郝芳敏，董文杰，臧全宇，馬二磊，丁偉紅，王毓洪

（1.寧波市特色園藝作物品質(zhì)調(diào)控和抗性育種重點實驗室·寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江寧波 315040；2.浙江萬里學(xué)院 浙江寧波 315040）

甜瓜是世界十大水果之一，也是我國廣泛栽種的經(jīng)濟作物之一。在甜瓜種植面積不斷擴大、產(chǎn)量和經(jīng)濟效益穩(wěn)步上升的同時，甜瓜病害卻日益嚴(yán)重，特別是甜瓜枯萎病、根腐病、蔓枯病等病害，極大地影響了甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，限制甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。其中，甜瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌甜瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.melonis）引起，是一種土傳病害，在甜瓜全生育期均可發(fā)生，通常造成瓜田植株大片死亡[1]。甜瓜根腐病和黑點根腐病分別是由腐皮鐮刀菌（F.solani）[2]和坎諾單孢菌（Monosporascus cannonballus）[3]引起的土傳病害，均可引起根腐病，造成甜瓜藤蔓急性凋萎，嚴(yán)重時甚至絕收。甜瓜蔓枯病是由Stagonosporopsis cucurbitacearum引起的病害，主要危害莖蔓和葉片，該病發(fā)病極快，一旦發(fā)生蔓延很難控制[4]。由亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）引起的甜瓜果腐病，多危害半成熟和成熟的果實，發(fā)病初期果實呈水漬狀病斑，后期內(nèi)部開始腐爛，該病害初期不易發(fā)現(xiàn)，不能夠及時進(jìn)行防治，一旦發(fā)生，嚴(yán)重影響果實的品質(zhì)和產(chǎn)量[5-6]。

目前針對上述病害主要使用傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法，但是會造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題，對人們的健康及生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害，甚至可能導(dǎo)致社會普遍關(guān)注的食品安全問題。因此，急需采用高效、無公害的生物技術(shù)防治甜瓜病害，生物防治具有安全、綠色、高效等優(yōu)點，對甜瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種革蘭氏陰性菌，是植物根際微生態(tài)和土壤中的優(yōu)勢微生物種群之一，該菌能分泌多種拮抗植物病原菌的代謝產(chǎn)物[7]，對維持其生態(tài)適應(yīng)性和在復(fù)雜的根際環(huán)境中繁殖生存有重要意義，可以防治多種植物真菌或細(xì)菌類病害，作為新型生物農(nóng)藥已在防治植物病害中廣泛應(yīng)用[8]。而同時對甜瓜枯萎病菌、黑點根腐病菌、蔓枯病菌、腐皮鐮刀菌和亞洲鐮刀菌同時有效的生防菌較少，因此，篩選對甜瓜不同病原菌同時有效的生防菌株具有重要的理論和實踐意義。

筆者的研究在連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離到一株銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）Bc1-20，對甜瓜多種病原菌均有抑制作用，平板拮抗活性很強，于是進(jìn)一步測定了Bc1-20 對甜瓜幼苗的促生作用及甜瓜枯萎病的防治效果，以期為甜瓜病害生防菌劑的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為甜瓜病害的綠色防控提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：尖孢鐮刀菌甜瓜專化型（F.oxysporum）TG-5、黑 點 根 腐 病 菌（M.cannonballus）Mc-30、蔓枯病菌（S.cucurbitacearum）MF-17[9]、腐皮鐮刀菌（F.solani）NG-3[10]和亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）Fa-25[11]等5 種，均由筆者實驗室分離獲得，在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，作為供試菌株。供試甜瓜品種為厚皮甜瓜材料48 號，由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，所有試驗在寧波市特色園藝作物品質(zhì)調(diào)控和抗性育種重點實驗室、寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實驗園區(qū)完成，時間是2023 年4—7 月。

NA 培養(yǎng)基：牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL，pH 7.0。NB 培養(yǎng)基：牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、水1000 mL，pH 7.0。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分離和鑒定 銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）Bc1-20 是從寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實驗園區(qū)的連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離得到的，具體做法為：取甜瓜大棚的土壤1 g放到1.5 mL 的無菌水中，混勻，然后稀釋涂平板，挑取單菌落在NB 培養(yǎng)基中，溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下進(jìn)行搖培，再次對單菌落進(jìn)行劃線純化。利用在NB 培養(yǎng)基中28 ℃搖培24 h 的菌液分別對病原菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)，將具有拮抗作用的細(xì)菌采用甘油保存在-70 ℃的冰箱內(nèi)，銅綠假單胞菌Bc1-20 于2023 年2 月14 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.26547。

