宋瑤，譚凱燕，黃傲，馬金克，李銳定，鄭文軒，時(shí)鳳翠，于曉涵，李全陽(yáng)*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣西南寧 530004）（2.廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，廣西南寧 530200）（3.廣西民族大學(xué)相思湖學(xué)院管理學(xué)院，廣西南寧 530225）

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與人口老齡化進(jìn)程加速，如何活得更加健康長(zhǎng)壽得到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注與研究。近十年，本團(tuán)隊(duì)對(duì)廣西著名長(zhǎng)壽地區(qū)老人開(kāi)展了多次膳食方面調(diào)查，并對(duì)其飲食、代謝物特征和腸道菌群等進(jìn)行研究分析，構(gòu)建了廣西長(zhǎng)壽飲食模式。該模式以膳食纖維多糖為主，具有高膳食纖維、高維生素A、低能量、低脂肪、低蛋白質(zhì)、低膽固醇的特點(diǎn)[1,2]。在廣西長(zhǎng)壽飲食模式中，提供膳食纖維的食物可分為水果、蔬菜與主食三類(lèi)，根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期調(diào)查研究，代表性的水果為臍橙和香蕉，代表性的蔬菜為南瓜苗、空心菜、茶樹(shù)菇、苦荬菜和紅薯葉[3]，代表性主食為玉米、紅薯、芋頭和火麻[4]。膳食纖維與腸道菌群密切相關(guān)，并能影響腸道菌群組成比例及數(shù)量，進(jìn)而對(duì)人體健康產(chǎn)生影響[5-9]。目前，對(duì)膳食纖維的研究多集中在單一膳食纖維方面，如低聚果糖[10]、低聚半乳糖[11]、山楂膳食纖維[12]等。但是對(duì)于多種膳食纖維復(fù)合的研究相對(duì)較少，在一項(xiàng)高脂小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)復(fù)合不溶性膳食纖維對(duì)脂類(lèi)代謝與合成相關(guān)的菌屬產(chǎn)生了顯著的影響[13]，Wang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合多糖膳食纖維增加了年輕大鼠乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度，降低了球菌屬的相對(duì)豐度，對(duì)維持腸道微生態(tài)健康起到了積極作用。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)衰老小鼠的研究發(fā)現(xiàn)廣西長(zhǎng)壽飲食模式介導(dǎo)的膳食纖維復(fù)合體具有提高機(jī)體抗氧化水平、降低炎癥水平和延緩衰老的作用[15]。除此之外，暫未發(fā)現(xiàn)在體外條件下研究膳食纖維復(fù)合體對(duì)人體腸道菌群及其代謝物的研究。

研究膳食纖維對(duì)腸道菌群作用效果的方法目前有三種，分別是體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和志愿者實(shí)驗(yàn)。相比于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本高與志愿者實(shí)驗(yàn)的依從性不一的問(wèn)題，體外發(fā)酵方法具有高可控性且成本低，能夠更好的設(shè)置初始標(biāo)準(zhǔn)條件、確定發(fā)酵時(shí)間，也容易調(diào)控變量，精準(zhǔn)化研究干預(yù)效果。利用體外發(fā)酵模型可以研究飲食對(duì)腸道微生物群的影響，深入了解腸道微生物群介導(dǎo)的發(fā)酵過(guò)程[16]，基于體外發(fā)酵方法的膳食研究可用于預(yù)測(cè)任何膳食物質(zhì)對(duì)健康的有益影響，或抗生素和外源性藥物的不良影響[17]。

本研究在團(tuán)隊(duì)前期工作基礎(chǔ)上，擬從體外發(fā)酵角度出發(fā)，探究膳食纖維干預(yù)下老年人體志愿者糞便典型菌群及糞便菌群代謝物的變化，進(jìn)一步分析潛在代謝通路及對(duì)人體有益的影響，評(píng)估廣西長(zhǎng)壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體對(duì)老年人體腸道菌群的改善作用，以期為豐富發(fā)展膳食纖維通過(guò)改善老年人體腸道菌群，促進(jìn)身體健康的理論提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉、臍橙、紅薯葉、南瓜苗、苦荬菜、空心菜、茶樹(shù)菇、珍珠黃玉米、芋頭、紅薯、火麻，廣西巴馬瑤族自治縣坡月村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；化學(xué)試劑，市售分析純；氘代重水（純度≥99.9%），青島麥可瑞生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UP-FG-1 臺(tái)式冷凍干燥機(jī)（多歧管壓蓋型），上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；T&J-Mini pod 500 mL×4 型腸道微生態(tài)恒化器模擬系統(tǒng)，迪必爾生物工程（上海）有限公司；905GP 型超低溫冰箱，賽默飛世爾科技有限公司；Light Cycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司；JBruker Avance 500 MHz 核磁共振光譜儀，德國(guó)Bruker 光譜儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 膳食纖維樣品的制備與分組

