilaria）、螺旋藻（Spirulina）以及微藻杜氏藻（Microalgae Dunaliella）等[15]，其富含優(yōu)質(zhì)蛋白。目前，基于計(jì)算機(jī)的分子模擬技術(shù)高速發(fā)展，能一定程度上減少傳統(tǒng)科研實(shí)驗(yàn)存在的耗時(shí)、費(fèi)力、缺乏靶向性等問題。傳統(tǒng)的生物活性肽主要是從蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的分離純化和活性鑒定開展研究，其不僅存在上述局限性，還有可能導(dǎo)致微量但活性高的生物活性肽的損失。

本研究利用生物數(shù)據(jù)庫和基于計(jì)算機(jī)模擬的多肽-蛋白分子對(duì)接技術(shù)，理論上從食用藻類蛋白質(zhì)中篩選具有蛋白酶激活受體2（PAR2）抑制作用的小分子多肽；以對(duì)接分?jǐn)?shù)和配體與受體相互作用力作為評(píng)估藻類蛋白質(zhì)源多肽對(duì)PAR2 的抑制潛力的依據(jù)，為藻類蛋白的開發(fā)利用以及PAR2 抑制劑發(fā)掘研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）[16]中輸入“Edible algae”，結(jié)合蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫（PDB），檢索出所有種類食用藻類蛋白，并下載各種蛋白質(zhì)的氨基酸序列。從PDB 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白酶激活受體2（PAR2）的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：5NDD，5NDZ），利用PyMol 軟件分別將受體和配體8TZ（C13H15FN2O，結(jié)構(gòu)見圖1a），8UN（C30H27BrN4O3，結(jié)構(gòu)見圖1b）分離，并保存為PDB 文件。8TZ 作為蛋白酶激活受體2的拮抗劑，結(jié)合在受體外表面附近一個(gè)完全閉塞的口袋中，其主要與PAR2 氨基酸序列上的Asp228、Tyr82和His135 形成氫鍵，從而穩(wěn)定受體的無活性狀態(tài)以防止激動(dòng)劑的活化變構(gòu)。抑制劑8UN 具有高度的親脂性，主要通過疏水作用與受體結(jié)合在蛋白螺旋表面偏遠(yuǎn)的變構(gòu)位點(diǎn)上，從而限制激動(dòng)劑結(jié)合后受體激活所需的螺旋間構(gòu)象重排。

圖1 抑制劑8TZ、8UN 的分子結(jié)構(gòu)和蛋白酶激活受體2 與兩個(gè)抑制劑配體對(duì)接的2D 結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of the inhibitors 8TZ and 8UN and 2D structure of the protease-activated receptor 2 docked to two inhibitor ligands

1.2 BIOPEP-UWM 分析

根據(jù)Yao 等[5]采用的方法，將從NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得食用藻中常見的11 種蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫中，預(yù)測被胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶這三種腸胃酶的作用情況，模擬人體胃腸道消化的過程。將模擬人體胃腸消化所得的理論肽進(jìn)一步分析獲得潛在生物活性肽，并且對(duì)其進(jìn)行更深一層的分析。

人體對(duì)螺旋藻蛋白的消化能力可以通過理論水解度TDH 來進(jìn)行表示。

式中：

TDH——蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)與給定蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)之比，%；

D——蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)；

d——?dú)涞臄?shù)目[17]。

1.3 食用藻蛋白質(zhì)源多肽的活性分析

使用Peptide Ranker 服務(wù)器評(píng)估螺旋藻蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的生物學(xué)活性，并對(duì)小分子肽進(jìn)行綜合評(píng)分篩選。在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫中輸入寡肽的氨基縮寫序列可得到介于0～1 的評(píng)分，評(píng)分越高說明該寡肽的生物活性越高。在本研究中，當(dāng)預(yù)測的肽段分?jǐn)?shù)超過0.50 時(shí)，則可以認(rèn)為該肽段具有潛在生物活性。

1.4 食用藻類蛋白和計(jì)算機(jī)模擬水解后釋放的肽段的理化性質(zhì)篩選

目前，ToxinPred 程序已廣泛運(yùn)用于多肽研究的分子對(duì)接虛擬篩選中[18]，其預(yù)測功能可以有效避免有毒小分子肽進(jìn)入人體內(nèi)從而對(duì)身體健康造成危害。水溶性是影響生物活性肽吸收、發(fā)揮活性作用的主要因素，本研究采用Innovagen（http://www.innovagen.com/）和ToxinPred 網(wǎng)站對(duì)高活性肽進(jìn)行預(yù)測，挑選潛在生物活性高、無毒且水溶性好的寡肽片段進(jìn)行下一步對(duì)接研究。

