劉佳偉，劉春玲，仵紅嬌，宋琴琴，劉沖，董靜，呂瀾，張雪梅，張志

1.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063210；2.唐山市工人醫(yī)院腫瘤科，河北唐山 063000；3.唐山市人民醫(yī)院病理科，河北唐山 063001；4.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山 063210

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，早期診斷困難、轉(zhuǎn)移迅速及缺乏有效治療手段使其成為全球癌癥死亡的第七大主要原因[1]。在我國，胰腺癌負(fù)擔(dān)逐年增加，年死亡率幾乎與發(fā)病率相當(dāng)[2]。

補體系統(tǒng)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，保護宿主細(xì)胞免受病原微生物和受損細(xì)胞的侵害[3]。CD59是糖基磷脂酰肌醇錨定的補體調(diào)節(jié)蛋白，通過抑制攻膜復(fù)合物的形成調(diào)節(jié)補體活化，保護宿主細(xì)胞免受補體攻擊[4]。既往研究表明，CD59在多種實體瘤中高表達(dá)，并幫助腫瘤細(xì)胞逃避補體的監(jiān)視[5]。目前CD59在胰腺癌中研究較少，作用機制尚不明確。本研究通過生物信息學(xué)分析CD59在胰腺癌中的表達(dá)及其對胰腺癌患者預(yù)后的影響，為CD59作為胰腺癌的臨床診斷指標(biāo)和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物提供線索和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

1.1.1 GEPIA2數(shù)據(jù)庫 基因表達(dá)譜交互分析2（gene expression profiling interactive analysis 2，GEPIA2）數(shù)據(jù)庫用于探究CD59在胰腺癌及癌旁組織的mRNA表達(dá)差異及對胰腺癌不同病理分期的影響。篩選條件設(shè)置：|Log2FC| Cutoff: 1和q-value Cutoff: 0.01。

1.1.2 HPA數(shù)據(jù)庫 人類蛋白組圖譜數(shù)據(jù)庫（human protein atlas，HPA）用于探究CD59在胰腺癌及正常胰腺組織中的蛋白表達(dá)差異。利用“Tissue”模塊獲取CD59在正常胰腺組織中的表達(dá)情況，利用“Pathology”模塊獲取其在胰腺癌組織中的表達(dá)情況。

1.1.3 TIMER2.0數(shù)據(jù)庫 利用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫“Immune Association”下的“Gene”模塊分析CD59表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系。

1.1.4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫 卡普蘭邁爾（Kaplan-Meier plotter）數(shù)據(jù)庫用于分析CD59表達(dá)水平對胰腺癌患者總生存期（overall survival，OS）和無復(fù)發(fā)生存期（recurrence free survival，RFS）的影響。

1.1.5 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) String數(shù)據(jù)庫旨在整合蛋白質(zhì)之間所有已知和預(yù)測的關(guān)聯(lián)，包括物理相互作用和功能關(guān)聯(lián)。將篩選條件設(shè)為“full STRING network”，將所需分?jǐn)?shù)設(shè)為“medium confidence(0.400)”，將“size cutoff”設(shè)為“no more than 50 interactors”，得到CD59的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI），利用Cytoscape3.9.1的“Analyze Network”篩選重要節(jié)點。

1.1.6 GO富集分析和KEGG通路分析 DAVID6.8是為基因提供全面功能注釋的工具，用以了解大量基因背后的生物學(xué)含義。本研究將CD59及50個相關(guān)互作分子輸入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，CD59基因表達(dá)的差異比較采用t檢驗；CD59表達(dá)對胰腺癌患者生存影響的比較采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗方法；采用Pearson相關(guān)性檢驗篩選與CD59具有相關(guān)性的基因。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD59在胰腺癌中高表達(dá)

GEPIA2數(shù)據(jù)庫顯示，與癌旁正常組織相比，CD59在彌漫大B淋巴瘤、膠質(zhì)瘤、胰腺癌、皮膚黑色素瘤和胸腺癌中的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），見圖1A。179例胰腺癌樣本中CD59的mRNA表達(dá)水平顯著高于171例正常胰腺樣本（P<0.05），見圖1B。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中CD59的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常胰腺組織，CD59在胰腺癌組織的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中高表達(dá)，見圖1C。CD59表達(dá)量對胰腺癌患者的疾病分期無影響（P＞0.05），見圖2。

圖2 CD59在不同分期胰腺癌中的表達(dá)水平

2.2 CD59表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤的數(shù)量和活性影響癌癥患者的預(yù)后[6]。TIMER2.0數(shù)據(jù)庫顯示，CD59表達(dá)與純度無關(guān)（P>0.05），與CD8+T細(xì)胞（partial.Cor=0.358，P<0.001）、CD4+T細(xì)胞（partial.Cor=0.061，P=0.431）、中性粒細(xì)胞（partial.Cor=0.307，P<0.001）及樹突狀細(xì)胞（partial.Cor=0.283，P<0.001）浸潤呈正相關(guān)，見圖3。