依照?qǐng)F(tuán)隊(duì)前期的提取方法制備膳食纖維。將香蕉、臍橙、紅薯葉、南瓜苗、苦荬菜、空心菜、茶樹(shù)菇、珍珠黃玉米、芋頭、紅薯、火麻11 種食材在65 ℃干燥后粉粹，過(guò)60 目篩備用。依據(jù)表1 提取條件，稱(chēng)取過(guò)篩后的果蔬原料適量，以對(duì)應(yīng)的固液比加入蒸餾水，混勻后于對(duì)應(yīng)溫度下進(jìn)行熱水浴提取對(duì)應(yīng)的時(shí)間，提取結(jié)束后，冷卻至室溫，于10 000 r/min 離心15 min，沉淀物真空冷凍干燥得不溶性膳食纖維；上清液65 ℃真空濃縮至原體積1/3，轉(zhuǎn)至燒杯中，加入4 倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置醇沉8 h，8 000 r/min 離心后收集沉淀冷凍干燥得可溶性膳食纖維[18]。依據(jù)表2 提取條件，稱(chēng)取過(guò)篩后的珍珠黃玉米、芋頭和紅薯適量，加入蒸餾水浸泡后過(guò)200 目篩，得到濾液和濾渣1，濾液進(jìn)行離心，得到上清液1 和濾渣2，濾渣1 在對(duì)應(yīng)酶添加量和液固比條件下用淀粉酶水解，然后100 ℃水浴滅酶10 min，然后調(diào)節(jié)pH 值至對(duì)應(yīng)條件，離心，得到上清液2 和沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥得到不溶性膳食纖維；上清液1 和上清液2 進(jìn)行合并，65 ℃真空濃縮至原體積1/3，轉(zhuǎn)至燒杯中，加入4 倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置醇沉8 h，8 000 r/min 離心后收集沉淀冷凍干燥得可溶性膳食纖維。稱(chēng)取過(guò)篩后的火麻適量，在蛋白酶添加量為3 000 U/g，液固比10:1 mL/g條件下用蛋白酶水解，然后100 ℃水浴滅酶10 min，然后調(diào)節(jié)pH 值至9.0，進(jìn)行離心，得到上清液和沉淀物，沉淀物進(jìn)行洗滌干燥得到不溶性膳食纖維，上清液65 ℃真空濃縮至原體積1/3，轉(zhuǎn)至燒杯中，加入4倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置醇沉8 h，8 000 r/min 離心后收集沉淀冷凍干燥得可溶性膳食纖維[4]。

表1 果蔬膳食纖維的提取條件Table 1 Extraction conditions of dietary fiber from fruits and vegetables

表2 主食膳食纖維的提取條件Table 2 Extraction conditions of dietary fiber from staple foods

將提取的膳食纖維按照空心菜:南瓜苗:臍橙:苦荬菜:茶樹(shù)菇:紅薯葉:火麻:芋頭:香蕉:紅薯:玉米=1.00:1.22:2.26:2.36:3.03:3.63:4.82:5.66:7.75:7.69:29.86的質(zhì)量比混合，膳食纖維共混物與蒸餾水按1:9 的質(zhì)量比在100 r/min 下攪拌60 min，將樣品冷凍干燥得DFC。添加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%、4% DFC的女性實(shí)驗(yàn)組分別用DFCF1、DFCF2、DFCF3、DFCF4表示，男性實(shí)驗(yàn)組分別用DFCM1、DFCM2、DFCM3、DFCM4 表示，沒(méi)有添加DFC 的女性和男性對(duì)照組用DFCFC、DFCMC 表示。

