吳偉杰,丁雯瑾,楊蕊旭,范建高

Notch信號通路是高度保守的單次跨膜信號受體蛋白家族,包括四個(gè)受體(Notch1/2/3/4)和五個(gè)配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)及靶基因編碼轉(zhuǎn)錄因子(Hes1和Hey1),涉及多種組織和器官早期發(fā)育所必需的細(xì)胞間調(diào)節(jié),在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[1、2]。近幾年,有研究報(bào)道Notch 信號的活化參與肝臟再生與修復(fù)、炎癥和纖維化過程[3]。此外,Notch 基因異常表達(dá)會導(dǎo)致胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、脂質(zhì)異常和肥胖等多種代謝性疾病,它也能誘發(fā)非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)生[4,5]。我們之前的研究證實(shí),無論是在蛋氨酸膽堿缺乏(methionine-choline deficient,MCD)小鼠模型還是棕櫚酸(palmitic acid,PA)誘導(dǎo)體內(nèi)肝細(xì)胞脂肪變模型,均存在Notch基因家族的異常表達(dá),并隨代謝障礙相關(guān)脂肪性肝病(metabolic dysfunction-associated fatty liver disease,MAFLD)不同發(fā)展階段而改變[6]。隨后,我們應(yīng)用Notch信號通路抑制劑(DAPT)體外處理脂肪變肝細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)DAPT能抑制Notch下游 Hes-1和 Hey-1基因水平,同時(shí)能有效降低甘油三酯(triglyceride,TG)和轉(zhuǎn)氨酶水平[7]。本研究在體外應(yīng)用DAPT處理脂肪變的L02細(xì)胞,觀察了抑制Notch家族后細(xì)胞炎癥因子和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因水平變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人正常肝細(xì)胞L02由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供;RPMI-1640 培養(yǎng)基和杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco's phosphate buffered saline,DPBS)均購于美國Hyclone 公司;胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)購于以色列Biological Industries 公司;γ分泌酶抑制劑N-[N-( 3,5-difluorophenacetyl) - L - alnyl]-S-phenylycine t- butyl ester(DAPT)和PA均購于美國默克公司;RPS-18內(nèi)參引物購于中國上海生物工程公司;Trizol 試劑和預(yù)混型定量用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于日本寶日醫(yī)公司;qPCR SYBR Green Master Mix 購于中國上海翊圣生物科技有限公司;CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(強(qiáng))和含DAPI的抗熒光淬滅封片劑均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;尼羅紅染料購于上海晶純生化科技股份有限公司;抗GAPDH小鼠單克隆抗體購于美國Proteintech Group 公司;抗固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein 1c,SREBP1c)小鼠單克隆抗體購于美國NOVUS 公司;抗p65(NF-kappaB,NF-κB)兔單克隆抗體購于美國Abcam公司;ECL發(fā)光液購于美國Millipore 公司;凝膠成像儀(美國Bio-Rad 公司);Q3 PCR 擴(kuò)增儀和Nano Drop 2000 超微量分光光度儀(美國賽默飛公司);PCR 逆轉(zhuǎn)錄儀(德國艾本德公司);Bio Tek Epoch 全波長酶標(biāo)儀(美國博騰儀器有限公司)。

1.2 體外細(xì)胞脂肪變模型的建立與DAPT干預(yù) 將5 mM PA原液用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS)稀釋成含0.1 mM、0.25 mM和0.5 mM PA的高脂培養(yǎng)基工作液、備用。取L02細(xì)胞,分為對照組(Con)、0.1 mM PA組、0.25 mM PA組和0.5 mM PA組。待L02細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí),棄培養(yǎng)基,用DPBS洗1遍,加入培養(yǎng)基或相應(yīng)濃度的高脂培養(yǎng)基工作液處理L02細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定0.25 mM PA濃度作為體外細(xì)胞脂肪變的造模條件,分含或不含0.25 mM PA處理細(xì)胞。采用0μM、1μM、2μM、5μM和10 μM DAPT處理細(xì)胞,其中0.25 mM PA處理細(xì)胞在不加DAPT處理組為模型組,處理L02細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞存活率試驗(yàn) 使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞存活率測定。

