王偉科，陸 娜，林佳瑤，陳觀平

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310000；2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310012）

碳源是食用菌生長發(fā)育最重要的營養(yǎng)和能量來源，而碳源最主要的來源是木質(zhì)纖維素[1]。由于木質(zhì)素分子量較大且有致密的結(jié)構(gòu)，因此需要由菌絲體分泌的胞外酶將其解聚成小分子化合物后才能被其消化吸收[2]。秀珍菇（Pleurotus pulmonarius） 等白腐真菌可分泌豐富的胞外氧化酶用于降解木質(zhì)素，這些細胞外氧化酶含有血紅素，包括木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）、染料脫色過氧化物酶（dyedecolorizing peroxidase, DyP） 等。

染料脫色過氧化物酶屬于血紅素過氧化物酶超家族中新的一類，其廣泛存在于真菌和細菌中[3]，在各種生物環(huán)境中發(fā)揮作用，包括細胞外環(huán)境和細胞膜內(nèi)環(huán)境，其除了具有過氧化物酶功能外還具有諸多生物活性，如水解酶及氧化酶活性[4]，但其在食用菌中的功能還未見報道。通過利用RNA-seq 技術(shù)對秀珍菇轉(zhuǎn)錄組進行了測序，并根據(jù)數(shù)據(jù)拼接結(jié)果克隆了染料脫色過氧化物酶基因，同時對基因進行同源分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，檢測了其在秀珍菇低溫脅迫下的表達情況，探究基因在秀珍菇生長發(fā)育過程中的作用，為秀珍菇分子育種及高效栽培技術(shù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

秀珍菇“杭秀2 號”由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。培養(yǎng)基配方為棉籽殼39%、木屑39%、麩皮18%、石膏1%、石灰1%。菌包接種后于26～28 ℃條件下避光培養(yǎng)，待菌絲滿袋后，選取生長狀態(tài)一致的菌包開展試驗。挑取發(fā)菌良好的菌包料面菌絲體10 g，室溫26 ℃，記為S0；發(fā)菌良好的菌包置于10 ℃條件下12 h，取樣，記為S1。每樣3 個重復(fù)，所有樣本置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 儀器與試劑

LightCycler 480 PCR 儀，美國羅氏（Roche） 公司；GelDoc XR+凝膠成像儀，美國伯樂生物科技有限（Bio-Rad） 公司；DYCP-31DN 核酸電泳儀，北京六一生物科技有限公司；TRizol Reagent Trizol，美國英杰生命技術(shù)有限（Invitrogen） 公司；pMD18-T T 載體，日本Takara 公司；DNA Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA 的提取

秀珍菇總RNA 的提取采用Trizol 法[5]，樣本在液氮中研磨后加入Trizol，離心后在上清液中加入100 μL 氯仿和異戊醇（24 ∶1，V/V），振蕩混勻，離心。取上清加入400 μL 異丙醇沉淀RNA。離心棄上清，沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌后溶于50 μL 焦碳酸二乙酯（DEPC） 處理水中。

1.3.2 cDNA 的合成

總RNA 經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳及核酸分析儀檢測純度和濃度后，在無RNAase 污染的PCR 管中加入1 μL Oligo（dT）、1 μL total RNA、1 μL dNTP、12 μL DEPC 水，70 ℃保持10 min 后，冰浴。然后后加入2 μL 5× first strand Buffer，2 μL 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），42 ℃反應(yīng)2 min，加入1 μL莫洛尼氏鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒（moloney murine leukemia retrovirus，MMLV），42 ℃孵育50 min。

1.3.3 基因克隆

根據(jù)RNAseq 測序結(jié)果，選取秀珍菇染料脫色過氧化物酶基因（命名為PpDypA） 相關(guān)表達序列（以ATG 為起始密碼子、TGA 為終止密碼子的最長編碼序列），利用Vector NTI Advance 11.5 軟件拼接成完整基因。同時運用引物設(shè)計軟件Primer 5.0 設(shè)計相關(guān)引物（PpDypA-F：ATGTCTACACCTGCACCAACT；PpDypA-R：TCAAGTGGAAATCGGGGCCTG）。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板進行PCR 擴增。50 μL 反應(yīng)體系包含10× Buffer 5 μL，2.5 mM dNTPs 4 μL，10 mM 的PpDypA-F 以及PpDypA-R 各4 μL，cDNA 模板2 μL，5 U·μL-1的高保真DNA 聚合酶（AccuPrime Pfx DNA Polymerase） 0.5 μL，ddH2O 30.5 μL。擴增程序為93 ℃預(yù)變性3 min；93 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，28 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳后，用DNA 膠回收試劑盒純化回收。連入T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，酶切檢測后的陽性克隆送杭州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.4 基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析主要采用BLAST、amigo、UniProt、PSIPRED、AlphaFold等網(wǎng)上軟件包進行[6-10]。使用Vector NTI Advance 11.5、DNAstar 軟件對序列進行多重比對、分析，并用MEGA X 軟件構(gòu)建進化樹。

