李 丹, 余 瓊, 劉 群, 任新玲, 靳 鐳

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,武漢 430030

自發(fā)性皺縮是囊胚在擴(kuò)張過(guò)程中常見的一種現(xiàn)象,它指的是≥50%的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞表面從透明帶的內(nèi)側(cè)自然分離[1],囊腔出現(xiàn)塌陷。自發(fā)性皺縮發(fā)生的原因尚未可知,其是否影響輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的研究也較少。目前胚胎選擇主要依據(jù)形態(tài)學(xué)評(píng)估,按照Gardner囊胚評(píng)分體系[2]根據(jù)囊胚腔擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophectoderm,TE)的形態(tài)和數(shù)目對(duì)囊胚質(zhì)量進(jìn)行分級(jí),該系統(tǒng)并沒(méi)有涵蓋囊胚形態(tài)的所有方面,有其局限性。本研究通過(guò)觀察凍融移植周期囊胚自發(fā)性皺縮和妊娠結(jié)局之間的關(guān)系,探討自發(fā)性皺縮是否是影響妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)因素,并可能為胚胎選擇提供新的方法,以改善ART后的妊娠結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2018年1月至2020年12月在我院接受單囊胚凍融移植的10120個(gè)周期的臨床資料,將移植胚胎為自發(fā)性皺縮囊胚的133個(gè)周期(皺縮組)作為研究對(duì)象,為避免選擇偏倚,傾向性評(píng)分匹配(propensity score matching,PSM)優(yōu)先匹配女方年齡、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、不孕類型、子宮內(nèi)膜厚度后獲得133個(gè)周期移植胚胎為未皺縮囊胚(未皺縮組),分別比較兩組的妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局。納入標(biāo)準(zhǔn):①夫妻雙方染色體核型正常;②單囊胚移植周期;③移植胚胎為自發(fā)性皺縮囊胚(圖1)。排除標(biāo)準(zhǔn):復(fù)蘇后激光人工皺縮未完全擴(kuò)張的胚胎。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者夫妻雙方均了解并知情同意。

左圖所示為皺縮組移植囊胚,右圖箭頭所示為自發(fā)性皺縮

1.2 研究方法

1.2.1 囊胚培養(yǎng)及評(píng)估 按本中心常規(guī)方案促排卵,當(dāng)有2～3個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)10000 U,36 h后在陰道超聲監(jiān)測(cè)下穿刺取卵。取出卵母細(xì)胞后,采用常規(guī)體外受精、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)進(jìn)行受精,受精后將胚胎置于G-1卵裂培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)中,在37℃,6.0% CO2,5.0% O2,89.0% N2的EmbryoScopeTM延時(shí)監(jiān)測(cè)(time-lapse monitoring,TLM)培養(yǎng)箱(Vitrolife,瑞典)中進(jìn)行體外胚胎培養(yǎng)。16～18 h觀察原核后繼續(xù)培養(yǎng)至第3天,根據(jù)胚胎卵裂情況,挑選1～2個(gè)卵裂期胚胎用于新鮮周期移植或冷凍,剩下的胚胎轉(zhuǎn)移至G-2(Vitrolife,瑞典)囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)到第5天(D5)或第6天(D6),將達(dá)到冷凍標(biāo)準(zhǔn)的囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍保存,在玻璃化冷凍保存前對(duì)完全膨脹的囊胚進(jìn)行激光人工皺縮。囊胚形態(tài)評(píng)估按照Gardner囊胚評(píng)分體系[2]根據(jù)囊胚腔擴(kuò)張程度分為6期:1期,囊腔出現(xiàn),囊腔范圍小于胚胎體積的一半;2期,囊腔范圍等于或大于胚胎體積的一半;3期,囊腔占滿胚胎,但未完全擴(kuò)張;4期,囊腔完全擴(kuò)張,體積增大,透明帶薄;5期,囊胚正從透明帶(zona pellucida,ZP)孵出;6期,囊胚完全從ZP孵出。再根據(jù)ICM和TE的形態(tài)和數(shù)目對(duì)囊胚質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)。ICM分級(jí):細(xì)胞數(shù)目多,排列緊密為A級(jí);細(xì)胞數(shù)目少,排列松散為B級(jí);細(xì)胞數(shù)目很少為C級(jí)。TE分級(jí):細(xì)胞數(shù)目多,結(jié)構(gòu)致密為A級(jí);細(xì)胞數(shù)目少,排列松散為B級(jí);細(xì)胞數(shù)目很少為C級(jí)。

