郝芳敏,董文杰,臧全宇,馬二磊,丁偉紅,王毓洪
(1.寧波市特色園藝作物品質(zhì)調(diào)控和抗性育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江寧波 315040;2.浙江萬(wàn)里學(xué)院 浙江寧波 315040)
甜瓜是世界十大水果之一,也是我國(guó)廣泛栽種的經(jīng)濟(jì)作物之一。在甜瓜種植面積不斷擴(kuò)大、產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益穩(wěn)步上升的同時(shí),甜瓜病害卻日益嚴(yán)重,特別是甜瓜枯萎病、根腐病、蔓枯病等病害,極大地影響了甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì),限制甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。其中,甜瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌甜瓜專(zhuān)化型(Fusarium oxysporumf.sp.melonis)引起,是一種土傳病害,在甜瓜全生育期均可發(fā)生,通常造成瓜田植株大片死亡[1]。甜瓜根腐病和黑點(diǎn)根腐病分別是由腐皮鐮刀菌(F.solani)[2]和坎諾單孢菌(Monosporascus cannonballus)[3]引起的土傳病害,均可引起根腐病,造成甜瓜藤蔓急性凋萎,嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。甜瓜蔓枯病是由Stagonosporopsis cucurbitacearum引起的病害,主要危害莖蔓和葉片,該病發(fā)病極快,一旦發(fā)生蔓延很難控制[4]。由亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)引起的甜瓜果腐病,多危害半成熟和成熟的果實(shí),發(fā)病初期果實(shí)呈水漬狀病斑,后期內(nèi)部開(kāi)始腐爛,該病害初期不易發(fā)現(xiàn),不能夠及時(shí)進(jìn)行防治,一旦發(fā)生,嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量[5-6]。
目前針對(duì)上述病害主要使用傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法,但是會(huì)造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問(wèn)題,對(duì)人們的健康及生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害,甚至可能導(dǎo)致社會(huì)普遍關(guān)注的食品安全問(wèn)題。因此,急需采用高效、無(wú)公害的生物技術(shù)防治甜瓜病害,生物防治具有安全、綠色、高效等優(yōu)點(diǎn),對(duì)甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種革蘭氏陰性菌,是植物根際微生態(tài)和土壤中的優(yōu)勢(shì)微生物種群之一,該菌能分泌多種拮抗植物病原菌的代謝產(chǎn)物[7],對(duì)維持其生態(tài)適應(yīng)性和在復(fù)雜的根際環(huán)境中繁殖生存有重要意義,可以防治多種植物真菌或細(xì)菌類(lèi)病害,作為新型生物農(nóng)藥已在防治植物病害中廣泛應(yīng)用[8]。而同時(shí)對(duì)甜瓜枯萎病菌、黑點(diǎn)根腐病菌、蔓枯病菌、腐皮鐮刀菌和亞洲鐮刀菌同時(shí)有效的生防菌較少,因此,篩選對(duì)甜瓜不同病原菌同時(shí)有效的生防菌株具有重要的理論和實(shí)踐意義。
筆者的研究在連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離到一株銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)Bc1-20,對(duì)甜瓜多種病原菌均有抑制作用,平板拮抗活性很強(qiáng),于是進(jìn)一步測(cè)定了Bc1-20 對(duì)甜瓜幼苗的促生作用及甜瓜枯萎病的防治效果,以期為甜瓜病害生防菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ),為甜瓜病害的綠色防控提供技術(shù)保障。
供試病原菌:尖孢鐮刀菌甜瓜專(zhuān)化型(F.oxysporum)TG-5、黑 點(diǎn) 根 腐 病 菌(M.cannonballus)Mc-30、蔓枯病菌(S.cucurbitacearum)MF-17[9]、腐皮鐮刀菌(F.solani)NG-3[10]和亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)Fa-25[11]等5 種,均由筆者實(shí)驗(yàn)室分離獲得,在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,作為供試菌株。供試甜瓜品種為厚皮甜瓜材料48 號(hào),由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供,所有試驗(yàn)在寧波市特色園藝作物品質(zhì)調(diào)控和抗性育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)園區(qū)完成,時(shí)間是2023 年4—7 月。
NA 培養(yǎng)基:牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL,pH 7.0。NB 培養(yǎng)基:牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、水1000 mL,pH 7.0。PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL。
