朱冰玉，吳穎芳

1.寧波大學附屬人民醫(yī)院口腔科，浙江寧波 315040；2.中南大學湘雅醫(yī)院口腔科，湖南長沙 410008

口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis，OSF）是一種發(fā)生于口腔黏膜的慢性、潛在惡性疾病[1]。OSF常表現(xiàn)為口干、進食刺激性食物有燒灼感、進行性張口受限等，嚴重影響患者的生活質量；其主要病理改變?yōu)樯掀そM織萎縮、固有層膠原纖維的異常堆積和固有層血管閉塞、減少[2]。盡管OSF主要是成纖維細胞疾病，但上皮位于黏膜的最表面，檳榔粗糙纖維的機械摩擦及多種化學成分首先作用于口腔黏膜的上皮組織，因此上皮的變化對OSF的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。

自噬與凋亡是細胞程序性死亡的兩種方式，對維持細胞代謝和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。自噬既可通過降解異常的胞質和細胞器為細胞提供氨基酸和能量拮抗凋亡，也可協(xié)同凋亡促進細胞的死亡，或作為凋亡的備份機制誘導細胞死亡[3-4]。Zhao等[5]證實，自噬通過減少肺泡上皮細胞的凋亡減輕二氧化硅誘導的肺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)腎間質纖維化中，轉化生長因子β1可通過活性氧簇激活自噬，加重腎小管上皮細胞的凋亡[6]。但在OSF病程進展中上皮組織自噬、凋亡的發(fā)生情況及相互關系目前尚無相關研究。本研究采用免疫組織化學染色法檢測自噬標志物蛋白LC3、P62與凋亡相關蛋白caspase-3在正常口腔黏膜與OSF早、中、晚期上皮組織中的表達水平，并分析OSF上皮組織中3種蛋白與臨床因素的相關性，為進一步探討OSF的發(fā)病機制和治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016-2019年于中南大學湘雅醫(yī)院口腔科行組織病理活檢的90例OSF患者的頰黏膜標本，根據(jù)《口腔黏膜病學》分為早、中、晚期各30例，分別為OSF早期組、OSF中期組、OSF晚期組[7]。同期收集30名無口腔黏膜疾病的健康者作為對照組。納入標準：①年齡23～66歲；②無系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病，無長期用藥史；③OSF患者未經(jīng)特殊治療且不伴其他口腔黏膜病。排除標準：①年齡<18歲；②有OSF治療史；③患有其他口腔黏膜疾病者?；颊呔炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)中南大學湘雅醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過（倫理審批號：201609053）。

1.2 主要試劑

LC3抗體（1∶50，美國CST公司）、caspase-3抗體（1∶50，美國CST公司）、P62抗體（1∶50，美國proteintech公司）、DAB顯色試劑盒、二步法免疫組化試劑盒。

1.3 方法

將收集的組織標本固定于10%福爾馬林中，常規(guī)石蠟包埋切片，切片脫蠟至水，微波加熱抗原修復，3% H2O2室溫孵育10min。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，孵育一抗、二抗，PBS沖洗，DAB顯色。采用蒸餾水洗滌，蘇木精復染，蒸餾水沖洗，PBS返藍。不同濃度乙醇（60%～100%）脫水，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。已知的陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷

采用雙盲法，每張切片隨機選取5個視野（400倍），通過染色程度（未染色計0分；淡黃色計1分；黃色計2分；棕黃色計3分）和陽性細胞的比例（無陽性細胞計0分；陽性細胞<10%計1分；陽性細胞10%～50%計2分；陽性細胞50%～75%計3分；陽性細胞>75%計4分）進行分析。最后將染色程度與陽性細胞的比例得分相乘，結果<3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗，相關性采用Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 上皮細胞層厚度的比較

分析比較對照組健康者的口腔黏膜和OSF患者的上皮細胞層厚度（epithelial cell layer thickness，ET）。結果顯示與對照組健康者比較，OSF患者的ET顯著降低，且OSF晚期組患者的平均ET值最低。OSF早期組、OSF中期組、OSF晚期組患者的ET值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。所有OSF標本中未發(fā)現(xiàn)上皮異常增生。

表1 對照組健康者和OSF患者的ET比較（±s）

表1 對照組健康者和OSF患者的ET比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與OSF早期組比較，＃P<0.001；與OSF中期組比較，ΔP<0.001

組別 對照組（n=30） OSF早期組（n=30） OSF中期組（n=30） OSF晚期組（n=30） 上皮細胞層厚度（層） t P27.3±2.9 24.6±3.3 3.458 <0.05*17.3±2.5 9.755 <0.001＃12.1±3.2 6.895 <0.001Δ

2.2 LC3、P62和caspase-3蛋白在各組中的表達比較

LC3和caspase-3主要在細胞質、細胞核和細胞膜中表達，呈棕黃色或淺黃色；在正?？谇火つぶ兄饕诮腔瘜?、顆粒層和棘層上部表達，基底層幾乎不表達，而在OSF中期和晚期患者的整個上皮組織中都有表達，見圖1和圖2。OSF患者的上皮組織中LC3和caspase-3的蛋白表達水平顯著高于健康者（P<0.001）；OSF早期組、OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中LC3和caspase-3的蛋白表達水平呈遞增趨勢，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。P62主要在細胞質與細胞核中表達，呈棕黃色或淺黃色。在正常黏膜整個上皮組織細胞中均有染色，在OSF中、晚期主要在上皮中的基底層至棘層表達，角化層的表達較少，見圖3。OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中P62的蛋白表達水平顯著低于對照組（P<0.05）；OSF早期組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；OSF早期組、OSF中期組和OSF晚期組患者的上皮組織中P62的蛋白表達水平呈遞減趨勢，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

