李方澤，萬(wàn)磊，趙磊，朱子衡，馬熙檬，李舒，胡賽賽，程靜，陳瑩瑩

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，安徽合肥 230031

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)損害的自身免疫性疾病[1-2]。目前治療RA的方法較為多樣，其中以托法替布為代表靶向合成改善病情抗風(fēng)濕藥（targeted synthesis of disease-modifying anti-rheumatic drugs，tsDMARDs）為當(dāng)今新一類治療RA的藥物，臨床療效顯著[3-4]。通過(guò)藥物精準(zhǔn)調(diào)控RA某些通路或關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而影響免疫炎癥反應(yīng)，緩解癥狀，是治療RA新的有效方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從分子網(wǎng)絡(luò)角度分析藥物、疾病與相關(guān)靶點(diǎn)及通路之間的聯(lián)系，為新的靶向藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)[5]。

雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.f.）和白芍（PaeonialactifloraPall）被廣泛應(yīng)用于治療RA[6]。雷公藤治療RA具有獨(dú)特的臨床療效，但其較大的毒副作用限制其臨床應(yīng)用[7]。白芍治療RA效果較雷公藤弱，經(jīng)常與有毒中藥配伍，發(fā)揮減毒功效[8-9]。雷公藤與白芍配伍既可增加療效，又可有效減少雷公藤對(duì)肝細(xì)胞的損傷[10-12]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析雷公藤配伍白芍治療RA可能的分子作用機(jī)制，并驗(yàn)證分析結(jié)果，為臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只（購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK 2005-02），平均體質(zhì)量（216.0±28.3）g，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7d。本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：AHUCM-rats-2021022）。

1.1.2 藥品與試劑 雷公藤、白芍購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房（生產(chǎn)單位：亳州市金方千草藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：5656851、564822411，規(guī)格：500g/袋），雷公藤甲素購(gòu)自Merck公司（貨號(hào)：T3652-1MG，純度≥98%）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-6、IL-17、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司（貨號(hào)：JYM0635Ra、JYM0647Ra、JYM0646Ra、JYM0480Ra）；弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（貨號(hào)：MB9887）；Western一抗二抗去除液購(gòu)自Beyotime公司（貨號(hào)：P0025）；β-肌動(dòng)蛋白購(gòu)自Zsbio公司（貨號(hào)：TA-09）；磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，p-PI3K）購(gòu)自Abcam公司（貨號(hào)：ab86714），磷酸化蛋白激酶B蛋白（phosphorylated AKT protein，p-AKT）購(gòu)自CST公司（貨號(hào)：4691S）。

1.1.3 儀器與數(shù)據(jù)庫(kù) 多功能酶標(biāo)儀（Molecular Decices公司，型號(hào)：spectra Max MZe）、轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司，型號(hào)：VE-186）、自動(dòng)曝光儀（上海培清科技有限公司，型號(hào)：JS-1070P）。使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）及DisGeNET、GeneCards、String、Metascape、PubChem、PDBe在線數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) ①雷公藤-白芍有效成分及作用靶點(diǎn)檢索：利用TCMSP，設(shè)置關(guān)鍵詞為“雷公藤”“白芍”，篩選條件為“口服生物利用度≥30%，類藥性指數(shù)≥0.18”，檢索雷公藤-白芍活性成分并預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)。②RA靶點(diǎn)檢索：以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，在DisGeNET和GeneCards收集RA靶點(diǎn)。③“雷公藤-白芍-活性成分-RA”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：通過(guò)R獲得共同作用靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“雷公藤-白芍-活性成分-RA”網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)計(jì)算度中心性（degree），獲取核心活性成分。④構(gòu)建共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選：利用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置物種為“H.sapiens”，最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為0.4，隱藏單獨(dú)節(jié)點(diǎn)。使用Cytoscape 3.9.1 CytoNCA插件，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各靶點(diǎn)中介中心性（betweenness，BC）、接近中心性（closeness，CC）、degree、特征向量中心性（eigenvector，EC），以大于各靶點(diǎn)BC、CC、EC、degree中位數(shù)為條件，連續(xù)篩選兩次，獲得核心靶點(diǎn)。⑤富集分析：利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，設(shè)置物種為“H.sapiens”，P<0.01。⑥分子對(duì)接：利用PubChem及PDBe數(shù)據(jù)庫(kù)，分別下載核心有效成分與核心靶點(diǎn)的分子結(jié)構(gòu)，采用AutoDock Tools及Pymol軟件對(duì)其進(jìn)行分子對(duì)接。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 ①藥物制備：雷公藤及白芍各10g加入10倍水量浸泡2h，煎煮2次，第一次30min，第二次40min，將兩次煎煮液混合均勻，室溫靜置30min，過(guò)濾并濃縮至生藥濃度為1g/ml，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂谠炷＜胺纸M干預(yù)：將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（normal control，NC）組10只，關(guān)節(jié)炎模型組30只；NC組大鼠不做處理；關(guān)節(jié)炎模型組大鼠使用0.1ml FCA于右后足跖皮內(nèi)進(jìn)行注射，復(fù)制為佐劑關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠模型，并于第12天在AA大鼠尾部注射0.05ml FCA加強(qiáng)免疫[13]。第15天將30只AA大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型（model control，MC）組、雷公藤-白芍（tripterygium wilfordii-white peony，TP）組及雷公藤甲素（triptolide，TPL）組，每組10只。第16天開(kāi)始給藥，每天1次，連續(xù)30d。TP組大鼠給予雷公藤-白芍湯劑濃縮液2.08g/kg灌胃，TPL組大鼠給予雷公藤甲素混懸液0.2mg/kg灌胃，NC組及MC組大鼠給予同體積生理鹽水灌胃。③ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子：采集用藥后第31天大鼠腹主動(dòng)脈血，離心取上層血清，根據(jù)說(shuō)明書(shū)利用ELISA試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-6、IL-17及IL-4含量。④蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）檢測(cè)p-PI3K、p-AKT：用蛋白提取試劑盒提取用藥后第31天大鼠滑膜總蛋白，進(jìn)行電泳分離，采用半干法使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）。在室溫下將p-PI3K、p-AKT抗體（1∶1000稀釋）和PVDF膜孵育2h。采用一抗、二抗孵育，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色并拍照，計(jì)算灰度值，以p-PI3K、p-AKT與β-肌動(dòng)蛋白的比值為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接

