李鈴鈴，尹翼，何愛琴

宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤發(fā)病率中占第2 位［1-2］。高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus， HPV）作為最主要的致癌因子，可直接參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，其中約70%的宮頸癌與高危型HPV16 感染有關(guān)［3］。目前高危型HPV16 如何誘導(dǎo)正常宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，病毒癌蛋白在HPV 感染早、晚期通過調(diào)控何種細(xì)胞信號通路發(fā)揮致癌作用等問題尚不清楚，亟需進(jìn)行研究。核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）P50、NF-κB 抑制蛋白-α（inhibitory nuclear factor-κB-α， IκB-α）參與肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4-7］，但NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)與HPV16 陽性宮頸癌的關(guān)系目前尚不清楚。鑒于此，本研究分析NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)及兩者與HPV16 陽性宮頸癌預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床治療及改善宮頸癌患者的預(yù)后提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2017 年3 月至2019 年2 月收治的106 例HPV16陽性宮頸癌、52 例高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（highgrade squamous intraepithelial lesion， HSIL）、43 例低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變（low-grade squamous intraepithelial lesion， LSIL）患者的宮頸組織標(biāo)本及同期行全子宮切除術(shù)（因子宮腺肌癥）的80 例患者正常宮頸 組 織 標(biāo) 本?；?者 年 齡21～62 歲［（46.85 ±10.42）歲］。本研究患者及其家屬均知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

納入標(biāo)準(zhǔn)：病理類型經(jīng)病理科證實(shí)者；年齡＞18 歲；術(shù)前未接受任何形式的治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其他部位惡性腫瘤或陰道炎；注射過HPV 疫苗；重要臟器嚴(yán)重功能障礙；伴有免疫缺陷性疾??；伴有傳染性疾病或性病者；哺乳期或妊娠期女性。

1.2 NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)檢測方法 采取免疫組化法檢測宮頸癌組織、LSIL 組織、HSIL 組織、正常宮頸組織中NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)情況。標(biāo)本采用石蠟包埋、切片，滅活、微波抗原修復(fù)、洗滌，添加鼠抗人NF-κB P50 單克隆抗體、IκB-α 抗體（北京博奧森公司），于4 ℃孵育過夜；隨后，采用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，滴二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，采用蘇木精復(fù)染，脫水，封片。NF-κB P50、IκB-α 以細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染為黃色或棕黃色記為陽性表達(dá)，否則記為陰性表達(dá)。

1.3 預(yù)后隨訪 通過門診、電話等多種方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止時間為2022 年3 月，每3 個月隨訪1 次，以研究對象失訪、死亡或隨訪時間截止為終點(diǎn)事件。

1.4 臨床資料收集 收集影響HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后的有關(guān)資料，主要包括年齡、體重指數(shù)（body mass index， BMI）、腫瘤最大徑、是否合并基礎(chǔ)疾?。ㄌ悄虿?、高血壓、高脂血癥）、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、宮旁浸潤、脈管侵犯、術(shù)后治療（放療、化療）、宮頸癌組織中NF-κB P50 及IκB-α表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理所得數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以xˉ± s 表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，多組間計(jì)數(shù)資料兩兩比較需調(diào)整檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，即α'=α/k×（k-1）/2，其中α=0.05，k是組數(shù)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristics， ROC）曲線；采用Cox 回歸模型分析影響因素。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB P50、IκB-α 在不同宮頸組織中的表達(dá)情況比較 正常宮頸組織、LSIL 組織、HSIL 組織、宮頸癌組織中NF-κB P50 陽性表達(dá)率、IκB-α 陰性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；NF-κB P50 陽性表達(dá)率、κBα 陰性表達(dá)率表現(xiàn)為宮頸癌組織＞HSIL 組織＞LSIL 組織＞正常宮頸組織（P＜0.01）。見表1。

