李雅蘭 馬建嶺 史利卿 王 穎 羅敬月 羅景舒 李扭扭

(1 北京中醫(yī)藥大學,北京,100029; 2 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院呼吸熱病科,北京,100078; 3 浙江省中醫(yī)院呼吸科,杭州,310006; 4 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院中醫(yī)科,北京,101149)

咳嗽作為機體清除呼吸道有害刺激的一種防御機制,但若咳嗽過度,則會成為一種病理現(xiàn)象。依據(jù)咳嗽持續(xù)時間的不同,咳嗽可分為急性咳嗽(<3周)、亞急性咳嗽(3～8周)和慢性咳嗽(>8周)3類。其中咳嗽時間>8周,X線檢查無明顯異常的慢性咳嗽,由于咳嗽持續(xù)時間長,診治困難,成為人們于呼吸科、耳鼻喉科就診的主要原因之一[1]?，F(xiàn)代研究認為瞬時受體電位香草酸亞型1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1)通道激活介導氣道神經(jīng)源性炎癥,進而增加咳嗽反射的敏感性可能是其重要機制之一[2]。神經(jīng)源性炎癥因為有背根神經(jīng)反射參與故更容易誘發(fā)炎癥瀑布[3]。本團隊在對慢性咳嗽病因病機認識的基礎上,結合長期臨床用藥經(jīng)驗創(chuàng)立祛風宣肺方,用于治療慢性咳嗽取得較好臨床療效。本研究通過探討祛風宣肺方對咳嗽敏感性增高豚鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1、P物質(Substance P,SP)、降鈣素基因相關肽(Calcitonin Gene-related Peptide,CGRP)蛋白及基因的作用,進一步探討祛風宣肺方的作用機制,為其臨床應用提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取48只2周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性健康Hartley豚鼠,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物使用許可證號:SCXK(京)2016-0011,體質量200～250 g,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院動物房。飼養(yǎng)條件:SPF級動物房,溫度23 ℃,濕度60%。本研究通過北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院動物實驗倫理委員會審查(倫理審批號:201907),研究內容和過程中涉及的實驗動物,均符合國家對醫(yī)學實驗動物的有關要求。

1.1.2 藥物 祛風宣肺方(由炙麻黃、炙百部、炙紫菀等組成,本院藥劑室煎煮,濃縮,制備成含生藥量為2 g/mL的膏劑);Capsazepine(MCE公司,美國,貨號:HY-15640)。

1.1.3 試劑與儀器 卵蛋白(sigma,美國,貨號:S30353);Anti-TRPV1(Abcam,英國,貨號:ab6166);Anti-神經(jīng)激肽1受體(Neurokinin 1 Receptor,NK-1R)(NOVUS,美國,貨號:nb300-119);Anti-CGRP(LSBIO,貨號:c12345)。高速低溫離心機(Sigma,美國,型號:3-30K);電泳儀(Bio-Rad,美國,型號:EPS 300);0.22 μm聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜(Millipore,美國,型號:ISEQ00010);3MM濾紙(Whatman,英國,型號:3030861);電熱恒溫水浴槽(上海一恒,型號:HWS-24);凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國,型號:GelDoc-It310);ChemiDoc MP化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國,型號:170-8280)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 48只豚鼠適應性飼養(yǎng)3 d后,采用隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組、模型組、西藥組、中藥組4組,每組12只。除正常對照組外,其他組參照文獻[4]采用卵蛋致敏的方法建立咳嗽敏感性增高豚鼠模型,具體方法如下:依據(jù)體質量每只豚鼠以30 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液,2 d后每只豚鼠腹腔注射含有2 mg卵蛋白+100 mg氫氧化鋁的混懸液1 mL,3周后腹腔內再加強注射1次含有0.01 mg卵蛋白+100 mg氫氧化鋁的混懸液1 mL,以使豚鼠致敏。加強免疫后3周,將各組豚鼠置于霧化箱內,霧化吸入10 mg/mL的卵蛋白溶液90 s激發(fā),以誘發(fā)咳嗽。

