周 曼, 吳 軍, 干定云, 陳 婉, 曹 萍, 李廣利, 侯以琳

武漢市第三醫(yī)院(武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院)內(nèi)分泌科,武漢 430060

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活方式的改變,糖尿病的發(fā)病率逐年升高,已成為威脅人類健康的主要疾病[1]。2型糖尿病是糖尿病中最常見的一種,以高血糖和胰島素抵抗為特征[2]。目前,治療2型糖尿病的藥物多以降血糖為主,針對胰島素抵抗的治療方法較少[3]。由此可見,研究胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制對2型糖尿病的預(yù)防和治療具有重要意義。肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的多肽生長因子[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),HGF在胰島素抵抗2型糖尿病患者肝組織中顯著下調(diào),提示HGF可能與胰島素抵抗密切相關(guān)[5],但其在胰島素抵抗進(jìn)展中的作用機(jī)制尚不清楚。

外泌體可將大量調(diào)控分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNAs等傳遞到靶細(xì)胞,從而調(diào)控靶細(xì)胞的生物學(xué)功能[6]。最近的研究表明,外泌體可通過跨細(xì)胞傳遞參與胰島素抵抗[7]。本課題組前期收集了胰島素抵抗2型糖尿病患者的外泌體,通過高通量測序發(fā)現(xiàn)miR-93-5p在胰島素抵抗指數(shù)高的患者樣本中高表達(dá),且miR-93-5p可能靶向HGF[5],基于此我們推測外泌體來源的miR-93-5p可通過調(diào)節(jié)HGF參與胰島素抵抗。本研究構(gòu)建胰島素抵抗肝細(xì)胞模型,明確miR-93-5p對肝細(xì)胞HGF表達(dá)的影響,為2型糖尿病的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人肝癌細(xì)胞HepG2來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。MEM培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Gibco公司,PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、抗熒光衰減封片劑(含DAPI)、Triton X-100、5%BSA封閉液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液購于中國Solarbio公司,葡萄糖購于阿拉丁公司,Trizol購于Ambion公司,SYBR FAST qPCR Master Mix購于KAPA Biosystems公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司,氯仿、異丙醇、無水乙醇、甲醛購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,葡萄糖檢測試劑盒購于南京建成公司,PVDF轉(zhuǎn)移膜購于Millipore公司,免疫熒光GLUT4抗體購于Invitrogen公司,Western blot一抗HGF、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)、GAPDH、熒光基團(tuán)594標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于武漢Bioswamp公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后,接種在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液,細(xì)胞融合率達(dá)到90%時(shí)胰酶消化,傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 胰島素抵抗模型的構(gòu)建

收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,接種于6孔板中,每孔5×105個(gè)細(xì)胞,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到70%～80%匯合后,PBS洗滌2次,分別用含生理濃度葡萄糖(5.5 mmol/L)或高糖(30 mmol/L)培養(yǎng)液孵育48 h,建立高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗細(xì)胞模型[5]。模型構(gòu)建完成后取出細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)4 h后檢測450 nm處的吸光度值,以此表示細(xì)胞增殖能力,鑒定模型構(gòu)建是否成功。結(jié)果顯示模型構(gòu)建成功。

1.4 qPCR檢測HepG2細(xì)胞中miR-93-5p、HGF、GLUT4 mRNA的表達(dá)

收集對照組和模型組細(xì)胞,PBS洗滌3次。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成,引物序列見表1。分別以U6和GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物信息

1.5 miR-93-5p mimics、inhibitor構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組

構(gòu)建并合成miR-93-5p mimics、inhibitor相應(yīng)對照(NC),轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中,qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。將細(xì)胞分為對照組、模型組、miR-93-5p inhibitor組、inhibitor-NC組、miR-93-5p mimics組和mimics-NC組。對照組不作處理,正常培養(yǎng);模型組細(xì)胞用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng),構(gòu)建胰島素抵抗模型;其余組分別依次轉(zhuǎn)染miR-93-5p inhibitor、inhibitor-NC、miR-93-5p mimics、mimics-NC,轉(zhuǎn)染完成后再用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)構(gòu)建胰島素抵抗模型。處理完成后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入CCK-8溶液,檢測細(xì)胞存活率。