1.5 分子對(duì)接

HPEPDOCK 是一種開展蛋白-多肽對(duì)接模擬研究的在線工具[16]。在HPEPDOCK 數(shù)據(jù)庫中可將受體與篩選出的多肽進(jìn)行對(duì)接，選擇分離出來的配體作為對(duì)接參照；將分子對(duì)接評(píng)分≤-100 的寡肽視為高親和、分子對(duì)接評(píng)分≤-150 的寡肽為超高親和。

同時(shí)，用F 值來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)抑制蛋白酶激活受體2（PAR2）的能力。

式中：

F——出現(xiàn)頻率；

N——蛋白鏈內(nèi)高親和寡肽的數(shù)量；

L——蛋白鏈的長度。

1.6 分子對(duì)接結(jié)果的可視化

利用PyMol 軟件對(duì)受體和寡肽進(jìn)行處理，構(gòu)建對(duì)接復(fù)合物的三維空間結(jié)構(gòu)以及分子間作用力。通過LigPlus（版本號(hào)：V.2.2）分析高親和力寡肽與PAR2受體結(jié)合的疏水殘基和氫鍵作用[17]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 計(jì)算機(jī)模擬酶解食用藻蛋白的結(jié)果分析

根據(jù)蛋白質(zhì)在食用藻中含量高、活性強(qiáng)、研究廣泛的原則，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中篩選食用藻來源的代表性蛋白質(zhì)，利用BIOPEP-UWM 數(shù)據(jù)庫模擬胃腸道消化酶（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶）水解上述篩選的蛋白質(zhì)。結(jié)果如表1 所示。

表1 食用藻類蛋白質(zhì)情況Table 1 Introduction of edible algae protein

表2 藻類蛋白結(jié)合蛋白酶激活受體2 的寡肽序列和頻率Table 2 Oligopeptide sequence and frequency of algal protein binding PAR 2

挑選螺旋藻、小球藻、紫菜、江蘺以及裙帶菜等五種市場上常見的高營養(yǎng)價(jià)值的食用藻類，根據(jù)每種酶均有其固定的切割位點(diǎn)這一特性，采用NCBI 和BIOPEP-UWM 數(shù)據(jù)庫處理、模擬酶水解可得到，水解度TDH 基本上大于30%，最高不超過50%；水解后的產(chǎn)物主要是氨基酸和寡肽，其中，NADH 脫氫酶和4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的水解度較高，分別達(dá)到了49.13%和43.63%，另外，水解度最低的則是裙帶菜的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶只有28.24%；水解后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生多肽數(shù)量最多的是4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶可達(dá)到121，其次是熱休克蛋白70 為118；serpin 家族蛋白產(chǎn)生高活性肽數(shù)量最多為46，4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和別藻藍(lán)蛋白均為41。

生物信息學(xué)（Bioinformatics）是綜合運(yùn)用生物學(xué)、信息科學(xué)的各種知識(shí)和工具，對(duì)復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)進(jìn)行獲取、處理、存儲(chǔ)、分發(fā)、分析和解釋，從而得到我們能夠理解和接受的各種知識(shí)的一種技術(shù)。生物信息學(xué)工具在近年來發(fā)展飛速，在活性肽發(fā)掘研究中有著廣泛應(yīng)用[19]。步營等在研究抗SARS-CoV-2 海洋活性肽時(shí)運(yùn)用了PeptideRanker 和ToxinPred 等生物信息學(xué)工具[18]。當(dāng)前，各種數(shù)據(jù)庫與多肽理化性質(zhì)預(yù)測工具如在線工具Innovagen 軟件以及預(yù)測活性肽的吸收（Adsorptin）、分布（Distribution）、代謝（Metabolism）、排泄（Excretion）和毒性（Toxicity）的AdmetSAR 軟件等都在活性肽的模擬篩選發(fā)揮著重要作用[18-20]。對(duì)比傳統(tǒng)的生物活性肽研究方法，利用生物信息學(xué)技術(shù)可以節(jié)省獲得活性肽構(gòu)效關(guān)系的成本，實(shí)現(xiàn)了天然活性肽的快速高通量篩選。同時(shí)，生物質(zhì)譜中的液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜以及四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜被逐漸應(yīng)用于生物活性肽的結(jié)構(gòu)分析，并輔以質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析軟件ProteinPilot，縮短了活性肽結(jié)構(gòu)表征的周期[21]。