1.3.2 志愿者腸道菌群樣品的準(zhǔn)備

從廣西南寧市招募10 名65～75 歲志愿者，其中男女性別各半。采用如下條件篩選志愿者：身體健康狀況良好，不抽煙、不飲酒、無(wú)糖尿病、腎病、肝病和其他腸道類(lèi)疾病，并且半年內(nèi)沒(méi)有服用過(guò)抗生素，3周內(nèi)沒(méi)有服用益生菌、益生元或?yàn)a藥。樣本采集工作前，對(duì)篩選后的志愿者耐心培訓(xùn)指導(dǎo)，于早上收集新鮮的人體糞便樣品，收集好后立即放入預(yù)先備好的含冰袋的保溫盒中，盡快轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無(wú)菌分裝，冷卻后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保藏。

開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，以相同比例取5 位女性志愿者糞便樣品25 g（每人5 g），于滅菌后的225 mL PBS 溶液中，制成250 g 混合液并震蕩混勻。室溫8 000 r/min離心1 min 以去除大糞便顆粒，得到的菌懸液用于后續(xù)接種。男性組處理方法同女性組。

1.3.3 體外模擬發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基參考王閃閃[19]的方法制備。取5 個(gè)發(fā)酵罐并作標(biāo)記，分別加入配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基450 mL和0.125 g 厭氧指示劑刃天青，前四組分別加入質(zhì)量體積百分比（g/mL）為0.5%、1%、2%、4%的DFC，不加DFC 組作為對(duì)照組。將發(fā)酵系統(tǒng)各部件組裝包扎后放入高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

將滅菌的發(fā)酵罐放入37 ℃恒溫水浴鍋中，設(shè)置磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為150 r/min，連接pH 電極和進(jìn)氣管，通入氮?dú)饩S持厭氧的環(huán)境。待恒溫水浴鍋的溫度穩(wěn)定時(shí)向發(fā)酵罐中注射入50 mL 的新鮮懸菌液并調(diào)節(jié)pH值為6.2，保持樣品體外發(fā)酵48 h。每組做3 個(gè)平行試驗(yàn)，并在48 h 定點(diǎn)收集樣品于樣品管中，收集后立即儲(chǔ)存在-80 ℃超低溫冰箱中用于后續(xù)分析。

1.3.4 發(fā)酵液樣品中DNA 的提取與檢測(cè)

發(fā)酵液中DNA的提取按照腸道微生物DNA試劑盒提取。提取完成后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)DNA 濃度及純度。用無(wú)菌超純水洗滌3 次微孔板，吸取2 μL 洗脫緩沖液對(duì)微孔板進(jìn)行調(diào)零，調(diào)零后用無(wú)菌紙吸干洗脫緩沖液，將加入2 μL DNA 樣品加入樣品孔進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果OD260/OD280值應(yīng)在1.80～2.0之間為宜。檢驗(yàn)合格的DNA 樣品用作RT-qPCR 反應(yīng)的模板。

1.3.5 發(fā)酵液所提DNA qPCR 反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)采用腸道總菌群、大腸桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬共5 種腸道菌群引物，引物序列如表3。

表3 5 種腸道菌群的引物序列Table 3 Primer sequences for 5 intestinal microbiota

按照表4 所示用量用模板、引物、RNase-Free H2O和2×SYBR Green qPCR Mix 試劑配置qPCR 反應(yīng)體系。配好后短暫離心，按照表5 設(shè)置qPCR 反應(yīng)程序設(shè)置LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，上機(jī)檢測(cè)。

表4 發(fā)酵液提取物中DNA 的qPCR 反應(yīng)體系Table 4 qPCR reaction system of DNA in fermentation liquid extracts

表5 發(fā)酵液提取物中DNA 的qPCR 反應(yīng)程序Table 5 qPCR procedure for DNA in fermentation liquid extracts