1.6 細(xì)胞葡萄糖消耗量檢測

設(shè)置測定孔、空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔,分別加入3 μL樣本、雙蒸水和標(biāo)準(zhǔn)液,每孔加入300 μL工作液,混勻,37℃孵育15 min,酶標(biāo)儀檢測505 nm處的吸光度(A)值。葡萄糖含量(mmol/L)=(各組A值/標(biāo)準(zhǔn)液A值)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度。葡萄糖消耗量(mmol/L)=原葡萄糖含量-實(shí)驗(yàn)組葡萄糖含量。

1.7 qPCR和Western blot檢測miR-93-5p、HGF、GLUT4的表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA,qPCR檢測HepG2細(xì)胞中miR-93-5p、HGF、GLUT4 mRNA的表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,上樣電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉過夜,加入一抗稀釋液孵育,洗膜,加入二抗稀釋液孵育,洗膜后ECL顯色。讀取條帶灰度值,目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值即為蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 免疫熒光檢測GLUT4的表達(dá)和分布

分組處理后的細(xì)胞以4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS洗滌,加入0.5% Triton X-100室溫通透30 min,PBS洗滌后用5%BSA封閉1 h,加入一抗稀釋液孵育過夜,PBS洗滌后加入二抗稀釋液孵育1 h,最后加入300 μL抗熒光淬滅封片液(含DAPI),熒光顯微鏡觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中miR-93-5p、HGF、GLUT4 mRNA的表達(dá)

qPCR檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組細(xì)胞中miR-93-5p水平顯著升高(P<0.01),而HGF、GLUT4 mRNA水平顯著降低(均P<0.01)。見圖1。

**P<0.01

2.2 miR-93-5p對高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞活力和葡萄糖消耗的影響

CCK-8和生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組細(xì)胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著降低(均P<0.01);與inhibitor-NC組相比,miR-93-5p inhibitor組細(xì)胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著升高(均P<0.01);與mimics-NC組相比,miR-93-5p mimics組細(xì)胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著降低(均P<0.01)。見圖2。

1:對照組;2:模型組;3:miR-93-5p inhibitor組;4:inhibitor-NC組;5:miR-93-5p mimics組;6:mimics-NC組;**P<0.01

2.3 miR-93-5p對高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中HGF和GLUT4 mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組細(xì)胞中miR-93-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),HGF和GLUT4 mRNA表達(dá)水平顯著降低(均P<0.01);與inhibitor-NC組相比,miR-93-5p inhibitor組細(xì)胞中miR-93-5p水平顯著降低(P<0.01),HGF和GLUT4 mRNA表達(dá)水平顯著升高(均P<0.01);與mimics-NC組相比,miR-93-5p mimics組細(xì)胞中miR-93-5p水平顯著升高(P<0.01),HGF和GLUT4 mRNA表達(dá)水平顯著降低(均P<0.01)。見圖3。

1:對照組;2:模型組;3:miR-93-5p inhibitor組;4:inhibitor-NC組;5:miR-93-5p mimics組;6:mimics-NC組;**P<0.01

2.4 miR-93-5p對高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中HGF和GLUT4蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組細(xì)胞中HGF和GLUT4蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.01);與inhibitor-NC組相比,miR-93-5p inhibitor組細(xì)胞中HGF和GLUT4蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.01);與mimics-NC組相比,miR-93-5p mimics組細(xì)胞中HGF和GLUT4蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。見圖4。

1:對照組;2:模型組;3:miR-93-5p inhibitor組;4:inhibitor-NC組;5:miR-93-5p mimics組;6:mimics-NC組;A:Western blot檢測HGF和GLUT4蛋白表達(dá)條帶圖;B:HGF蛋白表達(dá)水平的比較;C:GLUT4蛋白表達(dá)水平的比較;*P<0.05,**P<0.01

2.5 miR-93-5p對高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞GLUT4分布的影響

免疫熒光結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組GLUT4膜分布明顯減少,熒光強(qiáng)度也明顯減弱;與inhibitor-NC組相比,miR-93-5p inhibitor組GLUT4膜分布明顯增多,熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng);與mimics-NC組相比,miR-93-5p mimics組GLUT4膜分布減少,熒光強(qiáng)度減弱。見圖5。