表1 NF-κB P50、IκB-α 在不同宮頸組織中的表達(dá)情況

2.2 NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)與宮頸癌患者病理特征的關(guān)系 不同年齡、BMI、病理類型、宮旁浸潤的HPV16 陽性宮頸癌患者癌組織中NF-κB P50 陽性表達(dá)率、IκB-α 陰性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腫瘤最大徑≥4 cm、臨床分期Ⅲ/Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、脈管侵犯的HPV16 陽性宮頸癌患者癌組織中NF-κB P50 陽性表達(dá)率、IκB-α 陰性表達(dá)率高于腫瘤最大徑＜4 cm、臨床分期Ⅰ/Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/高分化、無脈管侵犯的HPV 陽性宮頸癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)與宮頸癌患者病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.3 影響HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后的多因素分析 106 例HPV16 陽性宮頸癌患者術(shù)后隨訪3 年，共失訪3 例，剩余103 例患者中22 例死亡，存活率為78.64%（81/103）；Cox 回歸分析顯示，臨床分期（OR=2.546，95%CI：1.054～3.672）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（OR=2.734，95%CI：1.469～4.183）、分化程度（OR=3.257，95%CI：2.015～6.432）、NF-κB P50 陽性表達(dá)（OR=4.025，95%CI：2.765～8.436）、IκB-α 陰性表 達(dá)（OR=4.368，95%CI：3.104～10.254）均 是HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后的單因素、多因素分析

2.4 NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)與HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 截至隨訪結(jié)束，NF-κB P50 陽性患者失訪2 例，剩余76 例，其中死亡20 例，總存活率為73.68%（56/76）；NF-κB P50 陰性患者失訪1 例，剩余27 例，其中死亡2 例，總存活率為92.59%（25/27）。NF-κB P50 陽性表達(dá)患者與NFκB P50 陰性表達(dá)患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.098，P=0.043）。見圖1。

圖1 HPV16 陽性宮頸癌組織NF-κB P50 陽性表達(dá)、NF-κB P50 陰性表達(dá)患者生存曲線

截至隨訪結(jié)束，宮頸癌患者中IκB-α 陽性患者無失訪，無死亡，總存活率為100.00%（10/10）；IκBα 陰性患者失訪3 例，剩余93 例，其中死亡22 例，總存活率為76.34%（71/93）。IκB-α 陽性表達(dá)患者與IκB-α 陰性表達(dá)患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.783，P=0.048）。見圖2。