本實(shí)驗(yàn)采用的方法是相對(duì)定量法，計(jì)算公式如下：

式中：

Rx——相對(duì)表達(dá)量；

A1——待測(cè)目的基因的Ct值；

A2——待測(cè)內(nèi)參基因的Ct均值；

A3——對(duì)照目的基因的Ct均值；

A4——對(duì)照內(nèi)參基因的Ct均值；

Ct——擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（次）。

1.3.6 發(fā)酵產(chǎn)物核磁共振檢測(cè)樣本的制備

取出存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中的發(fā)酵液樣品，在25 ℃室溫下解凍30 min，擦干離心管表面的水，渦旋30 s，準(zhǔn)確吸取1 mL 的樣品于新的2 mL 無(wú)菌離心管中，加入500 μL 含tmsp 重水的磷酸鹽緩沖溶液（含重水比例10%，K2HPO4/NaH2PO4，pH 值7.4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%NaCl 的100 mmol/L 磷酸鹽），渦旋15 s，用液氮反復(fù)冷凍-解凍三次。將混合物均質(zhì)60 s，然后在4 ℃、8 000 r/min 下離心6 min。吸取上清液于2 mL 無(wú)菌離心管中，剩余沉淀物加入500 μL 含tmsp 重水的磷酸鹽緩沖溶液，渦旋15 s，用液氮反復(fù)冷凍-解凍三次。將混合物均質(zhì)60 s，然后在4 ℃、8 000 r/min 下離心6 min，合并2 次的上清液在4 ℃，12 000 r/min 條件下離心10 min，用移液槍準(zhǔn)確吸取550 μL 的上清液加入到5 mm NMR 管中進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.3.7 發(fā)酵產(chǎn)物樣品的1H NMR 的測(cè)定方法

將NMR 管中的發(fā)酵產(chǎn)物樣品在298 K、1H 共振頻率為500.13 MHz的核磁共振光譜儀進(jìn)行NMR圖譜檢測(cè)。使用標(biāo)準(zhǔn)Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列[RD-90°-(t-180°-t)n-ACQ]采集一維光譜，同時(shí)采用預(yù)飽和法抑制水峰。采集參數(shù)為：掃描次數(shù)NS=64，采樣點(diǎn)數(shù)TD=65 536，譜寬SWH=10 000 Hz，馳豫延遲RD=2 s。

1.3.8 發(fā)酵產(chǎn)物樣品1H NMR 檢測(cè)圖譜的處理與分析

使用MestReNova 14.1 軟件（Mestrelab Research S.L）對(duì)1H 核磁共振波譜進(jìn)行相位和基線校正，以tmsp的化學(xué)位移0 ppm 進(jìn)行定標(biāo)，對(duì)化學(xué)位移區(qū)間δ0.00～9.00 ppm 的區(qū)域以δ0.001 ppm 進(jìn)行分段積分，去除水共振區(qū)δ4.64～5.10 ppm 消處水信號(hào)的影響，將積分值導(dǎo)出為Excel 表格進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

使用SIMCA-P 14.1（Umetrics，Sweden）軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）判定組間發(fā)酵液樣品總體分布情況，使用正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Least-Squares Discrimination Analysis，OPLS-DA）確定變量投影重要度（Variable Importance for Projection，VIP），采用VIP＞1、P＜0.05 且結(jié)合火山圖（FC＞2）的條件篩選出差異代謝物，再用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步揭示具有統(tǒng)計(jì)意義的差異代謝物的靶向代謝通路。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 2021 和Excel 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并作圖。對(duì)于發(fā)酵液代謝物的差異變化，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用配對(duì)的Wilcoxon 非參數(shù)檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同DFC 組合對(duì)代表性人體腸道菌群中主要菌屬的影響

利用qPCR 測(cè)定不同DFC 組合發(fā)酵液48 h 腸道菌群菌屬的相對(duì)表達(dá)量，探究不同添加比例的DFC 干預(yù)下菌屬的變化。主要腸道菌群（大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和乳酸桿菌屬）的相對(duì)表達(dá)變化量如圖1 所示。

圖1 不同DFC 干預(yù)后代表性腸道菌群相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression of representative intestinal microbiota after different DFC intervention

