黃笑然，楊文建，萬祥旭，周思宇，周寶麗，孟 鑫，金志民

（牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

棕黑錦蛇（Elaphe schrenckii）是錦蛇屬（Elaphe）動物，人工養(yǎng)殖條件下的棕黑錦蛇在觀賞和食用方面具有較大經(jīng)濟價值。其鱗片特征、脂肪酸和單糖的組成與含量可以對棕黑錦蛇經(jīng)濟和保護價值進一步研究提供基礎(chǔ)資料。相關(guān)學(xué)者對烏梢蛇及7 種常見蛇類混淆品的鱗片進行對比分析［1］，有研究采用GC-MS 法鑒定出尖吻蝮蛇（Spilotes pullatus）油中的20 種脂肪酸［2］，相關(guān)研究采用氣相色譜法對微生物單糖、百合多糖和茶多糖樣品中的單糖含量進行測定［3］，棕黑錦蛇鱗片形狀顏色和數(shù)目種類具有明顯特有的性狀。脂肪中脂肪酸和肌肉中單糖的種類與相對含量也是其食用和藥用價值的判斷標準之一。棕黑錦蛇鱗片特征為蛇類混淆品鑒定提供基礎(chǔ)資料，探究脂肪酸和單糖的種類與相對含量，對棕黑錦蛇食用和藥用價值的研究進行一定補充，進一步明確棕黑錦蛇的保護意義和價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為2021 年8 月于牡丹江市三道關(guān)林場道路上遭車輛碾壓瀕死的棕黑錦蛇。三道關(guān)林場（129°17′—129°35′E，44°41′—44°51′N）位于牡丹江市西北部，距市區(qū)24 km。

1.2 儀器與試劑

7890A 型氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；SCIENTZ-10N 型冷凍干燥機，SB-5200DT 型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-5286A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SteREO Discovery V8 型體視顯微鏡（德國ZEISS 公司）；MD-3500 型透析袋（北京翊博生物集團有限公司）；葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖購自上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、95%乙醇溶液、氯化鈉、氫氧化鈉、甲醇、吡啶、三氟乙酸、三氯乙酸、鹽酸羥胺、乙酸酐、正己烷、石油醚（30～60 ℃和60～90 ℃）均為市售分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 鱗片分析 將棕黑錦蛇頭部表面用清洗液清洗干凈后自然晾干。背部鱗片于超聲波清洗器中清洗10 min，再用去離子水于超聲波清洗器中清洗10 min，重復(fù)3 次，自然晾干；無水乙醇中浸泡3 h 對自然晾干后背部鱗片進行脫水，脫水后鱗片用2 片載玻片夾住，并用夾子夾緊以防止鱗片蜷縮。在解剖鏡下對頭部頂面、側(cè)面和背部鱗片進行觀察拍攝記錄。

1.3.2 脂肪酸組成測定 稱取40 g 脂肪組織研磨至勻漿，按料液比1∶10（g∶mL）加入正己烷與石油醚（沸程60～90 ℃）的混合溶劑（正己烷和石油醚體積比1∶1），采用超聲波輔助提取法提取脂肪酸，超聲功率為200 W，溫度55 ℃，超聲時間2 h。抽濾去除殘渣，利用分液漏斗取上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40 ℃）去除有機溶劑后利用分液漏斗取上清液，即為棕黑錦蛇粗蛇油。

甲酯化：取4～5 滴脂肪酸樣品與2 mL 氫氧化鈉-甲醇溶液（2 mol/L）充分振蕩，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫后加入2 mL 正己烷充分振蕩，靜置分層取上清液供氣相色譜分析。

色譜條件：毛細管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm），載氣為氮氣，分流比100∶1，進樣體積1 μL，進樣口溫度270 ℃，檢測器溫度280 ℃。初始溫度100 ℃，10 ℃/min 升溫至180 ℃，保持6 min，1 ℃/min 升溫至200 ℃，保持20 min，4 ℃/min 升溫至230 ℃，保持10.5 min。

1.3.3 單糖組成測定

1）粗多糖提取。取肌肉100 g 洗凈瀝干，研磨至勻漿，按料液比1∶2（g∶mL）加入正己烷和石油醚（沸程30～60 ℃）混合溶液（體積比1∶1），采用超聲輔助提取法，30 ℃提取90 min，抽濾得殘渣回收，重復(fù)2次。先后按料液比1∶2（g∶mL）加入生理鹽水和NaOH 溶液勻漿后，30 ℃超聲提取40 min，使粗多糖先后溶于生理鹽水和NaOH 溶液，紗布過濾得上清液1 和上清液2，重復(fù)2 次。合并上清液1 和上清液2，70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，抽濾去雜，獲得濃縮液，加入4 倍體積的95%乙醇溶液于4 ℃靜置12 h 醇沉。醇沉后4 000 r/min 離心20 min，沉淀冷凍干燥后即為粗多糖。加入3%三氯乙酸溶液，攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)pH 至3.0，4 ℃過夜，4 500 r/min 離心10 min（沉淀即為蛋白質(zhì)），將上清液即多糖溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0，再重復(fù)此過程至無沉淀析出。70 ℃濃縮，多糖溶液透析24 h，凍干得精制多糖。