1.2.2 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分子鑒定 銅綠假單胞菌Bc1-20 的分子鑒定過程包括：采用50 μL 的PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行16S rDNA 的擴增、測序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。拮抗細(xì)菌的基因組DNA 用全式金細(xì)菌基因組試劑盒提取。擴增菌株的16S rDNA 采用細(xì)菌通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ； 1492R： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴增[12]，擴增的PCR 產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測，對陽性PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化、克隆和測序[13]。將測得的16S rDNA 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行核酸比對，利用軟件MEGA 7.0[14]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，明確拮抗菌的分類地位。

1.2.3 銅綠假單胞菌Bc1-20 的生長曲線和活菌數(shù)測定 將銅綠假單胞菌Bc1-20 菌株取出，在NA 平板上劃線活化，轉(zhuǎn)代1 次后挑取單菌落接種于NB 液體培養(yǎng)基（100 mL）搖培，在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下?lián)u培，每間隔4 h 取樣，直至56 h 結(jié)束，取樣測量OD600值和活菌數(shù)等數(shù)據(jù)。

1.2.4 銅綠假單胞菌Bc1-20 的防病拮抗效果試驗 采用平板對峙法進(jìn)行防病拮抗菌株的篩選，在PDA 培養(yǎng)基上活化尖孢鐮刀菌甜瓜?；途⒙莶【?、黑點根腐病菌、腐皮鐮刀菌和亞洲鐮刀菌等病原菌，用直徑5 mm 的打孔器在新鮮的菌落邊緣打孔，挑取新鮮菌絲塊接種在新的PDA 平板中心，用接種環(huán)挑取少量新鮮綠假單胞菌Bc1-20 菌液于PDA 培養(yǎng)基的兩端劃線，劃線處距PDA 端部距離為1 cm，封口膜封好后置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，10 d 之后統(tǒng)計試驗結(jié)果，每個菌株3 個皿。對照組只接種病原菌，不接種綠假單胞菌Bc1-20[15]。

1.2.5 銅綠假單胞菌Bc1-20 的促生試驗 在溫室大棚中，利用盆栽試驗進(jìn)行拮抗細(xì)菌對甜瓜幼苗的促生試驗，在甜瓜種子播種3、7、10 d 后，用拮抗細(xì)菌配置的108cfu·mL-1懸浮菌液對甜瓜幼苗進(jìn)行灌根：用移液器將懸浮菌液沿甜瓜幼苗根部灌入，每棵幼苗用1 mL 菌液處理，共計150 棵，同時以NB培養(yǎng)基處理的甜瓜幼苗作為對照。17 d 后，拔出完整的甜瓜幼苗，每個處理取生長一致的30 棵幼苗，只保留地上部分，測量幼苗的莖粗、莖長、子葉長和寬、每株幼苗中最大真葉的長和寬及地上部分鮮質(zhì)量，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 甜瓜枯萎病的盆栽生防試驗 在甜瓜播種后的3、7、10 d，用108cfu·mL-1的銅綠假單胞菌Bc1-20 懸浮菌液對甜瓜幼苗進(jìn)行灌根，每棵幼苗用1 mL 菌液處理。每個處理對應(yīng)1 個穴盤，每個穴盤50 株，設(shè)置3 次重復(fù)。同時用NB 培養(yǎng)基處理的甜瓜幼苗作為CK 組。