1.2.2 給藥方法 造模成功后,正常對照組及模型組給予生理鹽水灌胃,1次/d,共干預7 d;西藥組給予Capsazepine(辣椒平,TRPV1通道阻滯劑)腹腔注射1 μmol/kg,1次/d,共干預7 d;中藥組給予祛風宣肺膏方(炙麻黃、炙百部、炙紫菀等,本院藥劑室煎煮,濃縮,制備成膏劑)灌胃,根據(jù)成人日用劑量,按照動物系數(shù)折算,給藥量按生藥量計算約5 g/kg(1倍人的等效劑量),1次/d,共干預7 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 辣椒素霧化法測定各組豚鼠的咳嗽次數(shù) 各組豚鼠給藥干預結束后次日,將其置于自制霧化箱內,霧化吸入辣椒素溶液(濃度為50 μmo1/L)5 min。豚鼠出現(xiàn)明顯的腹部收縮伴伸腳、伸頸、張口甚則伴有清脆咳嗽聲等特征性表現(xiàn)時,則可記錄咳嗽次數(shù)1次,記錄人員在計數(shù)豚鼠咳嗽次數(shù)時,不知其具體分組情況,觀測記錄10 min(含霧化時間5 min)內咳嗽的總次數(shù)。

1.2.3.2 實時PCR法檢測背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1、SP、CGRP mRNA水平 腹主動脈取血處死豚鼠后,將豚鼠俯臥置于冰面,剖開皮膚,鈍性分離,暴露頸胸椎骨,以頸部最隆突(第二胸椎棘突)處定位C7～T5棘突,于正中處分離椎管,暴露脊髓。用顯微外科鑷將脊髓推向一側,暴露并挑起脊神經(jīng),在椎間孔處可見背根神經(jīng)節(jié)。用顯微外科剪分離相應神經(jīng)節(jié),錫紙包裹,快速放入冷凍管,液氮速凍,保存于-80 ℃冰箱。每組隨機選取8只豚鼠,取背根節(jié)組織加入液氮研磨粉碎后加入1 mL Trizol,將其吸取到1.5 mL EP管中,加入500 μL酚氯仿,振蕩混勻,靜止5 min,4 ℃ 12 000 r/min,離心半徑13.5 cm,離心10 min,小心吸取上清液于一新的離心管中,加入700 μL異丙醇,混勻,于4 ℃ 12 000 r/min,離心半徑13.5 cm,離心10 min,小心去上清液,75%乙醇洗滌1次,晾干,溶于50 μL焦碳酸二乙酯水溶解DNA沉淀,電泳檢測提取總RNA。使用核酸濃度測定儀測定RNA濃度和純度。使用逆轉錄試劑盒Superscript Ⅲ將RNA逆轉錄成cDNA。實時PCR體系建立后,將其混勻,瞬離,置于熒光定量PCR儀上,按照以下條件反應:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共40次循環(huán)擴增。擴增反應結束后按95 ℃ 15 s,60 ℃60 s,95 ℃ 15 s建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線,每個樣品重復3次。見表1。

表1 TRPV1、SP、CGRP、PCR引物序

1.2.3.3 蛋白印跡法檢測背根節(jié)中TRPV1、NK1-R、CGRP蛋白表達 每組隨機選取4只豚鼠,取一定大小的背根節(jié)組織,加入蛋白提取液進行蛋白提取,二喹啉甲酸蛋白定量法測定蛋白濃度后,行十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離,進而將蛋白轉移到PVDF膜上,將轉移膜置于封閉液中,室溫搖床慢搖1 h后分別加入一抗4 ℃冰箱過夜,加入二抗室溫搖床慢搖1 h,后用TBST洗膜。采用ECL試劑盒讓其顯影,后將其放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像并拍照,最后對目標條帶的灰度值進行分析。

2 結果

2.1 一般情況 模型組飼養(yǎng)過程中死亡1只、卵蛋白霧化激發(fā)時死亡1只,共死亡2只;西藥組飼養(yǎng)過程中死亡1只、卵蛋白霧化激發(fā)時死亡2只,共死亡3只;中藥組卵蛋白霧化激發(fā)時死亡1只。剩余豚鼠,正常對照組豚鼠毛發(fā)光澤,輕度掉毛,體質量、呼吸、進食水量、活動等一般狀態(tài)良好,經(jīng)過造模的各組豚鼠掉毛較正常對照組多,體質量、呼吸、進食水量等與正常對照組無差異。