由圖1 可知，女性組在不同添加比例的DFC 干預(yù)下，發(fā)酵液樣品中大腸桿菌屬和擬桿菌屬的含量相對(duì)于對(duì)照組均表現(xiàn)為下降，雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的含量相對(duì)于對(duì)照組均表現(xiàn)為上升。大腸桿菌屬相對(duì)表達(dá)量水平上，DFCF1 組為DFCFC 組的74.27%，顯著降低了25.73%（P＜0.05），DFCF2 組為DFCFC 組的60.89%，極顯著降低了39.11%（P＜0.01），DFCF3組為DFCFC 組的52.76%，極顯著降低了47.24%（P＜0.01），DFCF4 組為DFCFC 組的60.60%，極顯著降低了39.40%（P＜0.01）。擬桿菌屬相對(duì)表達(dá)量水平上，DFCF1 組為DFCFC 組的74.89%，顯著降低了25.11%（P＜0.05），DFCF2 組為DFCFC 組的68.83%，極顯著降低了31.17%（P＜0.01），DFCF3 組為DFCFC組的43.40%，極顯著降低了56.60%（P＜0.01），DFCF4組為DFCFC 組的52.88%，極顯著降低了47.12%（P＜0.01）。大腸桿菌屬與擬桿菌屬均在DFCF3 干預(yù)組中下降幅度最大。雙歧桿菌屬相對(duì)表達(dá)量水平上，DFCF1 組為DFCFC 組的163.37%，極顯著升高了63.37%（P＜0.01），DFCF2 組為DFCFC 組的182.00%，極顯著升高了82.00%（P＜0.01），DFCF3 組為DFCFC組的249.79%，極顯著升高了149.79%（P＜0.01），DFCF4 組為DFCFC 組的254.34%，極顯著升高了154.34%（P＜0.01）。乳酸桿菌屬相對(duì)表達(dá)量水平上，DFCF1 組為DFCFC 組的151.64%，極顯著升高了51.64%（P＜0.01），DFCF2 組為DFCFC 組的189.25%，極顯著升高了89.25%（P＜0.01），DFCF3 組為DFCFC組的232.99%，極顯著升高了132.99%（P＜0.01），DFCF4 組為DFCFC 組的225.09%，極顯著升高了125.09%（P＜0.01）。其中雙歧桿菌屬在DFCF4 干預(yù)組中上升幅度最大，但與DFCW3 干預(yù)組相差不大，乳酸桿菌屬在DFCF3 干預(yù)組中上升幅度最大。

男性組在不同添加比例DFC 干預(yù)下，發(fā)酵液樣品中大腸桿菌屬和擬桿菌屬的含量相對(duì)于對(duì)照組均表現(xiàn)為下降，雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的含量相對(duì)于對(duì)照組均表現(xiàn)為上升。大腸桿菌屬相對(duì)表達(dá)量水平上，DFCM1 組為DFCMC 組的71.08%，極顯著降低了28.92%（P＜0.01），DFCM2組為DFCMC組的55.01%，極顯著降低了44.99%（P＜0.01），DFCM3 組為DFCMC組的44.02%，極顯著降低了55.98%（P＜0.01），DFCM4 組為DFCMC 組的45.42%，極顯著降低了54.58%（P＜0.01）。擬桿菌屬相對(duì)表達(dá)量水平上，DFCM1 組為DFCMC 組的73.22%，極顯著降低了26.78%（P＜0.01），DFCM2組為DFCMC組的65.72%，極顯著降低了34.28%（P＜0.01），DFCM3 組為DFCMC組的53.14%，極顯著降低了46.86%（P＜0.01），DFCM4 組為DFCMC 組的54.10%，極顯著降低了45.90%（P＜0.01）。大腸桿菌屬與擬桿菌屬均在DFCM3 干預(yù)組中下降幅度最大。雙歧桿菌屬相對(duì)表達(dá)量水平上，DFCM1 組為DFCMC 組的148.35%，顯著升高了48.35%（P＜0.05），DFCM2 組為DFCMC組的177.80%，極顯著升高了77.80%（P＜0.01），DFCM3 組為DFCMC 組的228.71%，極顯著升高了128.71%（P＜0.01），DFCM4 組為DFCMC 組的221.68%，極顯著升高了121.68%（P＜0.01）。乳酸桿菌屬相對(duì)表達(dá)量水平上，DFCM1 組為DFCMC 組的141.77%，顯著升高了41.77%（P＜0.05），DFCM2組為DFCMC 組的172.20%，顯著升高了72.20%（P＜0.01），DFCM3 組為DFCMC 組的206.11%，極顯著升高了106.11%（P＜0.01），DFCM4 組為DFCMC組的209.98%，極顯著升高了109.98%（P＜0.01）。其中雙歧桿菌屬在DFCM3 干預(yù)組中上升幅度最大，乳酸桿菌屬在DFCM4 干預(yù)組中上升幅度最大，與DFCM3 干預(yù)組相差不大。