2）多糖水解。稱取30 mg 棕黑錦蛇多糖于具塞試管，加入6 mL 的2 mol/L 三氟乙酸在105 ℃反應(yīng)6 h，冷卻至室溫，70 ℃水浴濃縮至干。經(jīng)1 mL 甲醇溶液溶解后70 ℃真空濃縮至干，重復(fù)3 次，獲得多糖水解干燥品。

3）衍生物制備。稱取3 mg 多糖水解干燥品（對照品單糖）加入10 mg 鹽酸羥胺和0.5 mL 吡啶，于具塞試管中90 ℃水浴30 min，水浴期間間歇混勻。室溫冷卻后加0.5 mL 乙酸酐，90 ℃水浴30 min，室溫冷卻后0.22 μm 濾膜過濾，獲得棕黑錦蛇單糖衍生物。按照上述步驟但不加入單糖進行反應(yīng)，所得溶液即為空白樣品；9 種對照品單糖經(jīng)衍生后各取100 μL 混合，即為混合對照品。

4）色譜條件。毛細管柱：（130 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氮氣，分流比20∶1，進樣體積1 μL，進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃。初始溫度140 ℃，10 ℃/min 升溫至240 ℃，保持10 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 軟件對氣相色譜數(shù)據(jù)預(yù)處理，Origin 2018 軟件完成氣相色譜圖的繪制，預(yù)處理數(shù)據(jù)和色譜圖對比確定標準品和樣品間的對應(yīng)，根據(jù)標準品鑒定棕黑錦蛇所含有脂肪酸和單糖的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕黑錦蛇鱗片特征

2.1.1 背鱗顯微觀察結(jié)果 圖1 中，背部鱗片呈長菱形，有脊紋，左右對稱，有橢圓形端窩2 個，端窩明顯，靠近游離端。鱗片表面黃棕色。游離端狹尖，質(zhì)地較厚，鱗片腹面有薄膜囊。鱗片表面有縱直的條紋，兩側(cè)有明顯的乳頭狀凸起，分布區(qū)域窄長，基部邊緣有指紋樣橫紋。

圖1 棕黑錦蛇鱗片

2.1.2 頭部鱗片對比 圖2 中，棕黑錦蛇頭長頸細，頭背黑色，頭腹黃色，背面與腹面交界處鱗片黑色和黃色交錯，鱗片形狀規(guī)則，分界線清晰。鼻鱗、頰鱗、眶上鱗、眶前鱗、眶后鱗、顳鱗、上唇鱗均在蛇頭兩側(cè)對稱分布，總數(shù)目即為單側(cè)鱗片數(shù)的2 倍；下唇鱗圍繞蛇頭下唇連續(xù)分布，以吻鱗正下方的下唇鱗為中心，兩側(cè)對稱分布，數(shù)目為11+1+11。鱗片的長寬以蛇頭背面縱向為長，橫向為寬作為判斷標準（表1）。

表1 棕黑錦蛇頭部鱗片特征

圖2 棕黑錦蛇頭部鱗片

2.2 脂肪酸組成特征

將經(jīng)過超聲波輔助提取得到的棕黑錦蛇油脂經(jīng)甲酯化反應(yīng)后，采用氣相色譜法進行脂肪酸組成分析。脂肪酸組成定性分析利用標準品進行對照，定量分析采用峰面積歸一化法。棕黑錦蛇油脂脂肪酸氣相色譜圖如圖3 所示，脂肪酸種類及相對含量如表2 所示。

表2 棕黑錦蛇蛇油中脂肪酸的種類及含量

圖3 棕黑錦蛇脂肪酸樣品氣相色譜圖

圖3 中，棕黑錦蛇油脂中脂肪酸含量豐富，共檢出15 種脂肪酸，以不飽和脂肪酸為主，十七碳一烯酸（C17∶1）、山崳酸（C20∶0）未檢測出，存在一定量的十四碳以下脂肪酸。飽和脂肪酸（SFA）豆蔻酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、木焦油酸相對含量共有31.236%；不飽和脂肪酸（UFA）相對含量共有63.246%，其中單不飽和脂肪酸（MUFA）棕櫚油酸、油酸、花生一烯酸、芥酸、神經(jīng)酸相對含量占37.659%，多不飽和脂肪酸（PUFA）亞油酸、亞麻酸、花生二烯酸、二十二碳二烯酸相對含量占25.587%，UFA 與SFA 比值為2.02，UFA 占比較高。SFA 中棕櫚酸（22.600%）含量最高，其次是硬脂酸（5.280%）和豆蔻酸（2.800%），UFA 中油酸（34.200%）和亞油酸（22.200%）含量最高，其次是棕櫚油酸（2.960%）和亞麻酸（2.950%）。