1.2.2 囊胚冷凍及復(fù)蘇程序 本研究所用冷凍液、載桿、復(fù)蘇液均購(gòu)自日本KITAZATO生物制藥有限公司。按照本中心常規(guī)步驟進(jìn)行囊胚冷凍復(fù)蘇[3]。復(fù)蘇后的囊胚均置入37℃,6.0% CO2,5.0% O2的培養(yǎng)箱培養(yǎng),2～4 h后觀察囊胚色澤及囊胚腔是否重新擴(kuò)張,進(jìn)行移植,囊胚腔重新擴(kuò)張且形態(tài)清晰、光澤明亮的囊胚被認(rèn)為存活。

1.2.3 妊娠及新生兒結(jié)局的評(píng)估 囊胚移植后12～14 d進(jìn)行HCG檢測(cè)。著床指囊胚移植4～6周行陰道B超可見到孕囊;臨床妊娠為囊胚移植后至少5周行陰道B超可見孕囊,包括宮外孕;臨床妊娠后12周內(nèi)無(wú)胎心活動(dòng)為早期流產(chǎn);活產(chǎn)周期中,滿20周至37周前分娩為早產(chǎn);出生缺陷是指在出生時(shí)或出生以后表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)、功能或發(fā)育異常。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組間基礎(chǔ)資料的比較

經(jīng)PSM匹配后得到皺縮組與未皺縮組各133個(gè)周期。PSM后兩組的女方年齡、FSH、BMI、不孕類型、子宮內(nèi)膜厚度等的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 傾向性評(píng)分匹配后兩組間基礎(chǔ)資料的比較[M(P25,P75)]

2.2 移植囊胚出現(xiàn)自發(fā)性皺縮現(xiàn)象

觀察胚胎出現(xiàn)自發(fā)性皺縮現(xiàn)象,滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞表面從透明帶的內(nèi)側(cè)自然分離的面積≥50%,囊腔出現(xiàn)塌陷。見圖1。

2.3 兩組的妊娠結(jié)局比較

皺縮組活產(chǎn)率明顯低于未皺縮組(30.08%vs.45.86%,P<0.01),皺縮組著床率、臨床妊娠率降低,早期流產(chǎn)率升高,但與未皺縮組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組妊娠結(jié)局比較[n(%)]

2.4 多因素Logistic回歸分析各因素對(duì)活產(chǎn)率的影響

對(duì)影響母體活產(chǎn)的相關(guān)因素進(jìn)行Logistic回歸分析結(jié)果顯示,女方年齡、不孕類型、囊胚是否發(fā)生自發(fā)性皺縮對(duì)活產(chǎn)有顯著影響(均P<0.05),考慮到其它協(xié)變量后,囊胚皺縮組與未皺縮組的活產(chǎn)優(yōu)勢(shì)比(odds ratio,OR)為0.54(95%CI:0.32～0.91)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析各因素對(duì)活產(chǎn)率的影響

2.5 兩組新生兒一般情況及結(jié)局比較

皺縮組和未皺縮組各有1個(gè)雙胎妊娠活產(chǎn)周期(2個(gè)均為男性雙胎),本研究?jī)H比較兩組間單胎妊娠的新生兒結(jié)局。兩組間新生兒出生時(shí)天數(shù)、出生體重、男性新生兒比例比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表4。兩組活產(chǎn)新生兒中各有2例早產(chǎn),皺縮組單胎妊娠新生兒有1例出生缺陷,為嬰兒腎上腺增大;未皺縮組單胎妊娠新生兒無(wú)出生缺陷。