1.2.1 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分離和鑒定 銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)Bc1-20 是從寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)園區(qū)的連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離得到的,具體做法為:取甜瓜大棚的土壤1 g放到1.5 mL 的無(wú)菌水中,混勻,然后稀釋涂平板,挑取單菌落在NB 培養(yǎng)基中,溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下進(jìn)行搖培,再次對(duì)單菌落進(jìn)行劃線純化。利用在NB 培養(yǎng)基中28 ℃搖培24 h 的菌液分別對(duì)病原菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng),將具有拮抗作用的細(xì)菌采用甘油保存在-70 ℃的冰箱內(nèi),銅綠假單胞菌Bc1-20 于2023 年2 月14 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC No.26547。
1.2.2 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分子鑒定 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分子鑒定過(guò)程包括:采用50 μL 的PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行16S rDNA 的擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。拮抗細(xì)菌的基因組DNA 用全式金細(xì)菌基因組試劑盒提取。擴(kuò)增菌株的16S rDNA 采用細(xì)菌通用引物(27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ; 1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行擴(kuò)增[12],擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè),對(duì)陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化、克隆和測(cè)序[13]。將測(cè)得的16S rDNA 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行核酸比對(duì),利用軟件MEGA 7.0[14]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),明確拮抗菌的分類(lèi)地位。
1.2.3 銅綠假單胞菌Bc1-20 的生長(zhǎng)曲線和活菌數(shù)測(cè)定 將銅綠假單胞菌Bc1-20 菌株取出,在NA 平板上劃線活化,轉(zhuǎn)代1 次后挑取單菌落接種于NB 液體培養(yǎng)基(100 mL)搖培,在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下?lián)u培,每間隔4 h 取樣,直至56 h 結(jié)束,取樣測(cè)量OD600值和活菌數(shù)等數(shù)據(jù)。
1.2.4 銅綠假單胞菌Bc1-20 的防病拮抗效果試驗(yàn) 采用平板對(duì)峙法進(jìn)行防病拮抗菌株的篩選,在PDA 培養(yǎng)基上活化尖孢鐮刀菌甜瓜專(zhuān)化型菌、蔓枯病菌、黑點(diǎn)根腐病菌、腐皮鐮刀菌和亞洲鐮刀菌等病原菌,用直徑5 mm 的打孔器在新鮮的菌落邊緣打孔,挑取新鮮菌絲塊接種在新的PDA 平板中心,用接種環(huán)挑取少量新鮮綠假單胞菌Bc1-20 菌液于PDA 培養(yǎng)基的兩端劃線,劃線處距PDA 端部距離為1 cm,封口膜封好后置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),10 d 之后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果,每個(gè)菌株3 個(gè)皿。對(duì)照組只接種病原菌,不接種綠假單胞菌Bc1-20[15]。
1.2.5 銅綠假單胞菌Bc1-20 的促生試驗(yàn) 在溫室大棚中,利用盆栽試驗(yàn)進(jìn)行拮抗細(xì)菌對(duì)甜瓜幼苗的促生試驗(yàn),在甜瓜種子播種3、7、10 d 后,用拮抗細(xì)菌配置的108cfu·mL-1懸浮菌液對(duì)甜瓜幼苗進(jìn)行灌根:用移液器將懸浮菌液沿甜瓜幼苗根部灌入,每棵幼苗用1 mL 菌液處理,共計(jì)150 棵,同時(shí)以NB培養(yǎng)基處理的甜瓜幼苗作為對(duì)照。17 d 后,拔出完整的甜瓜幼苗,每個(gè)處理取生長(zhǎng)一致的30 棵幼苗,只保留地上部分,測(cè)量幼苗的莖粗、莖長(zhǎng)、子葉長(zhǎng)和寬、每株幼苗中最大真葉的長(zhǎng)和寬及地上部分鮮質(zhì)量,統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。
1.2.6 甜瓜枯萎病的盆栽生防試驗(yàn) 在甜瓜播種后的3、7、10 d,用108cfu·mL-1的銅綠假單胞菌Bc1-20 懸浮菌液對(duì)甜瓜幼苗進(jìn)行灌根,每棵幼苗用1 mL 菌液處理。每個(gè)處理對(duì)應(yīng)1 個(gè)穴盤(pán),每個(gè)穴盤(pán)50 株,設(shè)置3 次重復(fù)。同時(shí)用NB 培養(yǎng)基處理的甜瓜幼苗作為CK 組。