通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)膳食纖維復(fù)合體對(duì)大腸桿菌屬的抑制作用男性組較強(qiáng)，對(duì)擬桿菌屬的抑制作用女性組較強(qiáng)，對(duì)雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的增值能力女性組較大，DFC 添加量為2%時(shí)的效果最優(yōu)。王津等[25]研究顯示最優(yōu)膳食纖維比例為2%的茶膳食纖維可對(duì)腸道菌群有益生調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果與上述學(xué)者的研究結(jié)果相似，說(shuō)明體外發(fā)酵時(shí)膳食纖維的添加量不是越多越好。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)廣西長(zhǎng)壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維組合對(duì)年輕小鼠具有良好抗衰老效果[3]。本研究發(fā)現(xiàn)在體外發(fā)酵條件下，廣西長(zhǎng)壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體干預(yù)后，老年志愿者糞便發(fā)酵液中雙歧桿菌屬與乳酸桿菌屬相對(duì)含量增加顯著，大腸桿菌屬與擬桿菌屬相對(duì)含量顯著減少。體外發(fā)酵培養(yǎng)下，糞便中的菌群能夠利用膳食纖維進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，這會(huì)抑制大腸桿菌屬和擬桿菌屬等繁殖，也會(huì)促使雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬等有益菌進(jìn)行繁殖[26]。趙文婧等[27]發(fā)現(xiàn)谷子（小米）中的可溶性膳食纖維對(duì)大腸桿菌有顯著的抑制作用，且均呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。張峰等[28]發(fā)現(xiàn)高膳食纖維飲食可以降低擬桿菌的數(shù)量。Daniel 等[29]對(duì)比大量研究發(fā)現(xiàn)膳食纖維干預(yù)，特別是果聚糖和低聚半乳糖，可提高雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的糞便豐度。本研究與趙文婧與張峰的研究相比對(duì)大腸桿菌和擬桿菌屬的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)更加直觀的數(shù)據(jù)表明了DFC 對(duì)大腸桿菌和擬桿菌屬的抑制作用；本研究與Daniel 的研究相比發(fā)現(xiàn)，體外條件下廣西長(zhǎng)壽飲食模式介導(dǎo)的DFC 干預(yù)后雙歧桿菌和乳酸桿菌屬的相對(duì)表達(dá)量更高。表明廣西長(zhǎng)壽飲食模式介導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體可以較好的調(diào)節(jié)腸道微生物組成，從而改善人體健康狀態(tài)。

2.2 發(fā)酵液樣品1H-NMR 圖譜標(biāo)定

對(duì)發(fā)酵液樣品譜圖進(jìn)行1H-NMR 圖譜定標(biāo)及積分，典型圖譜見(jiàn)圖2，根據(jù)每種代謝物的化學(xué)位移和信號(hào)多樣性，結(jié)合先前報(bào)道文獻(xiàn)[30-32]和人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB；http://www.hmdb.ca/）鑒定并量化了41 種代謝物。

2.3 發(fā)酵48 h DFC3 干預(yù)組與對(duì)照組腸道菌群代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析

DFC3 干預(yù)組與對(duì)照組腸道菌群代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 DFC3 干預(yù)組與對(duì)照組腸道菌群代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析Fig.3 Multivariate statistical analysis of intestinal microbiota metabolites in DFC3 intervention group and control group

如圖3 所示，DFC3 干預(yù)組與對(duì)照組樣品腸道菌群代謝物的分布可以分開(kāi)，其中DFCF3 組PCA 模型的累計(jì)解釋率R2X=0.855，得到2 個(gè)主成分，DFCM3 組PCA 模型累計(jì)解釋率R2X=0.765，得到2個(gè)主成分，此處的PCA 模型是可以參考的。PCA 模型得分圖表明，體外發(fā)酵后DFC3 組和對(duì)照組之間存在良好的分離，表明該模型可以較好地區(qū)分發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物。