圖1 LC3在正常口腔黏膜及OSF上皮組織中的表達（SP×400）

圖2 caspase-3在正常黏膜及OSF上皮組織中的表達（SP×400）

圖3 P62在正常黏膜及OSF上皮組織中的表達（SP×400）

表2 LC3、P62和caspase-3蛋白在各組中的表達情況比較[n（%）]

2.3 OSF上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達的相關性分析

LC3與caspase-3的表達呈正相關（r=0.320，P<0.05）；P62和caspase-3的表達呈負相關（r=-0.554，P<0.001）；LC3和P62的表達呈負相關（r=-0.710，P<0.001），見表3。

表3 LC3、P62和caspase-3蛋白在OSF上皮組織中的相關性分析[n（%），n=90]

2.4 OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達與臨床因素的關系分析

OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達在不同性別、年齡、吸煙因素的比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。LC3、P62和caspase-3蛋白表達在張口度>3cm、2～3cm及<2cm中的差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4。

表4 LC3、P62和caspase-3蛋白的表達與臨床因素的關系分析[n（%），n=90]

3 討論

OSF具有很高的癌變潛能，研究顯示OSF的惡性轉化率達6%[8]。近年來有研究者認為上皮組織是OSF發(fā)生的起點，上皮屏障受損，細胞釋放炎癥因子，促進黏膜下層成纖維細胞異常活化，膠原蛋白的合成和分泌增加[9]。堆積的膠原纖維和阻塞的血管，加劇上皮層缺血、缺氧的情況，造成營養(yǎng)供給障礙，形成惡性循環(huán)[10]。本研究證實與正?？谇火つそM織相比，OSF患者的口腔上皮組織變薄。

凋亡通過清除衰老或異常細胞在機體中發(fā)揮維持細胞功能的關鍵作用[11]。caspase蛋白酶家族在凋亡中起至關重要的作用，激活的caspase切割多種底物，引發(fā)一系列的級聯(lián)反應進而導致細胞核DNA斷裂、細胞質收縮和細胞膜破裂等[12]。caspase-3是caspase家族中的重要成員之一，在細胞凋亡調(diào)控中一旦被激活，凋亡便進入不可逆的階段[13]。本研究發(fā)現(xiàn)OSF患者上皮組織中caspase-3的表達水平顯著高于對照組健康者，且隨著OSF的加重呈遞增趨勢。Li等[14]研究表明，檳榔堿誘導的上皮細胞凋亡與caspase-3的激活有關。因此，筆者推測在上皮細胞中，檳榔堿的細胞毒性可能導致細胞凋亡增加。這種凋亡增加可能導致上皮細胞數(shù)量減少，從而引起上皮組織萎縮。

自噬是細胞通過吞噬降解自身蛋白質或細胞器的自我調(diào)節(jié)過程[15]。LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺的結合是自噬過程中的一個重要步驟，該結合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ被定位在自噬體的內(nèi)外膜上，從而發(fā)揮關鍵作用[16]。P62作為自噬標志物蛋白與LC3在自噬體膜上結合，然后傳遞到自噬體中，在隨后形成的自噬溶酶體中降解[17]。因此，本研究聯(lián)合檢測LC3和P62的表達，發(fā)現(xiàn)OSF患者的LC3表達增加且P62的表達降低，提示OSF上皮組織中自噬活性增強，且與OSF的病理階段顯著相關。

自噬和凋亡是細胞程序性死亡的兩種方式，二者既可相互拮抗促進細胞存活，也可相互協(xié)同共同促進細胞死亡。正常生理情況下，自噬一般處于基礎水平，將受損及衰老的細胞器及蛋白質降解再次循環(huán)利用以平衡細胞穩(wěn)定。本研究顯示OSF早、中、晚期患者出現(xiàn)自噬增強的情況，可能是上皮細胞受損，破壞細胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器，激活自噬溶酶體途徑，且隨著OSF的進展自噬活性逐漸增加；在上皮組織中，角化層、顆粒層和棘層是LC3的主要表達區(qū)域，而P62主要在上皮中基底層至棘層表達，這可能是該層次位于上皮組織的外層，承受來自外界環(huán)境的機械摩擦和檳榔堿等化學刺激的影響，導致上皮角化層至棘層上部的細胞自噬活性增強。本研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關蛋白caspase-3與自噬活性表達呈正相關，且隨著OSF加重，上升越明顯。筆者推測自噬和凋亡在OSF病變進程中均發(fā)揮重要作用，并可能存在協(xié)同作用。在中期和晚期的OSF患者的口腔黏膜中，檳榔的長期暴露可導致外層上皮細胞內(nèi)環(huán)境的改變，從而引發(fā)一系列細胞反應，包括自噬活性的增加和細胞凋亡的顯著增加。

通過相關因素分析，OSF患者的上皮組織中LC3、P62和caspase-3蛋白表達在不同性別、年齡、吸煙因素的差異均無統(tǒng)計學意義，在張口度的差異有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，自噬標志物蛋白LC3、P62與凋亡相關蛋白caspase-3異常表達在OSF的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，確切的機制有待進一步研究。LC3、P62和caspase-3聯(lián)合檢測可為進一步探討OSF上皮萎縮的發(fā)病機制和治療方法提供一定的理論依據(jù)。