甜瓜枯萎病接種:選用的甜瓜品種為對(duì)甜瓜枯萎病感病品種甬148(由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院培育),在2 葉1 心時(shí),以50 株幼苗為1 組,3 次重復(fù),左邊一半不接種,右邊一半接種。將幼苗從穴盤(pán)中取出,輕度損傷根系,洗凈根部,在4×106個(gè)·mL-1的枯萎病菌孢子液中浸根15 min,根系全部浸入,中間搖動(dòng)2 次,不接種的在清水中浸根15 min。再移栽至營(yíng)養(yǎng)土中,接種前3 d 遮陰,溫度保持在25 ℃,3 d 緩苗后撤掉遮陽(yáng)網(wǎng),在溫室正常管理,15 d 后調(diào)查發(fā)病情況,統(tǒng)計(jì)分析病情指數(shù)和相對(duì)防治效果[16]。鑒定標(biāo)準(zhǔn):整株無(wú)病癥為0 級(jí);晴天中午子葉萎蔫或部分子葉、真葉輕微萎蔫為1 級(jí);1 片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫為2 級(jí);子葉及真葉萎蔫,阻礙發(fā)育為3 級(jí);整株萎蔫,60%以上枯死,心葉成活為4 級(jí);整株嚴(yán)重萎蔫并枯死為5 級(jí)[17]。病情指數(shù)=∑(級(jí)數(shù)×該級(jí)株數(shù))/(總株數(shù)×最高級(jí)數(shù))×100;相對(duì)防治效果/%=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100。
從連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離獲得1 株對(duì)甜瓜病原菌具有拮抗作用的細(xì)菌,編號(hào)為Bc1-20,其在NA 培養(yǎng)基上可見(jiàn)邊緣光滑的圓形、淡綠色菌落,在NB 培養(yǎng)基中進(jìn)行搖培24 h 后的菌液明顯為綠色(圖1)。
圖1 Bc1-20 在NA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(A)和在NB 培養(yǎng)基中的搖培情況(B)Fig.1 Colony morphology of strain Bc1-20 on NA medium(A)and was shaken in NB medium(B)
以菌株Bc1-20 的基因組DNA 為模板,用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序,獲得銅綠假單胞菌Bc1-20 的16S rDNA 序列為1500 bp。將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果表明其與菌株銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)SI1(16S,GenBankAcc.OQ615324.1)的同源性最高,為100%。利用MEGA 7 對(duì)測(cè)序獲得的序列和其他相近的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明,菌株Bc1-20 與銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)的菌株聚為一支,所以認(rèn)為Bc1-20 屬于銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)(圖2)。
圖2 基于16S-rRNA 構(gòu)建的拮抗菌株Bc1-20 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of antagonistic strain Bc1-20 based on 16S-rRNA
將Bc1-20 按照2%的接種量接種于100 mL 的NB 液體培養(yǎng)基中,每間隔4 h 取樣測(cè)量OD600值,結(jié)果表明,銅綠假單胞菌Bc1-20 在NB 液體培養(yǎng)基中搖培4~20 h 為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,24 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期,Bc1-20 在24 h 時(shí)的菌落數(shù)有7.8×108cfu·mL-1(圖3)。
圖3 Bc1-20 在NB 中的生長(zhǎng)情況(A)和在28 ℃下隨時(shí)間變化的菌落數(shù)(B)Fig.3 Growth curve of Bc1-20 in NB medium over time(A)and change of colony number of Bc1-20 with time at 28 ℃(B)
將銅綠假單胞菌Bc1-20 與甜瓜多種病原菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng),在對(duì)峙培養(yǎng)10 d 后,Bc1-20 對(duì)尖孢鐮刀菌甜瓜專(zhuān)化型(F.oxysporum)、蔓枯病菌(S.cucurbitacearum)、黑點(diǎn)根腐病菌(M.cannonballus)、腐皮鐮刀菌(F.solani)和亞洲鐮刀菌(F.asiaticum)的生長(zhǎng)均有抑制作用,在對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中,培養(yǎng)皿中均出現(xiàn)了明顯的拮抗帶,后期對(duì)峙的病原菌也無(wú)法再生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果證明,銅綠假單胞菌Bc1-20 菌株對(duì)甜瓜多種病原菌抑制作用明顯,具有潛在的生防效果(圖4)。