表4 兩組單胎妊娠新生兒結(jié)局比較

3 討論

近年來(lái),隨著社會(huì)壓力增大、環(huán)境污染加劇以及婦女生育年齡推遲,不孕癥患病率逐年上升[4-5],其中許多人最終需要ART進(jìn)行治療。ART已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)性程序發(fā)展成為一種主流醫(yī)學(xué),為世界帶來(lái)了700多萬(wàn)兒童[6]。盡管技術(shù)不斷改進(jìn),仍然有幾乎一半的患者在接受幾個(gè)周期治療后都沒(méi)有成功活產(chǎn)[7]。同時(shí)由于胚胎著床效率低,移植多個(gè)胚胎導(dǎo)致了較高的多胎妊娠率。所以,目前體外受精的主要目標(biāo)之一就是如何選擇最合適的胚胎移植以提高活產(chǎn)率,同時(shí)將多胎妊娠相關(guān)的并發(fā)癥降到最低。本研究觀察凍融移植周期囊胚自發(fā)性皺縮是否影響妊娠結(jié)局,期望可以改進(jìn)胚胎選擇的方法,以改善ART后的妊娠結(jié)局。

自發(fā)性皺縮是發(fā)生在囊胚孵化過(guò)程中常見的一種現(xiàn)象,其發(fā)生僅需幾秒,可持續(xù)1～2 h且可以多次發(fā)生。自發(fā)性皺縮最早見于哺乳動(dòng)物的胚胎,Lewis等[8]用延時(shí)攝影技術(shù)監(jiān)測(cè)體外培養(yǎng)的兔子囊胚8 d,發(fā)現(xiàn)囊胚在發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)反復(fù)收縮和再擴(kuò)張。Massip等[9-10]在奶牛模型上發(fā)現(xiàn),自發(fā)性皺縮影響奶牛囊胚的正常孵化,囊胚在擴(kuò)張過(guò)程中被多次自發(fā)性皺縮反復(fù)打斷后,即使ZP破裂囊胚也不能正常孵化,囊胚最終坍塌和退化。Niimura[11]通過(guò)延時(shí)顯微攝影技術(shù)分析小鼠囊胚的收縮情況,出現(xiàn)連續(xù)的弱收縮(體積縮小<20%)的囊胚大部分能正常孵化,而那些出現(xiàn)強(qiáng)烈皺縮(體積縮小≥20%)的囊胚則不能正常孵化,囊胚是否出現(xiàn)強(qiáng)烈皺縮可以用來(lái)評(píng)估小鼠胚胎的發(fā)育能力。Iwata等[12]觀察人類囊胚體外孵化的過(guò)程也報(bào)道了類似的結(jié)果,未孵化囊胚的自發(fā)性皺縮次數(shù)明顯高于成功孵化的囊胚,囊胚經(jīng)歷幾次自發(fā)性皺縮后最終退化。

Marcos等[1]將滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞表面從透明帶的內(nèi)側(cè)分離的面積≥50%定義為皺縮,面積<50%為胚胎搏動(dòng),視為收縮,并首次報(bào)道了人囊胚自發(fā)性皺縮對(duì)妊娠結(jié)局的影響。通過(guò)TLM精確觀察到囊胚自發(fā)性皺縮與植入率降低相關(guān)(35.1%vs.48.5%,P<0.05),建議優(yōu)先選擇沒(méi)有出現(xiàn)自發(fā)性皺縮的囊胚移植,并建議將囊胚是否出現(xiàn)自發(fā)性皺縮作為現(xiàn)有胚胎選擇模型的附加標(biāo)準(zhǔn)。Sciorio等[13]通過(guò)TLM回顧性分析了356個(gè)新鮮周期D5單囊胚移植的妊娠結(jié)局,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與294例移植未皺縮囊胚周期相比,移植62例自發(fā)性皺縮囊胚(體積減小≥50%)周期植入率(22.6%vs.61.2%,P<0.01)和持續(xù)妊娠率(ongoing pregnancy rate,OPR)明顯降低(17.7%vs.53.7%,P<0.01),囊胚出現(xiàn)自發(fā)性皺縮可以作為低妊娠結(jié)局的胚胎標(biāo)志物。Sciorio等[14]另一篇研究回顧性分析了1297例新鮮周期D5單囊胚移植的妊娠結(jié)局后發(fā)現(xiàn),移植自發(fā)性皺縮囊胚周期(259例)持續(xù)妊娠率顯著下降(37.5%vs.51.9%,P<0.01),對(duì)OPR進(jìn)行Logistic回歸分析后未皺縮組與皺縮組囊胚植入的OR為1.99(95%CI:1.43～2.75),移植自發(fā)性皺縮囊胚后植入并產(chǎn)生妊娠的可能性更小,自發(fā)性皺縮可以作為單囊胚移植胚胎選擇的新標(biāo)志物。

