陳 靜

（江西省醫(yī)藥技師學院，南昌 330200）

密集型養(yǎng)殖模式的應用以及水質環(huán)境的不斷惡化使得水產養(yǎng)殖疾病頻發(fā)，無形之中使得抗生素等防治藥物的用量與病菌環(huán)境之間形成惡性循環(huán)［1］?？股睾拖緞╊惢瘜W藥物會導致病菌產生多重耐藥性，對水生環(huán)境和人們的身體健康造成較大的隱患［2］。微生物防治、網箱養(yǎng)殖、細菌制劑等手段多被運用在水產養(yǎng)殖病菌防治中，但這些防治手段受限于養(yǎng)殖規(guī)模和環(huán)境條件因素，且菌群抑制作用不穩(wěn)定，難以發(fā)揮長久有效的功效［3］。而中草藥作為一種天然藥物，其本身的低殘留性以及對藥源性疾病傳播的根絕性，使其在水產養(yǎng)殖中多被運用在哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌等的抑制作用上［4］。中草藥本身所含有的營養(yǎng)物質元素也能提高水生動物的免疫力，多位學者也曾借助中草藥提取物對水生病菌的抑制作用進行了探究［5-7］。不同中草藥的病菌抑制作用不盡相同，鑒于此，對中草藥聯合用藥在水產養(yǎng)殖中的抑菌作用進行探究，并以微生物種群結構變化對其效果進行佐證，以期為中草藥聯合用藥在水產養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同中草藥含有的成分及藥物療效各不相同，故先對傳統中草藥進行初步篩選，再對抑菌作用強的中草藥進行配比組合試驗。從某魚類養(yǎng)殖場中取一定量的水樣，對水樣中提取出的常見致病病原體進行無菌分離鑒定，得到嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、嗜鹽菌（Bibrio parahemolyticus）、假單胞菌（Pseudomonas adaceae）、枸櫞酸桿菌（Citrobacter freundii）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）［8］，上述5 種致病菌分別標記為細菌A-細菌E。表1 為致病菌培養(yǎng)基，表2 為中草藥信息，中草藥購于某藥房，藥材均為干燥狀態(tài)。

表1 致病菌培養(yǎng)基

表2 中草藥信息

1.2 中草藥提取物的制備

對所選中草藥分別稱取50 g 置于烘箱中于60 ℃烘干，將烘干后的固態(tài)中草藥與烘干后研磨成粉的中草藥按照1∶1 的比例混合置于燒瓶中，在燒瓶中加入500 mL 去離子水，混合物靜置浸泡3 h。隨后對浸泡液進行文火煎煮，反復3 次，每次1 min。最后將3 次煎煮的藥液過濾和加熱濃縮，高溫滅菌后置于低溫保存?zhèn)溆?。聯合用藥的制備方法同上?/p>

1.3 病菌的培養(yǎng)和藥敏片的制備

將細菌分別劃線LB 平板上，并在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將單菌落接種于無菌LB 培養(yǎng)基中，借助麥氏比濁儀對培養(yǎng)且清洗后的菌苔液進行密度測定。調適后的菌苔液置于試管中保存用于后續(xù)的試驗操作［9］。對無菌濾紙進行藥液浸泡后烘干保存，則完成藥敏片的制備。

1.4 試驗方案

1.4.1 抑菌試驗 將“1.3”中制備的100 μL 菌懸液均勻涂抹于LB 平板上，隨后將藥敏片貼于瓊脂表面，觀察恒溫培養(yǎng)下的抑菌圈大小。抑菌圈直徑（Inhibitory circle，IC）的大小能反映藥物濃度的變化和藥物敏感性［10］。每種藥物均進行3 次重復試驗，最后取3 次試驗的平均值。根據不同中草藥呈現出的抑菌圈直徑大小進行效果差異值劃分，以10 mm為基線標準，在此基礎上每增加5 mm，則其抑菌作用提升一個等級?！?”為無敏感，抑菌圈直徑小于10 mm；“+”為弱敏感，抑菌圈直徑10～15 mm；“++”為中等敏感，抑菌圈直徑15～20 mm；“+++”為較強敏感，抑菌圈直徑20～25 mm；“++++”為強敏感，抑菌圈直徑大于25 mm。