2.2 咳嗽次數(shù) 與正常對照組比較,模型組咳嗽次數(shù)增加(P=0.003<0.01);與模型組比較,中藥組、西藥組咳嗽次數(shù)降低(P=0.000<0.01,P=0.002<0.01);中藥組與西藥組比較,二者咳嗽次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.801>0.05)。見表2。

表2 各組豚鼠的咳嗽次數(shù)[次,M(P25,P75)]

2.3 各組豚鼠背根節(jié)組織中TRPV1、SP、CGRP mRNA表達 與正常對照組比較,模型組背根節(jié)中TRPV1、SP、CGRP mRNA表達升高(P<0.01);與模型組比較,西藥組、中藥組背根節(jié)中TRPV1、SP、CGRP mRNA表達下降(P<0.01);與西藥組比較,中藥組背根節(jié)中TRPV1、SP、CGRP mRNA表達升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組豚鼠背根節(jié)組織TRPV1、SP、CGRP mRNA表達

2.4 各組豚鼠背根節(jié)組織中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白表達 與正常對照組比較,模型組背根節(jié)中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白表達升高(P<0.01);與模型組比較,西藥組背根節(jié)中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白表達下降(P<0.05);與模型組比較,中藥組背根節(jié)中NK-1R、CGRP表達下降(P<0.05);與模型組比較,中藥組背根節(jié)中TRPV1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與西藥組比較,中藥組背根節(jié)中CGRP表達升高(P<0.05),中藥組與西藥組背根節(jié)中TRPV1、NK-1R蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1,表4。

圖1 各組豚鼠背根節(jié)組織中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白質印跡

表4 各組豚鼠背根節(jié)中TRPV1、NK-1R、CGRP蛋白表達

3 討論

慢性咳嗽屬中醫(yī)“久咳”“內傷咳嗽”的范疇,中醫(yī)對其認識歷史悠久,研究發(fā)現(xiàn)風邪為慢性咳嗽的重要病因。風為百病之長,易兼夾它邪侵襲機體,造成正氣虧虛,祛邪不盡,風邪留伏于肺,出現(xiàn)呼吸道敏感性增高的表現(xiàn),如冷空氣、油煙、異味等外邪即可誘發(fā)或加重咳嗽,另外,慢性咳嗽患者咽癢、咳嗽突發(fā)突止的主要臨床表現(xiàn)與“無風不作癢”“風性善行而數(shù)變”的風邪致病特點不謀而合[5]。本團隊提出風邪伏肺是慢性咳嗽的核心病機并創(chuàng)祛風宣肺方,方中炙麻黃辛溫發(fā)散、重在宣肺;青風藤可治諸風,與炙麻黃合用起到祛風宣肺的效果;前胡性微寒、為清熱下氣化痰的要藥,如《本草綱目》云:“前胡,乃手足太陰、陽明之藥……其功長于下氣,故能治痰熱喘嗽……”厚樸性溫、具有行氣燥濕化痰的作用;炙百部、炙紫苑共奏潤肺行氣、止咳化痰之功,全方寒溫并用、升降相因,在降低咳嗽敏感性方面臨床療效顯著。

慢性咳嗽發(fā)病機制復雜,目前普遍認為氣道神經(jīng)源性炎癥是引起咳嗽敏感性增高的重要機制,其持續(xù)存在是導致慢性咳嗽遷延反復的十分重要的一個原因。關于氣道神經(jīng)源性炎癥,以往研究更多地關注迷走神經(jīng)的參與,但是迷走神經(jīng)并不是介導氣道炎癥的唯一傳入纖維,背根節(jié)傳入神經(jīng)也支配肺和氣道[6-7]。劉春麗等[8]在一項關于胃食管反流性咳嗽的豚鼠活體實驗中提出背根反射可能也是參與氣道神經(jīng)源性炎癥的重要神經(jīng)通路。感覺神經(jīng)末梢受到刺激后,釋放的神經(jīng)肽或神經(jīng)遞質介導的炎癥反應稱為神經(jīng)源性炎癥,神經(jīng)源性炎癥反應與背根反射密切相關[9-10]。