圖4 菌株Bc1-20 對(duì)甜瓜不同病原菌的平板拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Strain Bc1-20 conducted plate antagonism tests against different pathogens in melon
用銅綠假單胞菌Bc1-20 的菌懸液處理甜瓜幼苗,17 d 后進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量,結(jié)果表明,其在莖粗、莖長(zhǎng)、地上部鮮質(zhì)量、子葉長(zhǎng)和寬及最大真葉的長(zhǎng)和寬方面都極顯著高于CK,表明銅綠假單胞菌Bc1-20 對(duì)甜瓜幼苗有促生作用(圖5,表1)。
表1 菌株Bc1-20 對(duì)甜瓜幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of strain Bc1-20 on the growth of melon seedlings
圖5 菌株Bc1-20 對(duì)甜瓜幼苗的促生試驗(yàn)Fig.5 Growth promotion test results of Bc1-20 strain on melon seedlings
用銅綠假單胞菌Bc1-20 處理甜瓜幼苗后,進(jìn)行甜瓜枯萎病的接種試驗(yàn),接種15 d 后調(diào)查統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明,銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指數(shù)為40.80,CK 的病情指數(shù)為85.65,用銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的相對(duì)防治效果為52.34%。由此可見(jiàn),銅綠假單胞菌Bc1-20 對(duì)甜瓜枯萎病具有一定的生防作用(圖6、表2)。
表2 Bc1-20 處理相對(duì)防治效果Table 2 Relative control effect of Bc1-20 treatment
圖6 菌株Bc1-20 對(duì)甜瓜枯萎病生防試驗(yàn)Fig.6 Biological control of strain Bc1-20 against melon Fusarium wilt
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是動(dòng)物和人類(lèi)的條件性致病菌[18],但是,近年來(lái),一些用于促生和防治植物病原菌的銅綠假單胞菌陸續(xù)被分離和鑒定,由于顯著的抑菌活性而引起了研究者的極大關(guān)注。例如銅綠假單胞菌31-2 對(duì)煙草青枯病菌拮抗活性穩(wěn)定,可在煙草根、莖和葉表面及內(nèi)部定殖,對(duì)煙草青枯病具有很好的防治作用,菌液和活性物質(zhì)粗提物分別具有39.50%和20.90%的防治效果[19]。銅綠假單胞菌FJAT-346-PA 對(duì)香蕉枯萎病病原菌具有良好的抑制作用,在香蕉組培苗、盆栽苗及大田植株體內(nèi)定殖,對(duì)香蕉有明顯的促生長(zhǎng)作用,對(duì)香蕉枯萎病具有較好的防治效果,盆栽防效和田間防效分別為83.67%和82.00%[20]。銅綠假單胞菌F13 不僅對(duì)豆角白粉病具有良好的防治效果,而且具有很好的促生效果,株高、葉片數(shù)和莖粗均高于對(duì)照組,且產(chǎn)量高于對(duì)照組39.68%[21]。在筆者的研究中,銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的甜瓜幼苗莖粗、莖長(zhǎng)、地上部鮮質(zhì)量、子葉及最大真葉大小都極顯著高于對(duì)照,具有一定的促生作用,由于根系在拔出穴盤(pán)時(shí)容易斷根,并沒(méi)有進(jìn)行根系強(qiáng)弱的比較。此外,銅綠假單胞菌還對(duì)昆蟲(chóng)和線蟲(chóng)具有一定的抑制效果,例如對(duì)松墨天牛幼蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性[22],銅綠假單胞菌NZM13-11 能夠高效地殺死馬尾松內(nèi)的松材線蟲(chóng),具有防控松材線蟲(chóng)病的可能性[23]。
目前,銅綠假單胞菌在葫蘆科作物上的應(yīng)用比較少,1996 年分離于上海郊區(qū)甜瓜根際的銅綠假單胞菌M18 可抑制甜瓜蔓枯菌生長(zhǎng)[24],分泌的抗真菌物質(zhì)PCA 可以有效防治瓜類(lèi)枯萎病[25],使用M18活菌浸種處理黃瓜種子以及在大棚根基土壤澆灌的試驗(yàn)中,黃瓜枯萎病相對(duì)于對(duì)照降低70%~80%[26],霜霉病的發(fā)病率和病情指數(shù)均下降70%左右[27]。筆者研究的銅綠假單胞菌Bc1-20 對(duì)尖孢鐮刀菌引起的甜瓜枯萎病的相對(duì)防治效果為52.34%,但未做對(duì)蔓枯病菌、腐皮鐮刀菌、黑點(diǎn)根腐病菌、亞洲鐮刀菌等病菌引起的其他病害的盆栽防效試驗(yàn),仍需進(jìn)一步驗(yàn)證完善。
筆者研究分離獲得的銅綠假單胞菌Bc1-20 對(duì)甜瓜多種病害病原菌具有抑制作用,包括尖孢鐮刀菌甜瓜專(zhuān)化型病菌、黑點(diǎn)根腐病菌、蔓枯病菌、亞洲鐮刀菌和腐皮鐮刀菌等病原菌;Bc1-20 對(duì)甜瓜幼苗有促生作用,包括甜瓜幼苗的莖粗、莖長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、子葉長(zhǎng)和寬及最大真葉的長(zhǎng)和寬方面都極顯著高于對(duì)照;Bc1-20 對(duì)甜瓜枯萎病具有良好的生防潛力,Bc1-20 處理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指數(shù)為40.80,對(duì)照組的病情指數(shù)85.65,相對(duì)防治效果為52.34%,可很好地防治甜瓜枯萎病。