以最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）對抑菌作用進行數據量化處理，其數值大小與藥效作用的強弱呈反比，即MIC、MBC越小則呈現出的抑菌圈越大［11］。并借助二倍稀釋法進行抑菌試驗結果測試，從測試結果中選擇抑菌作用較強的藥物并將其分別置于10 mL 的試管中，按照不同濃度編號，另外再設置一組陽性對照和一組陰性對照（陽性對照為只加藥液的空白對照，陰性對照只加菌液不加藥液）。將菌液接種至相應的試管中，接種量均為100 μL，觀察28 ℃培養(yǎng)24 h 后菌群的變化情況，假如試管中為透明狀態(tài)，則表明無細菌生長，那么該濃度即為最小抑菌濃度。

1.4.2 微生物種群試驗 為對中草藥聯合用藥在水產養(yǎng)殖中微生物種群結構的影響進行分析，研究借助高通量測序技術進行數據處理。在Miseq 高通量測序平臺利用測序技術對藥物敏感性強的聯合用藥在微生物種群結構上的影響進行分析，對每組的測定數據取平均值，從DNA 提取、數據測序、OUT 聚類分析等幾個方面對結果進行評定。

1）樣品采集。以某水養(yǎng)殖系統為試驗場地，設置適宜的恒溫環(huán)境條件，將水養(yǎng)殖系統分為對照（對照組為中草藥單一用藥）和3 個試驗組，3 個試驗組為篩選出的具有強抑菌作用的中草藥聯合用藥組。各處理分別加入對應的中草藥混合液，使得水體最小抑菌濃度始終保持在30 mg/mL。取相同體積的水樣涂至培養(yǎng)基上，每3 d 統計1 次細菌數量，共統計6 次處理。

2）測序技術步驟。在養(yǎng)殖系統中分別在對照組和處理組養(yǎng)殖水中取出0.5 L 的水體混合攪勻后進行DNA 提取，提取試劑盒為Foregene 試劑盒。DNA處理和測序由江蘇華冠生物技術股份有限公司進行。依據測序結果對樣本進行OUT 聚類分析（Operational Taxonomic Units），對具有97%相似度的序列指數進行分析，能較好地分析群落結構的差異性。

2 結果與分析

2.1 中草藥的篩選

對中草藥的抑菌作用進行分析，結果如圖1 所示。圖1 結果表明，所選用的中草藥均有不同程度的抑菌作用，其中Co 對細菌B 的抑菌圈直徑最大，Mu、Gr 和Co 均對細菌B 有較好的抑菌效果，IC值分別為16.14、18.12 和26.83 mm，對5 種致病菌的總體抑菌效果較好的是Mu、Gr、Co、Pu。故在之后的中草藥聯合用藥中對這4 種進行分析。

2.2 中草藥聯合用藥的抑菌效果和耐藥性分析

2.2.1 抑菌效果 對Mu、Gr、Co、Pu 藥材進行配比，分析其聯合用藥對致病菌的抑制作用。從表3 可以看出，不同中草藥聯合用藥所呈現出的抑菌效果各有不同，從抑菌圈直徑來看，“Mu+Pu”組合對5 種細菌的整體抑菌作用最大，其IC值在細菌A-D 上均在10.00 mm 以上，整體平均抑菌圈直徑達13.23 mm；其次“Mu+Gr”組合和“Mu+Co”組合所表現出的藥物敏感性雖稍差于“Mu+Pu”組合，但其IC 平均值仍然達到了11.69 mm和11.44 mm。而“Gr+Pu”和“Co+Pu”組合僅在細菌A 和B 上表現出較好的抑菌效果，其整體IC值較低。從MBC值來看，“Mu+Gr”“Mu+Co”“Mu+Pu”“Gr+Co”“Gr+Pu”“Co+Pu”6 種中草藥 配 比方案對5 種細菌的MBC最小值分別為7.80、25.68、7.81、62.38、25.68、26.11 mg/mL?！癕u+Gr”組合對細菌A、B 和D 的MIC均值為7.85 mg/mL，“Mu+Pu”組合對細菌C、D、E 的MIC均值為7.82 mg/mL，同時結合圖2 發(fā)現，將抑菌效果較好的烏梅和川連與其他中草藥聯合后，其所表現的抑菌效果沒有明顯的提升。上述結果表明，“Mu+Gr”組合、“Mu+Co”組合、“Mu+Pu”組合以及“Gr+Co”組合具有較好的菌群控制作用，且其藥物敏感性較強。