在本研究中,我們回顧性分析了凍融移植周期單囊胚移植后自發(fā)性皺縮與妊娠結(jié)局的關(guān)系,與未皺縮組相比,皺縮組的著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均有一定程度降低,早期流產(chǎn)率升高,但僅活產(chǎn)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)?？紤]混雜因素后,皺縮組與未皺縮組的活產(chǎn)OR為0.54(P<0.05),囊胚自發(fā)性皺縮是影響活產(chǎn)的危險(xiǎn)因素,囊胚出現(xiàn)自發(fā)性皺縮會(huì)影響ART的最終結(jié)局,導(dǎo)致活產(chǎn)的機(jī)會(huì)變小。自發(fā)性皺縮對(duì)近期妊娠結(jié)局指標(biāo)(著床率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率)影響不明顯,但對(duì)遠(yuǎn)期妊娠結(jié)局(是否活產(chǎn))影響顯著,考慮可能與以下幾個(gè)方面有關(guān):①滋養(yǎng)外胚層的形態(tài)和擴(kuò)張是預(yù)測(cè)活產(chǎn)的重要參數(shù)[15],囊胚發(fā)育時(shí)出現(xiàn)自發(fā)性皺縮后再膨脹可能會(huì)導(dǎo)致胚胎失去水分,損傷細(xì)胞之間的連接,導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)外胚層細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)異常[13-14],最終影響活產(chǎn)。②囊胚自發(fā)性皺縮后的再膨脹過(guò)程需要大量的能量,胚胎發(fā)生自發(fā)性皺縮后Na+/K+-ATPase需求量增加[11],能量的過(guò)度消耗可能會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生有害的長(zhǎng)期影響。③自發(fā)性皺縮的牛囊胚培養(yǎng)20 h后不能從培養(yǎng)液中吸收葡萄糖,而葡萄糖是體外囊胚發(fā)育的必要因素,自發(fā)性皺縮對(duì)代謝過(guò)程產(chǎn)生不利影響,從而對(duì)妊娠結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面影響[16-17]。此外,我們還比較了兩組間單胎妊娠的新生兒結(jié)局,兩組間新生兒出生時(shí)天數(shù)、出生體重、男性新生兒比例均無(wú)明顯差異(均P>0.05)。兩組活產(chǎn)新生兒中各有2例早產(chǎn),皺縮組單胎妊娠新生兒有1例出生缺陷,為嬰兒腎上腺增大;未皺縮組單胎妊娠新生兒無(wú)出生缺陷。

綜上所述,在凍融移植周期中,囊胚自發(fā)性皺縮會(huì)降低母體活產(chǎn)率,可以將囊胚是否發(fā)生自發(fā)性皺縮作為評(píng)價(jià)囊胚的指標(biāo)。若患者囊胚數(shù)量較多時(shí),盡量不選擇發(fā)生自發(fā)性皺縮的囊胚移植,這樣有助于進(jìn)一步改善凍融周期單囊胚移植的妊娠結(jié)局;若患者只有自發(fā)性皺縮囊胚可以移植,移植后活產(chǎn)并不會(huì)增加圍生期不良結(jié)局和新生兒缺陷的發(fā)生率。在以后的研究中我們期望可以結(jié)合TLM準(zhǔn)確觀察自發(fā)性皺縮次數(shù),準(zhǔn)確測(cè)量囊胚塌陷的程度,以建立囊胚塌陷模式與妊娠結(jié)局之間的關(guān)系,將人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)模型作為臨床妊娠的非侵入性標(biāo)記物,改進(jìn)胚胎選擇分析的方法,以最終改善患者的妊娠結(jié)局。