1.3.5 秀珍菇菌絲體低溫處理后PpDypA 基因表達分析

分別提取秀珍菇菌絲體常溫狀態(tài)（S0） 樣本及低溫處理12 h 后（S1） 樣本的總RNA，并按照iScript cDNA Synthesis Kit 進行cDNA 第一鏈的合成，根據(jù)測序成功的PpDypA 基因序列設(shè)計出特異性qRT-PCR 引物，見表1。

表1 qRT-PCR 反應(yīng)引物序列Tab.1 Primers for qRT-PCR

參照SYBR Premix Ex TaqTM II 使用說明，用qRT-PCR 的方法檢測PpDypA 基因在秀珍菇菌絲體經(jīng)不同處理后的表達情況，以Actin 為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算該基因的相對表達量[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpDypA 序列的獲得及序列分析

利用RT-PCR 技術(shù)從秀珍菇中得到約1 500 bp的DNA 片段，克隆至PMD18-T 載體后測序，將測序結(jié)果與GenBank 中登錄的基因進行同源性比較和功能預(yù)測分析，共獲得1 515 bp 的全長序列，命名為PpDypA。BLAST 顯示其與染料脫色過氧化物酶基因（GenBank：UEC49157.1） 相似度為97.22%，表明所獲基因編碼蛋白屬于染料脫色過氧化物酶家族。PpDypA 基因的ORF 讀碼框及翻譯結(jié)果見圖1。

如圖1 所示，通過ORF Finder 尋找得到PpDypA 的開放讀碼框，推斷其為可編碼504 個氨基酸的功能蛋白。

應(yīng)用Vector NTI 軟件推算該蛋白的相對分子質(zhì)量約54.8 kDa，等電點pI 為6.35。GenBank 工具預(yù)測顯示該蛋白質(zhì)含有1 個保守的DyP 過氧化物酶超家族結(jié)構(gòu)域，見圖2。

圖2 秀珍菇PpDypA 基因編碼氨基酸序列的保守區(qū)域Fig.2 Characteristic conserved domain of amino acid sequence encoded by PpDypA gene

由圖2 可知，該蛋白的第92～483 個氨基酸的序列區(qū)域為保守結(jié)構(gòu)域，進一步說明所獲基因編碼蛋白屬于DyP 家族。

2.2 PpDypA 基因編碼蛋白的高級結(jié)構(gòu)分析

利用PSIPRED[9]和AlphaFold[10]對PpDypA 基因編碼蛋白進行預(yù)測和分析，結(jié)果見圖3～圖4。

圖3 秀珍菇PpDypA 基因編碼氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Predicted secondary structure of amino acid sequence encoded by PpDypA gene

圖4 PpDypA 基因編碼蛋白的三維建模Fig.4 Predicted three dimensional protein structures encoded by PpDypA gene

由圖3、圖4 分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在螺旋-卷曲（Helix-Coil） 結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測該蛋白可能存在催化結(jié)合口袋，預(yù)示該蛋白可能存在催化活性。

2.3 PpDypA 基因編碼蛋白的氨基酸序列分析

DypA 具有比較保守的結(jié)構(gòu)域，用DNAstar 對黃白側(cè)耳（Pleurotus cornucopiae，KAG9225391.1），杏鮑菇（Pleurotus eryngii，KAF9496869.1），糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus，XP_036625896.1），紫孢側(cè)耳（Pleurotus sapidus，UEC49157.1） 的氨基酸序列進行多序列比對，結(jié)果見圖5?？梢?，DypA 家族結(jié)構(gòu)域高度保守，具有很高的同源性。

圖5 5 種食用真菌DypA 蛋白序列比對Fig.5 Comparison of amino acid sequence of DypA in 5 edible fungi