圖3 CD59與胰腺癌免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

2.3 CD59表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示，CD59高表達(dá)患者的OS和RFS均短于低表達(dá)患者（HR=2.30，95%CI：1.52～3.50，P<0.001；HR=4.31，95%CI：1.57～11.83，P<0.001），見圖4。

圖4 CD59表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系分析

2.4 構(gòu)建CD59共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及功能富集分析

利用String數(shù)據(jù)庫得到50個CD59相關(guān)蛋白，采用Cytoscape3.9.1進一步分析發(fā)現(xiàn)與CD59關(guān)系最為密切的蛋白是CD55、順式高爾基質(zhì)蛋白（cis-Golgi matrix protein，GOLGA2）、甘露糖結(jié)合凝集素1（mannose-binding lectin，LMAN1）、跨膜Emp24結(jié)構(gòu)域運輸?shù)鞍?（transmembrane p24 trafficking protein 2，TMED2）和Serpin肽酶抑制劑進化枝A成員1（serpin family A member 1，SERPINA1）。利用DAVIA6.8在線數(shù)據(jù)庫對CD59及其相互作用蛋白進行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，CD59及其共表達(dá)基因主要參與補體激活（經(jīng)典途徑）、先天免疫反應(yīng)等生物途徑，見表1。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，CD59及其共表達(dá)基因主要富集于補體和凝血級聯(lián)通路、冠狀病毒-COVID-19通路等，見表2。

表1 GO通路富集分析

表2 KEGG通路富集分析

3 討論

胰腺癌早期癥狀隱匿，80%～85%的患者確診時已處于晚期，傳統(tǒng)的化療效果差，5年生存率約2%～9%[7]。目前，臨床上尚缺乏針對胰腺癌敏感的早期診斷指標(biāo)和有效的治療靶點。因此，尋找胰腺癌的新治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物對臨床治療意義重大。

CD59是膜結(jié)合補體調(diào)節(jié)蛋白（membrane complement regulatory proteins，mCRPs）家族成員，主要參與調(diào)控補體系統(tǒng)的激活[4]。有研究表明，CD59促進乳腺癌腫瘤生長并預(yù)測不良預(yù)后[5]。CD59在結(jié)腸癌中高表達(dá)且與結(jié)腸癌的分化和TNM分期具有臨床相關(guān)性[8-9]。此外，CD59對卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞也發(fā)揮同樣的保護作用[10-11]。本研究通過生物信息學(xué)分析探究CD59基因在胰腺癌中的表達(dá)水平及預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)CD59在胰腺癌組織中高表達(dá)，而與疾病分期無關(guān)，這表明CD59可能誘導(dǎo)胰腺癌的發(fā)生。TIMER2.0數(shù)據(jù)庫表明，CD59表達(dá)水平與多種腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示，CD59高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后更差，這表明CD59在胰腺癌中可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤來保護胰腺癌細(xì)胞免受補體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，導(dǎo)致胰腺癌患者的預(yù)后更差[12]。這一發(fā)現(xiàn)有望為胰腺癌的免疫治療提供新的策略。

String數(shù)據(jù)庫及Cytoscape3.9.1分析顯示，CD59與CD55、GOLGA2、LMAN1、TMED2、SERPINA1等分子存在相互作用。CD55與CD59同屬mCRPs家族，通過調(diào)控補體活化促進腫瘤發(fā)生[13]。GOLGA2在蛋白質(zhì)的糖基化和轉(zhuǎn)運中起重要作用，下調(diào)可抑制腫瘤的發(fā)生[14]。LMAN1介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體糖基化蛋白的轉(zhuǎn)運，在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮促癌作用[15]。TMED2負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的蛋白質(zhì)，其表達(dá)增加可作為乳腺癌和頭頸部鱗癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)[16-17]。SERPINA1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，是評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的準(zhǔn)確生物標(biāo)志物[18]。其中CD55作為聯(lián)系最緊密的節(jié)點，已被證實與胰腺癌相關(guān)[19]。

通過對CD59的共表達(dá)基因進行功能分析，對其發(fā)揮作用的機制進行初步探究。CD59作為補體調(diào)節(jié)劑，在腫瘤中過度表達(dá)，有助于腫瘤細(xì)胞發(fā)生無限增殖、抵抗凋亡，發(fā)生免疫逃逸[20]。GO和KEGG富集分析顯示，CD59的共表達(dá)基因主要參與補體激活調(diào)控等生物途徑，這與既往的認(rèn)識一致。

綜上所述，CD59在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，且高表達(dá)組胰腺癌患者對應(yīng)的預(yù)后更差。此外，CD59表達(dá)與多種免疫細(xì)胞浸潤水平呈正相關(guān)。因此，CD59可作為胰腺癌患者預(yù)后評估的新指標(biāo)，本研究為胰腺癌的早期診斷、靶向治療和更深入的機制探索提供初步的理論依據(jù)。