1:對照組;2:模型組;3:miR-93-5p inhibitor組;4:inhibitor-NC組;5:miR-93-5p mimics組;6:mimics-NC組

3 討論

HepG2細(xì)胞表面含有大量胰島素受體,研究表明,高水平的胰島素能夠減少HepG2細(xì)胞表面的胰島素受體,且HepG2細(xì)胞易于體外實(shí)驗(yàn)操作培養(yǎng),因此本研究選擇HepG2細(xì)胞為研究對象構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型,研究外泌體miR-93-5p和HGF在胰島素抵抗中的作用[8-9]。胰島素抵抗主要表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和肝細(xì)胞對胰島素的敏感性降低、胰島素信號失調(diào)以及葡萄糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂等[10]。外泌體中的miRNAs在包括細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥和糖脂代謝等多種與胰島素抵抗密切相關(guān)的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[11]。本研究結(jié)果顯示,miR-93-5p在胰島素抵抗細(xì)胞模型中的表達(dá)較正常細(xì)胞顯著上調(diào),證明miR-93-5p與胰島素抵抗密切相關(guān)。

研究表明,HGF與胰島素抵抗密切相關(guān)。高水平的HGF能夠改善小鼠胰島β細(xì)胞的功能,改善肥胖小鼠體內(nèi)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)[12-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)敲低HGF能夠促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的增殖,而過表達(dá)HGF能夠促進(jìn)胰島素抵抗細(xì)胞模型的凋亡[5]。本研究顯示HGF mRNA在胰島素抵抗細(xì)胞模型中的表達(dá)顯著下調(diào),表明HGF與胰島素抵抗密切相關(guān)。Starbase V2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-93-5p可能靶向HGF,為了進(jìn)一步明確外泌體miR-93-5p對HGF表達(dá)的影響,本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-93-5p inhibitor后胰島素抵抗細(xì)胞模型中HGF表達(dá)顯著上調(diào),而轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics后HGF的表達(dá)顯著下調(diào)。此外,轉(zhuǎn)染miR-93-5p inhibitor后胰島素抵抗細(xì)胞模型的細(xì)胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著升高,而轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics后細(xì)胞存活率和葡萄糖消耗量均顯著降低,進(jìn)一步說明miR-93-5p可通過靶向抑制胰島素抵抗細(xì)胞模型中HGF的表達(dá)來抑制葡萄糖的吸收,從而導(dǎo)致胰島素抵抗,引起血糖失衡。

GLUT4是細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的一種載體蛋白,對維持機(jī)體葡萄糖的穩(wěn)態(tài)具有重要作用[14-16]。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics后胰島素抵抗細(xì)胞模型中GLUT4的表達(dá)下調(diào),而轉(zhuǎn)染miR-93-5p inhibitor后GLUT4的表達(dá)上調(diào),提示miR-93-5p能夠抑制GLUT4的表達(dá),進(jìn)而抑制葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明,胰島素能夠使GLUT4從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上,發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的作用[17-18]。周暉等[19]發(fā)現(xiàn)GLUT4膜轉(zhuǎn)位增加能夠改善胰島素抵抗。為了明確miR-93-5p對GLUT4分布的影響,我們又利用免疫熒光檢測了GLUT4的表達(dá)和分布,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-93-5p inhibitor后胞質(zhì)內(nèi)GLUT4膜轉(zhuǎn)位增加,熒光強(qiáng)度增強(qiáng),而轉(zhuǎn)染miR-93-5p mimics后GLUT4的膜分布減少,熒光強(qiáng)度也減弱,提示miR-93-5p能抑制GLUT4的表達(dá),并減少GLUT4的膜分布,抑制葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而破壞機(jī)體葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。

綜上所述,miR-93-5p能夠抑制胰島素抵抗細(xì)胞模型中HGF和GLUT4的表達(dá),并減少GLUT4的膜分布,從而抑制葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收,導(dǎo)致胰島素抵抗。本研究的不足之處在于只對miR-93-5p與胰島素抵抗的相關(guān)性進(jìn)行了初步探索,未來還需深入研究或探討miR-93-5p參與胰島素抵抗的具體分子機(jī)制。