2.4 DFC3 組差異代謝物的篩選

根據(jù)腸道菌群的結(jié)果可知，DFC3 組是最優(yōu)的，以DFC3 組為主分析代謝物的變化。由圖4a 及圖4c的火山圖（FC＞2）和圖4b 及圖4d 的OPLS-DA 評(píng)分圖中的VIP 值（VIP＞1），篩選出明顯不同的代謝物，并將其選為潛在的代謝標(biāo)志物，再與對(duì)照組相比，辨識(shí)廣西長(zhǎng)壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體對(duì)于糞便菌群代謝物產(chǎn)生的生化影響作用（表6 與表7）。

圖4 DFC3 組的火山圖與VIP 值圖Fig.4 Volcano map and VIP value map of DFC3 group

表6 DFCF3 組與對(duì)照組相對(duì)比的差異代謝物Table 6 The differential metabolites of DFCF3 group compared with control group

表7 DFCM3 組與對(duì)照組相對(duì)比的差異代謝物Table 7 The differential metabolites of DFCM3 group compared with control group

由表6 可知，與女性對(duì)照組相比，DFCF3 組共有12 種代謝物發(fā)生了顯著變化，其中，異丁酸、丙酸、甲酸相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.01），蛋氨酸、組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙三醇、天冬氨酸、精氨酸、甲基組氨酸的相對(duì)豐度顯著減少（P＜0.01）。由表7 可知，與男性對(duì)照組相比，DFCM3 組共有9種代謝物發(fā)生了顯著變化，其中異丁酸、丙酸、丁酸鹽、甲酸相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.01），組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸相對(duì)豐度顯著減少（P＜0.01）。對(duì)比DFCF3 組與DFCM3 組的差異代謝物變化發(fā)現(xiàn)，共有的差異代謝物有異丁酸、丙酸、甲酸、組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸，且變化趨勢(shì)相同。其中，DFCF3 組中異丁酸、丙酸、甲酸的FC 值均高于男性DFCM3 組，DFCF3組中組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸的FC 值均低于DFCM3 組，DFCF3 組天冬氨酸的FC 值高于DFCM3 組。

DFC 干預(yù)下，志愿者糞便中的腸道菌群發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸在維持腸道健康和促進(jìn)動(dòng)物和人類(lèi)粘膜免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用[33]，還防止胃腸道中病原體的附著和過(guò)度生長(zhǎng)[34]。Sara 等[35]的研究表明，富含高纖維的飲食模式可有效增加腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸。黃妙如等[36]的研究發(fā)現(xiàn)金柚幼果膳食纖維具有提高結(jié)腸內(nèi)容物質(zhì)酵解反應(yīng)發(fā)生速度的作用，產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸。上述結(jié)果與本研究的結(jié)果相似。在膳食纖維復(fù)合體干預(yù)后，志愿者糞便發(fā)酵液中短鏈脂肪酸水平顯著升高，主要原因可能是膳食纖維有效促進(jìn)可降解纖維的細(xì)菌增值代謝。因此，廣西長(zhǎng)壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體干預(yù)老年志愿者糞便后，短鏈脂肪酸的升高可能會(huì)促進(jìn)粘膜免疫反應(yīng)，增強(qiáng)人體腸道健康。

根據(jù)表6 與表7 可知，DFC3 組相對(duì)于對(duì)照組葡萄糖相對(duì)豐度顯著下降。Jee 等[37]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖濃度處于低水平時(shí)對(duì)機(jī)體健康呈現(xiàn)有益作用，Townsend等[38]研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖會(huì)阻礙有益菌在腸道定植。本研究中膳食纖維復(fù)合體干預(yù)后的實(shí)驗(yàn)組β-葡萄糖相對(duì)含量下降，并結(jié)合有益菌相對(duì)含量增加，表明廣西長(zhǎng)壽飲食模式指導(dǎo)下的膳食纖維復(fù)合體對(duì)腸道有益菌的定制起到了一定的促進(jìn)作用，可能增強(qiáng)機(jī)體健康狀態(tài)。

2.5 DFC3 組與對(duì)照組相比差異代謝物的代謝途徑分析

為衡量得出的差異代謝物是否反映了其代謝途徑的協(xié)同變化，使用MetaboAnalyst 5.0 分別將女性組12種差異代謝物和男性組9 種差異代謝物進(jìn)行代謝物組富集分析和途徑分析。選擇Home sapiens 路徑數(shù)據(jù)庫(kù)和Fisher 檢驗(yàn)對(duì)代謝標(biāo)志物進(jìn)行路徑富集分析，選擇Hypergeometric Test 和Relative-betweeness Centrality對(duì)所影響的通路進(jìn)行拓?fù)浞治?，被顯著改變的代謝標(biāo)志物會(huì)被映射到與其相關(guān)的代謝路徑上，并用來(lái)解釋代謝結(jié)果。根據(jù)影響閾值大于0.1 和P＜0.05 這兩個(gè)條件篩選潛在的目的代謝通路，結(jié)果如圖5，女性組與男性組均有2 種潛在的代謝途徑，分別為：（1）組氨酸代謝，（2）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。