2.4 PpDypA 氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

利用MEGA X 軟件對糙皮側(cè)耳（XP_036625896.1）、杏鮑菇（KAF9496869.1）、黃白側(cè)耳（KAG9225391.1）、紫孢側(cè)耳（UEC49157.1）、奧氏蜜環(huán)菌（Armillaria solidipes，PBK60244.1）、高盧蜜環(huán)菌（Armillaria gallica，PBK80505.1）、草菇（Volvariella volvacea，AKU 04643.1）、黏小奧德蘑（Mucidula mucida，KAF 8900000.1）、隆紋黑蛋巢菌（Cyathus striatus，KAF 9002157.1）、真姬菇（Hypsizygus marmoreus，RDB 22012.1）、紫丁香蘑（Lepista nuda，KAF9466754.1）、純白小口蘑（Tricholomella constricta，KAF5375843.1）、平田頭菇（Agrocybe pediades，KAF9558529.1）、古巴裸蓋菇（Psilocybe cubensis，KAH9475054.1）、松茸（Tricholoma matsutake，KAF8233757.1）、秀珍菇（Pleurotus pulmonarius，KAF4582714.1） 的食用菌DypA 同源蛋白進行分子系統(tǒng)進化分析，氨基酸序列系統(tǒng)進化樹見圖6。如圖6 所示，秀珍菇DypA 蛋白與紫孢側(cè)耳、黃白側(cè)耳、糙皮側(cè)耳等整體親緣關(guān)系比較接近，聚為一簇。同時，與其他食用真菌DypA蛋白也具有較高的相似度，說明DypA 蛋白在序列進化上相對保守。

圖6 DypA 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of DypA

2.5 PpDypA 編碼蛋白的GO 功能分析

GO 功能分析顯示，秀珍菇DypA 蛋白屬于DyP型過氧化物酶家族，其主要參與果糖、巖藻糖、甘露糖等代謝過程，有應(yīng)答氧化脅迫的功能，并具氧化還原活性。

2.6 秀珍菇菌絲體低溫處理后PpDypA 的表達研究

對比秀珍菇菌絲體常溫、低溫2 種狀態(tài)下PpDypA 基因的表達情況結(jié)果見圖7。由圖7 可知，低溫處理后PpDypA 的表達量明顯高于常溫狀態(tài)，說明PpDypA 的表達受低溫誘導(dǎo)，可能在低溫誘導(dǎo)后開啟高表達模式，從而更好的讓菌絲體分解木質(zhì)素，為出菇做準(zhǔn)備。

圖7 秀珍菇低溫處理后PpDypA 基因的表達情況Fig.7 Expression profile of PpDypA gene in low temperature

3 結(jié)論與討論

通過研究秀珍菇染料脫色過氧化物酶基因的克隆及表達情況，發(fā)現(xiàn)該基因全長為1 515 bp，編碼504 個氨基酸，其蛋白相對分子質(zhì)量約54.8 kDa。氨基酸序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，DypA 家族具有很高的同源性。經(jīng)實時熒光定量PCR 檢測，在秀珍菇中該基因經(jīng)過低溫處理后的表達量顯著上升。

食用菌在營養(yǎng)生長過程中，對于復(fù)雜的有機物，如纖維素、木質(zhì)素等往往不能直接轉(zhuǎn)化成碳源利用，需要分解后才能吸收[12]。食用菌胞外酶可將堅硬且復(fù)雜的有機物分解為簡單的單糖，供自身利用[13]。DyP 型過氧化物酶可能會參與木質(zhì)纖維素降解，特別是缺乏原型木質(zhì)素分解II 類過氧化物酶的真菌[14]。秀珍菇原基形成往往需低溫刺激，一般認為，原基的形成是菌絲體在適宜的溫度、濕度、空氣環(huán)境條件下的扭結(jié)，完成食用菌菌絲體由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，這一過程往往需要大量的能量代謝。DyP 型過氧化物酶在該過程中的大量表達可能明顯地促進了菌絲體對木質(zhì)素的降解，從而讓其獲取更多的能量。已有研究表明，DyP 型過氧化物酶可催化木質(zhì)素類化合物的氧化，其在生物降解木質(zhì)素、造紙、食品加工、凈化土壤、染料脫色等方面具有普遍的應(yīng)用價值[15]。將來，重組表達技術(shù)的進步將促進和改善DyP 型過氧化物酶的利用，DyP 在木質(zhì)素降解和酚類環(huán)境污染物修復(fù)方面必將發(fā)揮巨大的生物潛力。