背根反射的基礎是初級傳入神經(jīng)末梢去極化(Primary Afferent Depolarization,PAD),當初級傳入神經(jīng)元將興奮傳入中樞時,除了直接將信息向高級中樞傳遞,還可經(jīng)過“特殊”的中間神經(jīng)元與原傳入神經(jīng)元或其他初級傳入神經(jīng)元以“軸-軸”突觸形式形成環(huán)路,這一特殊的中間神經(jīng)元將興奮傳至末梢時,釋放特殊遞質,從而出現(xiàn)PAD,PAD過度則可產(chǎn)生沖動,經(jīng)背根逆向傳出,形成背根神經(jīng)反射[11-12]。有關豚鼠氣道交感神經(jīng)反射調節(jié)的研究提示:背根節(jié)神經(jīng)元支配呼吸道和肺部,氣道感覺神經(jīng)纖維受到刺激后,神經(jīng)沖動一方面可直接傳遞至神經(jīng)中樞,產(chǎn)生咳嗽,另一方通過背根神經(jīng)反射將神經(jīng)沖動逆?zhèn)髦林車窠?jīng)元,使神經(jīng)纖維末梢釋放大量神經(jīng)肽物質誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥,刺激咳嗽感受器導致異?？人缘陌l(fā)生[13]。因此,神經(jīng)源性炎癥因為有背根神經(jīng)反射的參與,較傳統(tǒng)炎癥更容易誘發(fā)炎癥瀑布。

瞬時受體電位香草酸亞型1TRPV1作為首個被克隆的瞬時受體電位通道,在無髓鞘的C纖維和有髓鞘的Aδ纖維上均有分布,在背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、頸神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元上高表達[14-16]。SP和CGRP主要在背根神經(jīng)節(jié)中合成、釋放到外周,介導神經(jīng)源性炎癥,并且CGRP能夠抑制SP酶的降解從而加強SP相關效應[17-18]。TRPV1通道受到外源或內源物質刺激時,會促使SP、CGRP、神經(jīng)激肽A(Neurokinin A,NKA)等神經(jīng)肽遞質的釋放,繼而出現(xiàn)局部組織血管擴張和通透性增加、炎癥細胞滲出、黏膜充血水腫、支氣管收縮等炎癥現(xiàn)象[19-20],因此不斷刺激咳嗽感受器,誘發(fā)咳嗽產(chǎn)生。呂俊等[21]通過煙熏結合內毒素滴鼻及辣椒素刺激復制感染后咳嗽模型,檢測各組老鼠背根節(jié)中TRPV1的表達,結果顯示與正常對照組比較,模型組背根節(jié)中TRPV1的蛋白及基因表達增加,提示TRPV1可通過背根反射誘發(fā)氣道神經(jīng)源炎癥增加咳嗽的敏感性,引起咳嗽。

本研究結果提示與正常對照組比較,模型組豚鼠背根節(jié)中TRPV1、SP、CGRP的蛋白及基因表達升高,可見采用卵蛋白致敏的方法建立慢性咳嗽模型可以通過興奮背根節(jié)中TRPV1通道,釋放SP、CGRP等神經(jīng)肽物質,進而誘發(fā)氣道神經(jīng)源性炎癥,導致咳嗽的產(chǎn)生。治療后,祛風宣肺方中藥組及Capsazepine抑制劑組背根節(jié)中TRPV1、SP、CGRP基因表達及NK-1R、CGRP蛋白表達較模型組下降,提示祛風宣肺方可通過抑制背根反射,抑制TRPV1通道,減少SP、CGRP的釋放,進而減輕氣道神經(jīng)源性炎癥而產(chǎn)生治療作用。

雖然祛風宣肺方在降低背根節(jié)組織中TRPV1、SP、CGRP蛋白及基因表達方面效果不及西藥TRPV1抑制劑,但其在降低模型豚鼠咳嗽次數(shù)中作用不劣于西藥阻滯劑,體現(xiàn)了祛風宣肺方多途徑、多靶點的作用特點,祛風宣肺方可能通過抑制TRPV1通道進而減輕氣道神經(jīng)源性炎癥而發(fā)揮治療作用,同時其可能亦可通過其他途徑發(fā)揮治療作用,未來亦需要更多研究進一步探討其作用機制。

利益沖突聲明:無。