圖2 HPV16 陽性宮頸癌組織IκB-α 陽性表達(dá)、IκB-α 陰性表達(dá)患者生存曲線

3 討論

宮頸癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，可能與遺傳、過早性生活等因素有關(guān)［8-10］。HPV 是一種具有高度特異性的嗜上皮性病毒，其中高危型HPV16 持續(xù)感染的宮頸病變進(jìn)展為宮頸癌的概率大幅增加［11］。在宮頸癌變發(fā)展期間及時篩查、準(zhǔn)確診斷并給予對癥治療對降低宮頸癌發(fā)生率、死亡率意義重大。對NF-κB P50、IκB-α 與HPV16 陽性宮頸癌的關(guān)系進(jìn)行探討，具有十分重要的臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，NF-κB P50 陽性表達(dá)率、IκB-α陰性表達(dá)率表現(xiàn)為宮頸癌組織＞HSIL 組織＞LSIL 組織＞正常宮頸組織。提示NF-κB P50 在宮頸病變組織中異常高表達(dá)，且隨著宮頸病變的嚴(yán)重程度增加，NF-κB P50 表達(dá)水平呈升高趨勢；IκB-α 在宮頸病變組織中異常低表達(dá)，且隨著宮頸病變的嚴(yán)重程度增加，IκB-α 表達(dá)水平呈下降趨勢。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)，慢性炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［12-14］；NF-κB 家族為炎癥通路中的關(guān)鍵成員之一，其在介導(dǎo)免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)天然免疫系統(tǒng)功能方面發(fā)揮著重要作用。其中NF-κB P50 為其家族的主要成員之一，可與其他家族成員互相聚合為同源、異源二聚體，在上游激活信號的作用下由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，進(jìn)而發(fā)揮促細(xì)胞增殖、遷移及血管生成等作用［15］。IκB-α 為NF-κB 的抑制蛋白，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，IκB-α 與NF-κB 相結(jié)合，并通過IκB-α 錨蛋白與位于NF-κB 上的核定位信號結(jié)合，遮蔽核定位信號使NF-κB 滯留于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈失活狀態(tài)，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生［16］。本研究結(jié)果表明，腫瘤最大徑≥4 cm、臨床分期Ⅲ/Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、脈管侵犯的HPV16 陽性宮頸癌患者癌組織中NF-κB P50 陽性表達(dá)率、IκB-α 陰性表達(dá)率高于腫瘤最大徑＜4 cm、臨床分期Ⅰ/Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/高分化、無脈管侵犯的HPV16 陽性宮頸癌患者。提示NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)與HPV16 陽性宮頸癌臨床病理特征存在一定的相關(guān)性。本研究中，Cox 回歸分析顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、NF-κB P50陽性表達(dá)、IκB-α 陰性表達(dá)均是HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。NF-κB P50 在正常宮頸組織中的表達(dá)水平較低，當(dāng)HPV16 感染宿主細(xì)胞，病毒蛋白可能通過破壞NF-κB 與抑癌基因信號通路的平衡，致使炎癥通路NF-κB 被異常激活，進(jìn)而導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生［17］；NF-κB 被激活后，NF-κB P50 與IκB-α 合成增加，并通過促進(jìn)NF-κB P50 表達(dá)，增加IκB-α 蛋白降解，使IκB-α 表達(dá)降低，進(jìn)而抑制NF-κB 活性，并調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［18］。截至隨訪結(jié)束，NF-κB P50 陽性、NF-κB P50 陰性的HPV16 陽性宮頸癌患者總存活率分別為73.68%、92.59%，NF-κB P50 陽性表達(dá)患者與NF-κB P50 陰性表達(dá)患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IκB-α 陽性、IκB-α 陰性的HPV16陽性宮頸癌患者總存活率分別為100.00%、76.34%，IκB-α 陽性表達(dá)患者與IκB-α 陰性表達(dá)患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示NF-κBP50、IκB-α 表達(dá)與HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后具有一定的相關(guān)性，檢測其表達(dá)情況對HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后評估具有重要參考價值。NF-κB 作為一種多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，可以同源或異源二聚體與IκB 抑制蛋白結(jié)合，在炎癥、免疫反應(yīng)等方面均發(fā)揮著重要作用，同時還可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖基因、抗凋亡基因的表達(dá)，而且被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)；NF-κB P50 作為NF-κB 家族的主要成員之一，可通過啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞增殖、凋亡，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［19］。IκB-α 與NF-κB家族結(jié)合為復(fù)制物，抑制NF-κB 活性，并可實(shí)現(xiàn)NF-κB 活化、失活的循環(huán)，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。Tan等［20］研究報道，NF-κB 呈非活化狀態(tài)時，在外來信號的刺激下，可經(jīng)特異性激酶使IκB-α 磷酸化，致使IκB-α 降解，游離二聚體移位至細(xì)胞核，并通過與靶基因啟動子κB 位點(diǎn)結(jié)合，對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

綜上所述，HPV16 陽性宮頸癌患者癌組織中NF-κB P50 陽性、IκB-α 陰性表達(dá)率較高，NF-κB P50、IκB-α 表達(dá)與HPV16 陽性宮頸癌臨床病理特征及預(yù)后均具有一定的相關(guān)性，對其表達(dá)情況進(jìn)行檢測對HPV16 陽性宮頸癌患者預(yù)后評估具有重要參考價值。