甜瓜枯萎病接種：選用的甜瓜品種為對甜瓜枯萎病感病品種甬148（由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院培育），在2 葉1 心時，以50 株幼苗為1 組，3 次重復(fù)，左邊一半不接種，右邊一半接種。將幼苗從穴盤中取出，輕度損傷根系，洗凈根部，在4×106個·mL-1的枯萎病菌孢子液中浸根15 min，根系全部浸入，中間搖動2 次，不接種的在清水中浸根15 min。再移栽至營養(yǎng)土中，接種前3 d 遮陰，溫度保持在25 ℃，3 d 緩苗后撤掉遮陽網(wǎng)，在溫室正常管理，15 d 后調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計分析病情指數(shù)和相對防治效果[16]。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：整株無病癥為0 級；晴天中午子葉萎蔫或部分子葉、真葉輕微萎蔫為1 級；1 片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫為2 級；子葉及真葉萎蔫，阻礙發(fā)育為3 級；整株萎蔫，60%以上枯死，心葉成活為4 級；整株嚴(yán)重萎蔫并枯死為5 級[17]。病情指數(shù)＝∑（級數(shù)×該級株數(shù)）/（總株數(shù)×最高級數(shù)）×100；相對防治效果/%＝（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bc1-20的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從連續(xù)多年種植甜瓜大棚的土壤中分離獲得1 株對甜瓜病原菌具有拮抗作用的細(xì)菌，編號為Bc1-20，其在NA 培養(yǎng)基上可見邊緣光滑的圓形、淡綠色菌落，在NB 培養(yǎng)基中進(jìn)行搖培24 h 后的菌液明顯為綠色（圖1）。

圖1 Bc1-20 在NA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)（A）和在NB 培養(yǎng)基中的搖培情況（B）Fig.1 Colony morphology of strain Bc1-20 on NA medium（A）and was shaken in NB medium（B）

以菌株Bc1-20 的基因組DNA 為模板，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴增，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測序，獲得銅綠假單胞菌Bc1-20 的16S rDNA 序列為1500 bp。將測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明其與菌株銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）SI1（16S，GenBankAcc.OQ615324.1）的同源性最高，為100%。利用MEGA 7 對測序獲得的序列和其他相近的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，菌株Bc1-20 與銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）的菌株聚為一支，所以認(rèn)為Bc1-20 屬于銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）（圖2）。

圖2 基于16S-rRNA 構(gòu)建的拮抗菌株Bc1-20 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of antagonistic strain Bc1-20 based on 16S-rRNA

2.2 銅綠假單胞菌Bc1-20的生長曲線和活菌數(shù)測定

將Bc1-20 按照2%的接種量接種于100 mL 的NB 液體培養(yǎng)基中，每間隔4 h 取樣測量OD600值，結(jié)果表明，銅綠假單胞菌Bc1-20 在NB 液體培養(yǎng)基中搖培4～20 h 為對數(shù)生長期，24 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，Bc1-20 在24 h 時的菌落數(shù)有7.8×108cfu·mL-1（圖3）。

圖3 Bc1-20 在NB 中的生長情況（A）和在28 ℃下隨時間變化的菌落數(shù)（B）Fig.3 Growth curve of Bc1-20 in NB medium over time（A）and change of colony number of Bc1-20 with time at 28 ℃（B）

2.3 銅綠假單胞菌Bc1-20的防病拮抗效果

將銅綠假單胞菌Bc1-20 與甜瓜多種病原菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)，在對峙培養(yǎng)10 d 后，Bc1-20 對尖孢鐮刀菌甜瓜?；停‵.oxysporum）、蔓枯病菌（S.cucurbitacearum）、黑點根腐病菌（M.cannonballus）、腐皮鐮刀菌（F.solani）和亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）的生長均有抑制作用，在對峙培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)皿中均出現(xiàn)了明顯的拮抗帶，后期對峙的病原菌也無法再生長。試驗結(jié)果證明，銅綠假單胞菌Bc1-20 菌株對甜瓜多種病原菌抑制作用明顯，具有潛在的生防效果（圖4）。

圖4 菌株Bc1-20 對甜瓜不同病原菌的平板拮抗試驗結(jié)果Fig.4 Strain Bc1-20 conducted plate antagonism tests against different pathogens in melon

2.4 銅綠假單胞菌Bc1-20的促生試驗

用銅綠假單胞菌Bc1-20 的菌懸液處理甜瓜幼苗，17 d 后進(jìn)行數(shù)據(jù)測量，結(jié)果表明，其在莖粗、莖長、地上部鮮質(zhì)量、子葉長和寬及最大真葉的長和寬方面都極顯著高于CK，表明銅綠假單胞菌Bc1-20 對甜瓜幼苗有促生作用（圖5，表1）。

表1 菌株Bc1-20 對甜瓜幼苗生長的影響Table 1 Effects of strain Bc1-20 on the growth of melon seedlings

圖5 菌株Bc1-20 對甜瓜幼苗的促生試驗Fig.5 Growth promotion test results of Bc1-20 strain on melon seedlings