2.1.1 雷公藤-白芍有效成分及作用靶點(diǎn) 獲得有效成分雷公藤51個(gè)，白芍13個(gè)，共同有效成分61個(gè)。預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)雷公藤94個(gè)、白芍154個(gè)，共同作用靶點(diǎn)160個(gè)。

2.1.2 RA靶點(diǎn)檢索 利用DisGeNET與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)分別收集RA靶點(diǎn)2723個(gè)和4465個(gè)，去除重復(fù)項(xiàng)后獲得靶點(diǎn)5469個(gè)。

2.1.3 構(gòu)建“雷公藤-白芍-活性成分-RA”網(wǎng)絡(luò)及分析將160個(gè)共同作用靶點(diǎn)與5469個(gè)RA靶點(diǎn)利用R取交集，獲得113個(gè)共同靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 3.9.1構(gòu)建包括148個(gè)節(jié)點(diǎn)、353條邊的“雷公藤-白芍-活性成分-RA”網(wǎng)絡(luò)。利用degree值篩選排名前5位的核心活性成分，分別為山柰酚、雷公藤甲素、川陳皮素、β-谷甾醇和豆甾醇，可能為雷公藤-白芍治療RA的核心活性成分，見(jiàn)圖1、表1。

表1 雷公藤-白芍治療RA核心有效成分

圖1 中藥-有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn) String數(shù)據(jù)庫(kù)獲得擁有148個(gè)節(jié)點(diǎn)，353條相互作用連線的PPI網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape 3.9.1、CytoNCA插件獲得12個(gè)核心靶點(diǎn)，分別為TNF、IL-6、IL-4、IL-2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、過(guò)氧化物酶體增生激活受體（peroxisome proliferative activated receptor，PPARG）、CXC趨化因子配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、細(xì)胞腫瘤蛋白P53（cellular tumor antigen p53，TP53）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP9），以上可能是雷公藤-白芍治療RA的核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)

2.1.5 富集分析 獲得1678條基因本體（gene ontology，GO）富集結(jié)果，其中GO生物過(guò)程（biological process，BP）1461條，包括炎癥應(yīng)答、細(xì)胞激活等；GO分子功能（molecular function，MF）151條，包括脂肽結(jié)合、蛋白酶結(jié)合等；GO細(xì)胞組分（cellular component，CC）66條，包括核膜、微絨毛等；富集分析獲得信號(hào)通路191條，包括PI3K/AKT信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路（TNF signaling-pathway）等，可能為雷公藤-白芍治療RA的關(guān)鍵信號(hào)通路，見(jiàn)圖3。