1.4 細(xì)胞mRNA提取及水平檢測 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR),基因特異性引物序列為：SREBP1c-F： 5’-CGGAACCATCTTGGCAACAGT-3’; SREBP1c-R： 5’-CGCTTCTCAATGGCGTTGT-3’; FASN-F： 5’-CCGAGACACTCGTGGGCTA-3’; FASN-R： 5’-CTTCAGCAGGACATTGATGCC-3’; ACACA-F： 5’-ATGTCTGGCTTGCACCTAGTA-3’; ACACA-R： 5’-CCCCAAAGCGAGTAACAAATTCT-3’; TNF-α-F： 5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3’; TNF-α-R： 5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3’; IL-1β-F： 5’-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3’; IL-1β-R： 5’-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3’; IL-6-F： 5’-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3’; IL-6-R： 5’-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3’。

1.5 細(xì)胞p65及SREBP1蛋白檢測 采用Western blot法,用RIPA裂解法提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白濃度,調(diào)節(jié)上樣蛋白總量至相同。根據(jù)目的蛋白分子大小配制合適的SDS PAGE凝膠后開始上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂牛奶封閉,按照抗體說明書相繼加入一抗和二抗孵育后,經(jīng)凝膠成像儀曝光成像,應(yīng)用Image J軟件對條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。

1.6 細(xì)胞脂滴觀察 在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入不同濃度的DAPT干預(yù)PA處理的L02細(xì)胞24 h,棄培養(yǎng)基,用DPBS洗2遍,加入4%多聚甲醛固定15～30 min,用DPBS洗2遍。按照尼羅紅原液：DPBS=1：500的比例配制工作液,避光染色15 min,棄去尼羅紅染色工作液,用DPBS洗2遍。在每孔中加入含DAPI的抗熒光淬滅封片液100 μL,置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組L02細(xì)胞存活率比較 在PA干預(yù)L02細(xì)胞8 h、16 h和24 h,經(jīng)CCK-8測定顯示, L02細(xì)胞存活率隨干預(yù)時(shí)間呈劑量依賴性下降趨勢;與對照組細(xì)胞存活率為100%比,在干預(yù)8 h、16 h和24 h時(shí),0.1 mM、0.25 mM和0.5 mM PA干預(yù)L02細(xì)胞存活率均顯著下降(P均<0.05,圖1A);在無PA干預(yù)的L02細(xì)胞,經(jīng)1μM、2μM、5μM和10 μM DAPT處理細(xì)胞24 h,細(xì)胞存活率均較對照組顯著下降(分別為85.2±5.3%、84.6±2.9%、84.4±6.0%和84.5±3.2%對100.0%,P均<0.05,圖1B)。

2.2 不同濃度DAPT干預(yù)PA處理細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平和p65蛋白表達(dá)變化 與模型(0 μM DAPT處理)組比,各DAPT處理組TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平均顯著下調(diào)(P均<0.05,表1);與0 μM DAPT處理組比,各DAPT處理組細(xì)胞p65蛋白均顯著下調(diào)(P均<0.05,圖2A、2B)。

表1 不同濃度DAPT干預(yù)PA處理細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平比較

圖1 不同濃度PA和DAPT干預(yù)L02細(xì)胞存活率比較A：不同濃度的PA處理L02細(xì)胞;B：不同濃度的DAPT處理L02細(xì)胞24 h; *P<0.05

圖2 不同濃度DAPT干預(yù)PA處理細(xì)胞p65蛋白表達(dá)變化A：細(xì)胞p65蛋白表達(dá)(Western blot法);B：p65蛋白表達(dá)相對水平;*P<0.05;**P<0.01

2.3 不同濃度DAPT干預(yù)PA處理細(xì)胞脂質(zhì)代謝水平變化 與0 μM DAPT組相比,各DAPT處理組細(xì)胞SREBP1c mRNA水平均無顯著變化,在2μM、5μM和10 μM DAPT處理組細(xì)胞FASN和ACACAmRNA水平均顯著下降(P均<0.001,表2);在2μM、5μM和10 μM DAPT處理組,細(xì)胞脂滴紅色熒光強(qiáng)度較0 μM DAPT組顯著減弱[分別為(0.2±0.1)、(0.3±0.0)和(0.1±0.0)對(0.7±0.0),P均<0.001,圖3A);與0 μM DAPT組相比,5 10 μM和10 μM DAPT處理組細(xì)胞SREBP1c蛋白水平均顯著下調(diào)(P均<0.05, 圖3B和3C)。

圖3 不同濃度DAPT干預(yù)PA處理細(xì)胞脂質(zhì)代謝變化A：細(xì)胞脂滴形成情況(尼羅紅染色, 400×);B：細(xì)胞SREBP1c蛋白表達(dá)(Western blot法);C：細(xì)胞SREBP1c蛋白表達(dá)相對水平;*P<0.05;**P<0.01