2.2 食用藻源蛋白酶解活性預(yù)測結(jié)果

使用Peptide Ranker 工具來分析通過水解得到的寡肽，并篩選出具有潛在活性的寡肽，從而開展后續(xù)更深入的研究。篩選出的活性潛力較高、水溶性好的寡肽如表3 所示。由表3 可知，蛋白質(zhì)serpin 家族蛋白（46）來源的且具有理論活性的寡肽數(shù)量是最多，其次是4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（41）?；钚灶A(yù)測得分位于前三的寡肽分別是DF、DW 和GIDGPF 分子量分別為280.29、319.33 和604.74，肽段的生物活性并沒有隨分子量的增大而增大，其它肽段沒有展現(xiàn)出肽段的生物活性隨分子量的增大而降低，所以肽段的分子量與生物活性沒有直接的相關(guān)性?？梢钥吹筋A(yù)測得分較高的寡肽多集中在含有2～3 個(gè)氨基酸序列小分子肽之間。水溶性好的多肽都含有極性氨基酸。

表3 模擬水解獲得的高活性寡肽及有效抑制蛋白酶激活受體2 活性的小分子寡肽Table 3 Highly active oligopeptides obtained by simulated hydrolysis and small molecule oligopeptides that effectively inhibit protease-activated receptor 2 activity

蛋白質(zhì)和多肽是食用藻類中重要的生物營養(yǎng)物質(zhì)，具有多種保健功效和生物活性，如促進(jìn)外源營養(yǎng)成分的消化和吸收、抗光老化、抗腫瘤、抗氧化等[22]。大部分寡肽被肽酶再次水解為二肽和三肽，由PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，而后被細(xì)胞內(nèi)肽酶水解為游離氨基酸，進(jìn)而通過細(xì)胞途徑和載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)完整吸收進(jìn)入體循環(huán)。多數(shù)被吸收的小分子肽都被血管內(nèi)皮組織肽酶和可溶性血漿肽酶分解為氨基酸[1]。

目前，影響口服肽生物利用度的兩個(gè)重要因素是肽對(duì)胃腸道酶降解的抵抗及其通過腸細(xì)胞定向運(yùn)輸?shù)男?。腸道中二肽和三肽的主要轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是PepT1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，四肽和五肽則主要通過細(xì)胞旁緊密連接途徑轉(zhuǎn)運(yùn)[23]。一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)，某些具有2～8 個(gè)氨基酸殘基的肽可抑抑制DPP-IV，其活性受序列長短、疏水性、氨基酸組成等各種因素影響[24]。因此，現(xiàn)有研究往往選用肽鏈長度在2～8 之間的寡肽開展蛋白酶激活受體2（PAR2）分子對(duì)接研究。

使用在線工具Innovagen和ToxinPred程序來分別對(duì)篩選出來的具有生物化學(xué)潛力的寡肽進(jìn)行水溶性預(yù)測以及預(yù)測所選肽段的毒性、測定分子量等其他理化數(shù)據(jù)，具體結(jié)果如表3 所展示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所選用的寡肽均無毒無害，這很有可能和構(gòu)成肽段的氨基酸的種類以及其結(jié)構(gòu)相關(guān)。采用ToxinPred 對(duì)所選寡肽進(jìn)行毒性預(yù)測，發(fā)現(xiàn)所挑選的肽段均無毒，可進(jìn)一步用作食品藥品方面的研究。另外，肽段的親水性的負(fù)值越大代表其親水能力越強(qiáng)；正值越大則代表其疏水能力越強(qiáng)[26]。

2.3 分子對(duì)接結(jié)果分析

近年來，分子對(duì)接（MolecularDocking）技術(shù)作為探究關(guān)蛋白-配體的結(jié)合狀態(tài)、食品功能性成分作用位點(diǎn)、農(nóng)獸藥作用機(jī)理的一種新興技術(shù)，因能克服科學(xué)實(shí)驗(yàn)存在的局限性，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛。Auwal等使用Schr?dinger軟件對(duì)石頭魚蛋白的水解產(chǎn)物抑制肽與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）進(jìn)行分子對(duì)接，從分子水平上解釋了這些抑制肽的ACE 抑制作用。步營借助Discovery Studio 軟件篩選抗SARS-CoV-2 海洋活性肽，并分析了分子間的相互作用[18]。該技術(shù)利用計(jì)算機(jī)模擬程序把配體小分子放在受體活性位點(diǎn)處，按照幾何互補(bǔ)和能量互補(bǔ)的原則，通過打分函數(shù)篩選出配體與受體間的最佳結(jié)合模式[27]。