2.5 甜瓜枯萎病的盆栽生防試驗

用銅綠假單胞菌Bc1-20 處理甜瓜幼苗后，進(jìn)行甜瓜枯萎病的接種試驗，接種15 d 后調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果表明，銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指數(shù)為40.80，CK 的病情指數(shù)為85.65，用銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的相對防治效果為52.34%。由此可見，銅綠假單胞菌Bc1-20 對甜瓜枯萎病具有一定的生防作用（圖6、表2）。

表2 Bc1-20 處理相對防治效果Table 2 Relative control effect of Bc1-20 treatment

圖6 菌株Bc1-20 對甜瓜枯萎病生防試驗Fig.6 Biological control of strain Bc1-20 against melon Fusarium wilt

3 討論與結(jié)論

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是動物和人類的條件性致病菌[18]，但是，近年來，一些用于促生和防治植物病原菌的銅綠假單胞菌陸續(xù)被分離和鑒定，由于顯著的抑菌活性而引起了研究者的極大關(guān)注。例如銅綠假單胞菌31-2 對煙草青枯病菌拮抗活性穩(wěn)定，可在煙草根、莖和葉表面及內(nèi)部定殖，對煙草青枯病具有很好的防治作用，菌液和活性物質(zhì)粗提物分別具有39.50%和20.90%的防治效果[19]。銅綠假單胞菌FJAT-346-PA 對香蕉枯萎病病原菌具有良好的抑制作用，在香蕉組培苗、盆栽苗及大田植株體內(nèi)定殖，對香蕉有明顯的促生長作用，對香蕉枯萎病具有較好的防治效果，盆栽防效和田間防效分別為83.67%和82.00%[20]。銅綠假單胞菌F13 不僅對豆角白粉病具有良好的防治效果，而且具有很好的促生效果，株高、葉片數(shù)和莖粗均高于對照組，且產(chǎn)量高于對照組39.68%[21]。在筆者的研究中，銅綠假單胞菌Bc1-20 處理的甜瓜幼苗莖粗、莖長、地上部鮮質(zhì)量、子葉及最大真葉大小都極顯著高于對照，具有一定的促生作用，由于根系在拔出穴盤時容易斷根，并沒有進(jìn)行根系強弱的比較。此外，銅綠假單胞菌還對昆蟲和線蟲具有一定的抑制效果，例如對松墨天牛幼蟲具有殺蟲活性[22]，銅綠假單胞菌NZM13-11 能夠高效地殺死馬尾松內(nèi)的松材線蟲，具有防控松材線蟲病的可能性[23]。

目前，銅綠假單胞菌在葫蘆科作物上的應(yīng)用比較少，1996 年分離于上海郊區(qū)甜瓜根際的銅綠假單胞菌M18 可抑制甜瓜蔓枯菌生長[24]，分泌的抗真菌物質(zhì)PCA 可以有效防治瓜類枯萎病[25]，使用M18活菌浸種處理黃瓜種子以及在大棚根基土壤澆灌的試驗中，黃瓜枯萎病相對于對照降低70%～80%[26]，霜霉病的發(fā)病率和病情指數(shù)均下降70%左右[27]。筆者研究的銅綠假單胞菌Bc1-20 對尖孢鐮刀菌引起的甜瓜枯萎病的相對防治效果為52.34%，但未做對蔓枯病菌、腐皮鐮刀菌、黑點根腐病菌、亞洲鐮刀菌等病菌引起的其他病害的盆栽防效試驗，仍需進(jìn)一步驗證完善。

筆者研究分離獲得的銅綠假單胞菌Bc1-20 對甜瓜多種病害病原菌具有抑制作用，包括尖孢鐮刀菌甜瓜?；筒【?、黑點根腐病菌、蔓枯病菌、亞洲鐮刀菌和腐皮鐮刀菌等病原菌；Bc1-20 對甜瓜幼苗有促生作用，包括甜瓜幼苗的莖粗、莖長、鮮質(zhì)量、子葉長和寬及最大真葉的長和寬方面都極顯著高于對照；Bc1-20 對甜瓜枯萎病具有良好的生防潛力，Bc1-20 處理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指數(shù)為40.80，對照組的病情指數(shù)85.65，相對防治效果為52.34%，可很好地防治甜瓜枯萎病。