圖5 DFC3 組與對(duì)照組相比差異代謝物路徑富集分析和拓?fù)浞治鯢ig.5 Pathway enrichment analysis and topological analysis of different metabolites in DFC3 group compared with control group

DFC3 組相對(duì)于對(duì)照組組氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸相對(duì)豐度顯著下降。越來(lái)越多的證據(jù)表明，像氨基酸和短鏈脂肪酸的細(xì)菌代謝產(chǎn)物是宿主生理學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[39]，腸道氨基酸可以有效預(yù)測(cè)機(jī)體健康狀況，在診斷疾病方面具有良好潛力[40]。氨基酸作為微生物產(chǎn)生SCFAs 的前體，對(duì)于合成在信號(hào)通路和代謝中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能的各種生物活性化合物至關(guān)重要[41]。Neis 等[42]研究表明蘇氨酸、賴(lài)氨酸和谷氨酸可用于丁酸鹽的合成。色氨酸是化學(xué)上最復(fù)雜的氨基酸，幾乎可以在其結(jié)構(gòu)中的每個(gè)原子上進(jìn)行生化轉(zhuǎn)化，使其成為多種轉(zhuǎn)化的最佳基質(zhì)[43]，腸道微生物利用色氨酸酶將色氨酸代謝為吲哚，然后吲哚進(jìn)入宿主門(mén)靜脈循環(huán)，在肝臟中轉(zhuǎn)化為硫酸吲哚酚，接著由腎臟排出，高濃度時(shí)具有腎毒性[44]。腸道微生物群對(duì)組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的微生物代謝導(dǎo)致許多與疾病相關(guān)的化合物[45]，組氨酸經(jīng)腸道菌群可代謝為丙酸咪唑，在T2DM 患者中發(fā)現(xiàn)丙酸咪唑升高，并通過(guò)激活p38γ-p62-mTORC1 通路106 損害胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[46]。高苯丙氨酸可能引起苯丙酮尿癥及神經(jīng)系統(tǒng)的損害等，其中神經(jīng)系統(tǒng)損害尤為明顯，可引起精神障礙、智力缺陷、運(yùn)動(dòng)減退等[47]。本研究中膳食纖維復(fù)合體干預(yù)后的實(shí)驗(yàn)組蘇氨酸、苯丙氨酸及組氨酸相對(duì)含量下降，表明廣西長(zhǎng)壽飲食模式指導(dǎo)下的抗衰老膳食纖維復(fù)合體能夠促進(jìn)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，可能減少患病風(fēng)險(xiǎn)，增強(qiáng)機(jī)體健康狀態(tài)。

3 結(jié)論

本研究探究了體外發(fā)酵條件下老年志愿者糞便典型腸道菌群及腸道菌群代謝物的變化。結(jié)果表明：與不加膳食纖維的對(duì)照組相對(duì)，廣西長(zhǎng)壽飲食模式指導(dǎo)下的抗衰老膳食纖維復(fù)合體對(duì)老年志愿者腸道典型菌群起到了明顯的正向化調(diào)控作用，增加了有益菌雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬的豐度，減少了有害菌大腸桿菌屬和擬桿菌屬的豐度。女性組共篩選出12 種差異代謝物，分別為異丁酸、丙酸、甲酸、蛋氨酸、組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙三醇、天冬氨酸、精氨酸和1-甲基組氨酸，涉及組氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成這兩條代謝途徑；男性組共篩選出9 種差異代謝物分別為異丁酸、丙酸、丁酸鹽、甲酸、組氨酸、β-葡萄糖、苯丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸，涉及組氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成這兩條代謝途徑。對(duì)豐富發(fā)展膳食纖維通過(guò)改善老年人體腸道菌群促進(jìn)身體健康的理論提供了一定的參考。