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        中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)在基因敲入供體的優(yōu)化方面獲進(jìn)展

        2024-01-07 18:29:37中國科學(xué)院網(wǎng)站
        科技促進(jìn)發(fā)展 2023年6期
        關(guān)鍵詞:化學(xué)修飾供體課題組

        中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心、化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院教授梁好均與生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部研究員鮑堅(jiān)強(qiáng)合作,針對(duì)目前基因敲入供體的低效率、高成本等問題,優(yōu)化并提出了一種新型的功能核酸供體,提高了基因敲入的效率。5月22日,相關(guān)研究成果以Efficient precise integration of large DNA sequences with 3'-overhang ds-DNA donors using CRISPR/Cas9為題,通過直投方式發(fā)表在《美國國家科學(xué)院院刊》(PNAS)上。

        CRISPR技術(shù)改變了我們操縱基因組進(jìn)行研究和基因治療的能力,使用帶有同源臂的外源供體作為模板依賴同源介導(dǎo)修復(fù)(HDR)途徑來精確敲入基因。然而,對(duì)于基因大小的DNA供體模板,HDR途徑較為低效。目前,可采用在ssDNA或dsDNA供體末端引入化學(xué)修飾以增強(qiáng)供體穩(wěn)定性,供體共價(jià)連接到CRISPR系統(tǒng)上提高切割位點(diǎn)局部濃度等方法提高基因敲入效率。然而,這些方法具有操作困難、成本高等問題。亟需進(jìn)一步優(yōu)化基因敲入的供體,以促進(jìn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因大小的敲入在生命科學(xué)和臨床治療中的應(yīng)用。

        鑒于此,梁好均課題組深入調(diào)研ssDNA和dsDNA作為供體的敲入機(jī)理,結(jié)合課題組在核酸化學(xué)領(lǐng)域的經(jīng)驗(yàn),在單個(gè)供體中整合ssDNA和dsDNA的獨(dú)特優(yōu)勢,設(shè)計(jì)并提出了一種具有3'懸突的dsDNA結(jié)構(gòu)(odsDNA),并將其作為供體實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大片段基因敲入(LOCK)。

        本工作是梁好均課題組繼dsDNA供體5'末端化學(xué)修飾提高基因敲入效率和RNA介導(dǎo)的CRISPR-dCas9轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)之后,在基因編輯方向的又一重大突破。該研究提出了一種經(jīng)濟(jì)普適的方法來制備任意3'懸突長度的ods-DNA供體,利用鏈中帶有連續(xù)五個(gè)硫代磷酸酯(phosphorothioate)修飾的引物通過PCR擴(kuò)增目的基因序列,再通過Lambda核酸外切酶消化處理,得到具有3'懸突的odsDNA。研究通過比較基因大?。?.1kb和2.5kb)的DNA供體的敲入效率,發(fā)現(xiàn)odsDNA顯著提高了靶向精確敲入效率,且與通用的dsDNA供體相比最高可提高4.3倍,同時(shí)在許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞跨多個(gè)基因組位點(diǎn)中保持了較低的插入缺失率和脫靶事件。當(dāng)利用3'單鏈懸臂與偶聯(lián)技術(shù)結(jié)合時(shí),使用odsDNA供體的敲入效率比dsDNA供體提高5.2倍。該LOCK策略在基因敲入中具有優(yōu)勢,有望在未來取代ssDNA或dsDNA供體,實(shí)現(xiàn)其他策略無法完成的大片段基因敲入。

        研究工作得到科學(xué)技術(shù)部和國家自然科學(xué)基金的支持。

        (文章來源:中國科學(xué)院網(wǎng)站)

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