HPEPDOCK（http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/）是一款模擬蛋白-多肽對(duì)接的在線工具。Weng 等[28]測試了14 種常見對(duì)接軟件，包括：三個(gè)蛋白-蛋白對(duì)接軟件（ZDOCK、FRODOCK and HawkDock），三個(gè)蛋白-小分子對(duì)接軟件（GOLD、Surflex-Dock and AutoDock Vina），以及八個(gè)蛋白-多肽對(duì)接軟件（GalaxyPepDock、MDockPeP、HPEPDOCK、CABS-dock、pepATTRACT、DINC、AutoDock CrankPep (ADCP)、HADDOCK peptide docking）。發(fā)現(xiàn)在全局對(duì)接中，HPEPDOCK 的表現(xiàn)優(yōu)于其他的對(duì)接軟件，因此，本研究選擇HPEPDOCK 軟件進(jìn)行分子對(duì)接。基于該軟件，本研究最終篩選出四個(gè)分子對(duì)接評(píng)分≤-150 的寡肽（PAGR、PAR、IDQW、DISAW），且將這四個(gè)寡肽認(rèn)為是的具有較高蛋白酶激活受體2抑制潛力超高親和肽。

將經(jīng)過胃腸道消化模擬水解酶切后且通過生物信息學(xué)工具篩選的寡肽與蛋白酶激活受體2（PAR2）進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接得分＜-100 被認(rèn)為是具有親和能力的寡肽，用F值來評(píng)價(jià)食源性藻類蛋白質(zhì)對(duì)蛋白酶激活受體2（PAR2）的潛在抑制能力。結(jié)果表2 所示，發(fā)現(xiàn)小球藻的精氨酸脫羧酶蛋白的F值最高為1.60%，其次是超氧化物歧化酶和藻紅蛋白，均為1.50%。F值越高，說明這三種食用藻蛋白的蛋白酶激活受體2（PAR2）的潛在抑制能力優(yōu)于本文研究的其他食用藻蛋白，酶解后更容易獲得高親和力的寡肽，這三種蛋白廣泛存在于常見食用藻類中，相對(duì)含量較高，它們是篩選蛋白酶激活受體2 抑制肽的主要優(yōu)勢。

2.3.1 分別以抑制劑8TZ 和8UN 為參照的對(duì)接結(jié)果

在HPEPDOCK 軟件中分別以抑制劑8TZ 和8UN為參照，經(jīng)過胃腸道消化模擬和水解酶切后且通過生物信息學(xué)工具篩選的寡肽與蛋白酶激活受體2（PAR2）進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接結(jié)果如表5 所示。

表5 分子對(duì)接結(jié)果Table 5 Results of molecular docking

本研究通過LigPlus 軟件分析研究螺旋藻蛋白源寡肽與PAR2 的結(jié)合能力，以及參與相互作用的疏水殘基和氫鍵和以抑制劑8TZ 為參照的對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分子對(duì)接分?jǐn)?shù)最高的寡肽是來自精氨酸脫羧酶的PAGR（-165.80），且多肽主要與其PAR2 氨基酸序列上的His227、Leu151 形成氫鍵相互作用，以及與Ile327、Tyr82、HIS135、Leu78、Tyr134、Cys226、Ile152、Lys131、Thr334、Trp127、Phe155、Ser124、Phe155、Asn158、Asn336、Phe128、Asp228 形成疏水作用。另外，PAGR 與抑制劑8TZ 有8 個(gè)相同結(jié)合位點(diǎn)（Ile327、His227、Asp228、His135、Leu78、Tyr82、Phe155、Cys226），其中有5 個(gè)是相同的疏水殘基位點(diǎn)（Ile327、His135、Leu78、Phe155、Cys226）；PAR與抑制劑8TZ 形成8 個(gè)相同的疏水作用位點(diǎn)（Tyr82、His227、Leu78、Phe155、Phe327、Cys226、Lys131、Tyr134）和一個(gè)相同的氫鍵（Asp228），綜合認(rèn)為PAR成為PAR2 抑制肽的潛力較高。

以抑制劑8UN 為參照的對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)接分?jǐn)?shù)最高的寡肽是來自蛋白質(zhì)光敏色素C 氧化酶的DISAW（-154.48），且多肽主要與其與PAR2 氨基酸序列上的Ala157、Cys161、Leu123、Phe154、Tyr210、Trp199、Leu203、Ile202、Leu196、Leu200 形成疏水相互作用，沒有形成氫鍵作用。而IDQW 與抑制劑8UN 形成由8 個(gè)疏水氨基酸殘基（Cys161、Asn158、Ala157、Leu123、Leu203、Trp199、Phe154、Ala120）參與的疏水相互作用。因此，綜合認(rèn)為寡肽DISAW相較IDQW 對(duì)PAR2 的抑制潛力無明顯差異。