表3 中草藥聯合用藥下的致病菌MIC 和MBC 變化情況

2.2.2 耐藥性 圖2 是對細菌A 的耐藥性分析，細菌在不同中草藥聯合用藥下的數據變化差異明顯，其中“Mu+Gr”組合下，細菌A 的MIC和MBC分別為3.7、4.3 mg/mL 時可以有效抑制病菌的生長，“Mu+Co”和“Mu+Pu”組合中細菌A 的整體MIC和MBC數據下降態(tài)勢稍劣于“Mu+Gr”組合，但“Mu+Co”組合和“Mu+Pu”組合在藥物濃度最低為5.5 mg/mL 和0.115 mg/mL 時可以抑制病菌數量，“Mu+Pu”組合表現最優(yōu)。而“Gr+Co”組合MIC的最大值與最小值之間差異顯著（P＜0.05），表現出一定的耐藥性，應用推廣性受限，故在后期的微生物多樣性分析上不對該配比方案進行探討。

2.3 聯合用藥下的細菌差異性和微生物種群分析

2.3.1 水體微生物分析 高通量測序技術下的多樣性分析是借助Alpha 指數和稀釋曲線反映特定生態(tài)環(huán)境下的微生物豐富性和多樣性情況，對試驗數據進行收集整理后，繪制成圖3。圖3 中有3 個處理組（為上文中提到的“Mu+Gr”組、“Mu+Co”組以及“Mu+Pu”組，此處標記為試驗組1、2、3），每個處理組中包括兩個平行對照組。不同處理組中的樣品細菌豐度有所差異，因此在稀釋曲線時進行比較。圖3a 中的不同水體樣本以覆蓋情況進行序列分析，結果表明，水體的采樣數值在后期逐漸趨于平穩(wěn)，基本不表現出增加態(tài)勢且整體表現出較好的序列量，可以進行后續(xù)的微生物檢驗分析。且對照組樣本的序列量明顯多于其他組別，結合圖3b 結果分析，發(fā)現對照組兩個樣本Ace 指數和Shannon 指數均高于其他組別。而在中草藥聯合用藥下的3 個試驗組的兩個指數值均較低，且試驗組1 所包含的細菌種數相對較少，不同水體樣本中的細菌總數存在一定的差異性。

圖3 不同水體樣品的稀釋曲線和指數變化情況

2.3.2 樣本水體細菌豐度變化情況 對樣本水體中的細菌群落情況進行分析，從圖4 可以看出，4 個組別下不同屬類的細菌占比均有所不同，且存在部分細菌種屬消失情況，對照組較試驗組中的致病菌變化幅度情況超過5%。樣本水體中的微生物結構表現出一定程度的差異性，且3 種中草藥聯合用藥所表現的抑菌作用明顯。

圖4 不同水體樣本中的細菌豐度變化情況

2.3.3 樣本水體細菌差異性比較 以多元統計分析對水體樣本的逐漸差異情況進行分析，并以細菌總數和物種檢測數量為指標進行比較，將數據繪制成表，其結果如表4 所示。試驗干預前，對照組和投入中草藥的試驗組在基線數據上沒有太大的變化。而隨試驗干預時間的延長，添加中草藥聯合用藥的組合細菌總數顯著下降，且其數據與對照組相比以及與前一時間點數據相比差異顯著（P＜0.05）。同時“Mu+Gr”組合、“Mu+Co”組合和“Mu+Pu”組合的細菌豐度減少率分別為28.16%、25.33%和13.27%，其中“Mu+Gr”組抑菌效果最顯著。

表4 樣本水體細菌的差異性比較

3 小結

可持續(xù)發(fā)展理論理念的提出以及對綠色養(yǎng)殖模式的嘗試創(chuàng)新使得越來越多的人開始關注到水產養(yǎng)殖可持續(xù)的重要性，也逐漸有意識地引入不同的藥物制劑對致病菌進行防治控制。研究提出以中草藥聯合用藥來探究其對微生物及致病菌的影響機制，結果表明，Mu、Gr、Co、Pu 4 種中草藥聯合用藥對5種致病菌具有不同程度的抑制作用，其中“Mu+Gr”組合、“Mu+Co”組合和“Mu+Pu”組合所達到的平均抑菌圈直徑分別為11.69、11.44、13.23 mm，且藥物敏感性較強；同時“Mu+Gr”組合下的病原菌MIC和MBC在最低藥物濃度為3.7 mg/mL 和4.3 mg/mL 時可以有效抑制病菌，但“Gr+Co”組合表現出一定的耐藥性（P＜0.05）。試驗結果表明，烏梅與川連、石榴皮以及白頭翁進行配比時具有較好的抑菌作用，其配比用量需要根據不同水生環(huán)境以及氣溫變化等因素的影響進行調整，加強對中草藥聯合用藥的應用可實踐性是今后研究的主要改進方面。