圖3 GO和KEGG富集分析

2.1.6 分子對(duì)接 除川陳皮素及IL-2外，其余關(guān)鍵有效成分與核心靶點(diǎn)均可穩(wěn)定結(jié)合，最低結(jié)合能均<-5kcal/mol，關(guān)鍵有效成分與核心靶點(diǎn)之間可形成多條化學(xué)鍵，空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，見(jiàn)表2、圖4。

表2 分子對(duì)接結(jié)合能（kcal/mol）

圖4 分子對(duì)接模式圖

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 雷公藤-白芍對(duì)AA大鼠血清細(xì)胞因子的影響 與NC組大鼠相比，MC組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-17顯著升高，IL-4顯著降低（P<0.05）；與MC組大鼠相比，TP組與TPL組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-17均顯著降低，IL-4顯著升高（P<0.05）；與TPL組大鼠相比，TP組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-17顯著降低，IL-4顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠的細(xì)胞因子比較（±s，pg/ml，n=10）

表3 各組大鼠的細(xì)胞因子比較（±s，pg/ml，n=10）

注：與NC組比較，*P<0.05，與MC組比較，#P<0.05；與TPL組比較，ΔP<0.05

組別 TNF-α IL-4 IL-6 IL-17 NC組 36.30±2.85 9.39±0.87 26.59±2.93 30.94±2.954 MC組 188.33±23.67* 3.11±0.31* 83.64±5.71 93.43±5.89 TP組 78.71±6.39*#Δ 6.01±0.52*#Δ 40.87±6.37*#Δ 40.08±4.31*#Δ TPL組 103.42±8.38*# 4.62±0.42*# 61.41±6.88 52.91±3.12

2.2.2 雷公藤-白芍對(duì)AA大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)的影響 與NC組大鼠比較，MC組大鼠的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與MC組大鼠比較，TP組和TPL組大鼠的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與TPL組大鼠比較，TP組大鼠的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），見(jiàn)表4和圖5。

表4 各組大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)的比較（±s，n=10）

表4 各組大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)的比較（±s，n=10）

注：與NC組比較，*P<0.05；與MC組比較，#P<0.05；與TPL組比較，ΔP<0.05

組別 p-PI3K p-AKT NC組 0.22±0.01 0.47±0.02 MC組 0.73±0.02* 0.91±0.01*TP組 0.37±0.01*#Δ 0.61±0.04*#Δ TPL組 0.62±0.01*# 0.82±0.01*#

圖5 各組大鼠滑膜組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)

3 討論

RA的特點(diǎn)是免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子作用于機(jī)體，激活破骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及免疫復(fù)合物介導(dǎo)的補(bǔ)體等，導(dǎo)致細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生慢性炎癥[14]。因此，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、減少促炎因子分泌、減輕關(guān)節(jié)滑膜炎癥是治療RA的關(guān)鍵。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明，雷公藤-白芍所含成分復(fù)雜，可通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑治療RA。核心有效成分有抗炎和調(diào)節(jié)免疫等作用，對(duì)細(xì)胞因子及骨代謝平衡有調(diào)控作用[15-18]。TNF-α可作用于多條信號(hào)通路，調(diào)控IL-6和IL-4的分泌[19]；IL-4可通過(guò)抑制Th1介導(dǎo)的促炎作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化和活性，預(yù)防關(guān)節(jié)損傷和骨侵蝕，改善關(guān)節(jié)炎，促進(jìn)組織修復(fù)[20]；IL-6可降低機(jī)體區(qū)分自我和非我的能力，刺激Th17途徑，導(dǎo)致纖維化和炎癥反應(yīng)[21]。異常活化的PI3K/AKT信號(hào)通路可影響巨噬細(xì)胞極化，增加抗凋亡基因在滑膜細(xì)胞的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌紊亂，滑膜纖維細(xì)胞過(guò)度增生[22-24]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，通過(guò)雷公藤-白芍治療后可明顯降低TNF-α、IL-6、IL-17及p-PI3K、p-AKT的表達(dá)，顯著增加IL-4的分泌，表明雷公藤-白芍可有效抑制RA中的PI3K/AKT信號(hào)通路的過(guò)表達(dá)，恢復(fù)免疫平衡。

綜上，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)雷公藤-白芍可通過(guò)多種有效成分影響多條信號(hào)通路和作用靶點(diǎn)，對(duì)RA產(chǎn)生治療作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，雷公藤聯(lián)合白芍可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路干預(yù)下游相關(guān)細(xì)胞因子，對(duì)AA大鼠產(chǎn)生治療作用，為雷公藤聯(lián)合白芍治療RA提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。