2.3 肌肉單糖組成氣相色譜特征

圖4 中，各單糖的保留時間依次為葡萄糖醛酸1.26 min、半乳糖醛酸2.13 min、鼠李糖4.29 min、阿拉伯糖4.49 min、木糖4.68 min、甘露糖7.55 min、葡萄糖7.73 min、半乳糖8.06 min、果糖11.94 min，將樣品、空白對照、混合對照品的氣相色譜圖進行對比，通過保留時間判斷棕黑錦蛇多糖樣品在葡萄糖醛酸和葡萄糖處有吸收峰。其中葡萄糖吸收峰面積占69.13%，葡萄糖醛酸占14.32%，保留時間1.13 min和1.40 min 處的吸收峰因缺少標準品對照無法判斷種類，峰面積各占8.51%和8.04%。依據(jù)空白譜圖鑒定保留時間3.24 min 和4.19 min 處吸收峰不是由單糖引起形成的。

圖4 棕黑錦蛇肌肉單糖氣相色譜圖

3 討論

3 種錦蛇背部鱗片均為黃棕色，基部邊緣有指紋樣橫紋，靠近游離端的橢圓形端窩和縱直條紋；黑眉錦蛇鱗片整體呈菱形或卵圓形，左右不對稱，無脊紋；王錦蛇鱗片整體呈長橢圓形，游離端狹尖且質(zhì)地較薄，鱗片腹面無薄膜囊［1］。同一屬3 種錦蛇鱗片微觀特征之間的差異，說明可以通過背部鱗片對蛇類混淆品進行鑒定。棕黑錦蛇的頰鱗、眶前鱗、眶后鱗數(shù)目與王錦蛇、百花錦蛇、紅點錦蛇、雙斑錦蛇相同［4-6］，吻鱗、鼻間鱗、額鱗、頂鱗的數(shù)目與黑眉錦蛇和王錦蛇相同［1］，說明頭部鱗片也可以作為蛇類混淆品鑒定的依據(jù)。

棕黑錦蛇所測定的脂肪酸中油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸的相對含量較高，與烏梢蛇、緬甸蟒和中華眼鏡蛇相同［7-9］。與棕黑錦蛇脂肪酸相對含量由大到小依次是油酸（34.200%）、棕櫚酸（22.600%）、亞油酸（22.200%）、硬脂酸（5.280%）相比，烏梢蛇是油酸（41.360%）、棕櫚酸（23.720%）、亞油酸（7.200%）、硬脂酸（7.140%），緬甸蟒是油酸（50.700%）、棕櫚酸（22.100%）、亞油酸（9.800%）、硬脂酸（7.800%），中華眼鏡蛇是油酸（39.420%）、棕櫚酸（25.040%）、亞油酸（15.760%）、硬脂酸（11.190%）。雖然相對含量較高的脂肪酸種類相同，但是其中棕黑錦蛇油酸含量低于其他3 種蛇類，亞油酸含量高于其他3 種蛇類，而亞油酸是人體不能自身合成的必需脂肪酸，具有抗癌、抗糖尿病、降低血液和肝臟膽固醇與調(diào)節(jié)機體免疫力的作用。

本研究利用三氟乙酸水解、鹽酸羥胺衍生并通過氣相色譜分析測得棕黑錦蛇肌肉多糖由葡萄糖和葡萄糖醛酸組成。有研究利用三氟乙酸水解，通過高效液相色譜法分析皺紋盤鮑（Haliotis discus hannaiIno）肌肉多糖中單糖主要由葡萄糖組成［10］；也有研究利用木瓜蛋白酶酶解，通過高效液相色譜測定皺紋盤鮑腹足的粗多糖主要由葡萄糖和半乳糖2 種單糖組成［11］。這些結(jié)果不同于本研究中提取的多糖，可能與物種及多糖提取方法有關(guān)。棕黑錦蛇肌肉中測得的葡萄糖醛酸，能與許多體內(nèi)外毒物及其代謝產(chǎn)物結(jié)合成無毒的葡萄糖醛酸結(jié)合物后排出體外，具有保肝護肝和排毒解毒的作用，還可用于關(guān)節(jié)炎和結(jié)締組織疾病以及風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的輔助治療。

4 結(jié)論

本研究分析棕黑錦蛇頭部和背部鱗片，測定油脂中脂肪酸和肌肉多糖中單糖的種類和相對含量，表明棕黑錦蛇頭部鱗片數(shù)目和形態(tài)與背部鱗片的顯微特征均能作為與其他蛇類混淆品鑒別的依據(jù)，蛇類鱗片間的特征差異對于蛇類鑒定有著一定的作用。脂肪酸以不飽和脂肪酸含量最大，其中亞油酸的相對含量較其他蛇類高，在藥用方面具備一定的價值。肌肉多糖中測得的葡萄糖醛酸，可用于排毒護肝、輔助治療關(guān)節(jié)炎，具有一定的研究價值。