表2 不同濃度DAPT干預(yù)PA處理細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA水平比較

3 討論

Notch 基因的激活不僅與異常增殖、癌癥疾病發(fā)生密切相關(guān),也在細(xì)胞代謝過程中起著重要作用,其表達(dá)紊亂會導(dǎo)致多種代謝相關(guān)性疾病[8,9]。通常,MAFLD伴隨代謝綜合征的出現(xiàn),目前普遍被認(rèn)可的是“多次打擊”學(xué)說,胰島素抵抗、脂質(zhì)過氧化、氧化應(yīng)激等均參與其發(fā)病。在小鼠肝臟病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞特異性Notch功能喪失可緩解脂肪性肝炎相關(guān)肝纖維化,而增強(qiáng)Notch在肝細(xì)胞中的表達(dá)會通過上調(diào)Sox9依賴性骨橋蛋白,激活肝星狀細(xì)胞并誘導(dǎo)肝臟纖維化[10]。也有研究使用Notch抑制劑可改善動(dòng)物因高脂高糖飲食而導(dǎo)致的肝纖維化[11]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及我們團(tuán)隊(duì)先前的研究結(jié)果,有足夠的證據(jù)表明Notch家族參與了MAFLD的發(fā)生和進(jìn)展[6]。

長期高脂飲食可以導(dǎo)致高脂血癥、異位脂質(zhì)沉積,過量的脂質(zhì)沉積在肝細(xì)胞內(nèi)而引起肝臟損傷,最后形成MAFLD[12]。有研究發(fā)現(xiàn)Notch在肝臟脂代謝過程中扮演重要角色。Notch1信號活化可以導(dǎo)致胰島素抵抗加重,并與FOXO1協(xié)同增強(qiáng)葡萄糖-6-磷酸酶表達(dá)[13,14]。Notch信號可以激活mTOR信號通路,促使其下游SREBP1c表達(dá),促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪生成。抑制Notch基因能通過降低mTOR的穩(wěn)定性,弱化下游激酶核糖體蛋白S6激酶1活化,減緩SREBP1c依賴的脂肪從頭合成,達(dá)到改善肝脂肪沉積的目的[15,16]。我們采用0.25 mM PA濃度干預(yù)L02細(xì)胞24 h成功構(gòu)建體外細(xì)胞脂肪變模型,并可顯著引起細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積和穩(wěn)定激活Notch信號通路[7]。在體外肝細(xì)胞脂肪變細(xì)胞,以“不影響細(xì)胞活性”為基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)DAPT能緩解細(xì)胞炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平上升并下調(diào)p65蛋白表達(dá),改善程度與DAPT濃度有一定的劑量依賴性。尼羅紅染色可觀察到細(xì)胞脂滴數(shù)量明顯減少。TNF-α、IL-1β和IL-6與NF-κB 核內(nèi)易位活化密切相關(guān)。NF-κB信號通路激活可能是引起細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的主要原因[17]。NF-κB的IKKα啟動(dòng)子序列與Notch信號下游轉(zhuǎn)錄因子Hes1存在部分重合,表明Notch信號可能從基因轉(zhuǎn)錄層面對炎癥信號通路產(chǎn)生影響。因此,使用DAPT等Notch抑制劑或可抑制肝細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)沉積,具有防治MAFLD進(jìn)展的潛力。

作為γ-分泌酶底物的DAPT可以競爭性與γ分泌酶結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)間接抑制Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。在非酒精性脂肪性肝炎患者肝組織往往存在Notch基因異常激活[19]。抑制Notch信號可改善糖尿病模型小鼠肝臟脂滴數(shù)量、降低血清肝酶水平并提高胰島素敏感性,抑制Notch基因后可誘導(dǎo)AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和ACACA磷酸化,從而激活A(yù)MPK信號通路,促進(jìn)脂肪酸氧化并抑制脂肪合成[20]。本研究我們進(jìn)一步檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)性基因 SREBP1、FASN和ACACA表達(dá)情況,經(jīng)WB檢測結(jié)果顯示SREBP1c蛋白表達(dá)水平經(jīng)過DAPT處理后明顯下調(diào),下游的FASN和ACACA脂肪合成相關(guān)基因mRNA水平也相應(yīng)出現(xiàn)了下降。故DAPT可能通過降低SREBP1c蛋白的表達(dá)而抑制脂肪合成,從而具有調(diào)控脂質(zhì)紊亂的作用。

綜上所述,應(yīng)用DAPT抑制Notch基因家族可改善MALFD的炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常。