2.4 分子對(duì)接結(jié)果的可視化

根據(jù)以上的分子對(duì)接結(jié)果，將分子對(duì)接評(píng)分≤-150 的寡肽視為超高親和，使用PyMol 軟件對(duì)受體和寡肽進(jìn)行處理，構(gòu)建對(duì)接復(fù)合物的三維空間結(jié)構(gòu)以及分子間作用力。LigPlus 軟件分析超高親和力寡肽與PAR2 受體結(jié)合的疏水殘基和氫鍵作用，分析結(jié)果如表6、圖2～5 所示。

表6 超高親和寡肽與蛋白酶激活受體的相互作用力Table 6 Interactions between ultrahigh affinity oligopeptides and protease activated receptors

圖2 蛋白酶激活受體2(PAR2)與超高親和肽PAGR 結(jié)合的圖像Fig.2 Image of PAR2 binding to the ultra-high affinity peptide with sequence of PAGR

圖3 蛋白酶激活受體2(PAR2)與超高親和肽PAR 結(jié)合的圖像Fig.3 Image of PAR2 binding to the ultra-high affinity peptide with sequence of PAR

圖4 蛋白酶激活受體2(PAR2)與超高親和肽IDQW 結(jié)合的圖像Fig.4 Image of PAR2 binding to the ultra-high affinity peptide with sequence of IDQW

圖5 蛋白酶激活受體2(PAR2)與超高親和肽DISAW 結(jié)合的圖像Fig.5 Image of PAR2 binding to the ultra-high affinity peptide with sequence of DISAW

分子對(duì)接是依據(jù)配體和受體之間的“鑰匙與鎖”的識(shí)別關(guān)系來模擬小分子配體和大分子受體之間的相互作用力，其從分子層面來解釋PAR2 與PAGR、PAR、IDQW 以及DISAW 的作用機(jī)制。計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)作為強(qiáng)大的科學(xué)研究工具，可研究分子間相互作用，指導(dǎo)新產(chǎn)品的研發(fā)。利用分子對(duì)接技術(shù)可以清晰地了解活性肽和受體蛋白的對(duì)接位點(diǎn)及二者之間存在的相互作用力，從而分辨出肽段的生物活性和有效性[29]。PAR2 具有規(guī)范的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，目前已有研究表明PAR2 拮抗劑可以有效通過抑制受體激活和信號(hào)傳導(dǎo)所需的結(jié)構(gòu)重排、阻斷激活配體進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)兩種方式發(fā)揮作用[8]。

3 結(jié)論

食用藻類被認(rèn)為是綠色健康的食品，其蛋白質(zhì)含量高于10%，其中螺旋藻蛋白更是符合人體氨基酸比例需求的優(yōu)質(zhì)蛋白，且蛋白質(zhì)含量超過藻干粉質(zhì)量的65%以上。但我國當(dāng)下藻類產(chǎn)業(yè)鏈的附加價(jià)值不高，綜合經(jīng)濟(jì)效益逐年下降?；谀壳盎钚远嚯牡难芯柯肪€基本上遵循蛋白質(zhì)提取→酶解條件優(yōu)化→活性多肽分離純化→活性測定→結(jié)構(gòu)鑒定研究途徑，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且在反復(fù)分離純化過程中活性肽含量損失嚴(yán)重。因此，生物信息學(xué)協(xié)同實(shí)際實(shí)驗(yàn)手段開發(fā)活性生物肽的方法正成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

本研究主要利用生物數(shù)據(jù)庫以及基于計(jì)算機(jī)模擬的多肽-蛋白分子對(duì)接技術(shù)，模擬酶解食用藻類來源的蛋白質(zhì)制備小分子活性肽，預(yù)測分析寡肽片段的生物活性，并開展其水溶性和毒性等理化性質(zhì)評(píng)估，最后開展小分子寡肽與蛋白酶激活受體2（PAR2）晶體結(jié)構(gòu)的分子對(duì)接研究，從而篩選與蛋白酶激活受體2 結(jié)合能力較高的食用藻蛋白質(zhì)源寡肽，理論上分析小分子寡肽抑制蛋白酶激活受體2 的潛在活性和作用機(jī)制。結(jié)果顯示，食用藻蛋白源寡肽PAGR、PAR、IDQW、DISAW 與蛋白酶激活受體2 具有較高的結(jié)合潛力。研究成果為藻類蛋白的開發(fā)利用以及蛋白酶激活受體2（PAR2）抑制劑的發(fā)掘提供參考依據(jù)，也為未來的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究提供了理論指導(dǎo)。