張?zhí)鹛穑惐劓湥?，鄭明敏，2*

(1. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2. 福建師范大學(xué)，工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350117)

小球藻(Chlorella)是一種單細(xì)胞真核綠藻，具有光合作用能力，生長繁殖速度快，廣泛分布在淡水、湖泊和海洋等水體中，易于大規(guī)模培養(yǎng)，是生產(chǎn)生物燃料[1]、高價(jià)值化合物[2-3]、水產(chǎn)養(yǎng)殖功能餌料及重組治療蛋白[4]的潛在宿主。從改造的小球藻中，可以提取蛋白、油脂等營養(yǎng)物質(zhì)。由于小球藻能夠利用二氧化碳[5]，因此其也被研究用于緩解溫室效應(yīng)等環(huán)境問題。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，加上小球藻具有易培養(yǎng)、生長快速等優(yōu)勢，為其成為外源蛋白生產(chǎn)的理想宿主提供了可能性。許多研究者開始利用基因工程技術(shù)在小球藻細(xì)胞中進(jìn)行外源基因的表達(dá)，以期生產(chǎn)外源蛋白或提高小球藻生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的能力，圖1展示了運(yùn)用不同方法進(jìn)行小球藻的遺傳轉(zhuǎn)化操作。構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系是開展基因工程研究工作的基礎(chǔ)，有研究表明，小球藻可以克服其他細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)重組蛋白中的缺點(diǎn)[6]。

作為外源基因或蛋白表達(dá)的潛在宿主，小球藻具有良好的發(fā)展前景和優(yōu)勢。但由于缺乏可靠高效的轉(zhuǎn)化體系，蛋白表達(dá)不穩(wěn)定以及高價(jià)值化合物產(chǎn)量相對(duì)較低，阻礙了其作為生物反應(yīng)器應(yīng)用的發(fā)展。因此，了解小球藻基因工程轉(zhuǎn)化體系的建立和發(fā)展，對(duì)今后的真核基因表達(dá)具有積極意義。本文闡述了近年來在真核微藻小球藻中的基因工程改造進(jìn)展，詳細(xì)介紹了小球藻遺傳轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化方法、影響轉(zhuǎn)化的因素及相關(guān)蛋白的表達(dá)，以期為后續(xù)小球藻的基因工程改造和功能蛋白生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 小球藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

微藻中小球藻已實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核和葉綠體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化開發(fā)，但對(duì)于線粒體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化，僅在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中實(shí)現(xiàn)。開發(fā)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的難點(diǎn)在于需要同時(shí)克服四個(gè)問題：1)DNA能夠被轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)；2)至少需要表達(dá)一個(gè)標(biāo)記或報(bào)告基因；3)宿主細(xì)胞內(nèi)能夠復(fù)制DNA；4)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠恢復(fù)和增殖。除了核轉(zhuǎn)化外，小球藻葉綠體轉(zhuǎn)化也逐漸受到關(guān)注。針對(duì)不同的靶細(xì)胞器轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，需要制定合適的轉(zhuǎn)化體系，包括轉(zhuǎn)化方法、啟動(dòng)子、標(biāo)記/報(bào)告基因的選擇。

1.1 核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

對(duì)于小球藻的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，核基因組轉(zhuǎn)化是最早且被應(yīng)用最廣泛的方法。目前已有超過12種不同的小球藻藻種成功地進(jìn)行了核轉(zhuǎn)化[7]。由于在細(xì)胞核中表達(dá)的基因能夠編碼多種功能蛋白，與核基因組嚴(yán)格相關(guān)的功能不能通過細(xì)胞器基因工程來修改，因此細(xì)胞核成為許多基因工程研究的主要目標(biāo)[8]。對(duì)于小球藻而言，相對(duì)于細(xì)胞器轉(zhuǎn)化，目前人們對(duì)核基因組的轉(zhuǎn)化更為了解，操作也更為方便。Kim J等[9]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功編輯了小球藻的核基因組，生成硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Adenine phosphoribosyl transferase，APT)基因突變體。Gomma A E等[10]利用SV40大T抗原轉(zhuǎn)化功能域，通過overlap PCR技術(shù)制備線性基因表達(dá)盒，實(shí)現(xiàn)了該抗原成分在小球藻細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，建立了一個(gè)無抗生素標(biāo)記核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。Run C等[11]構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因的載體，通過優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)化的相關(guān)參數(shù)，在DNA水平上成功鑒定了NptⅡ和eGFP基因，實(shí)現(xiàn)了蛋白核小球藻的穩(wěn)定核轉(zhuǎn)化。雖然小球藻的核基因組轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)已逐漸成熟，但其也存在易出現(xiàn)基因失活、基因沉默、表達(dá)效率低等情況[12]。

1.2 葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

針對(duì)植物細(xì)胞而言，其遺傳物質(zhì)不僅存在于細(xì)胞核中，還存在于葉綠體和線粒體中。1988年Boynton J E等[13]使用轟擊法成功實(shí)現(xiàn)了萊茵衣藻的葉綠體轉(zhuǎn)化，為隨后小球藻的葉綠體轉(zhuǎn)化提供了可能。Wang K等[6]通過基因槍法將兩個(gè)抗菌肽基因傳遞到普通小球藻(C.vulgaris)的葉綠體基因組中，成功構(gòu)建了小球藻葉綠體轉(zhuǎn)化體系。在葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，外源DNA兩側(cè)通常有與整合位點(diǎn)兩端同源的區(qū)域，通過同源重組將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點(diǎn)上。需要注意的是，這些同源區(qū)域要足夠短，以盡量減少自發(fā)重組。葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有基因拷貝數(shù)多、表達(dá)可靠、無基因沉默現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，但外源DNA的進(jìn)入需要穿過葉綠體膜等障礙，這可能是小球藻葉綠體轉(zhuǎn)化體系還不夠成熟的原因之一。

1.3 線粒體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

關(guān)于動(dòng)物和植物線粒體的研究已有所完善和進(jìn)步，但在細(xì)胞體內(nèi)穩(wěn)定遺傳的線粒體轉(zhuǎn)化只在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和萊茵衣藻中可以實(shí)現(xiàn)[14]。Hu Z等[15]將編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻線粒體中并實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。而Yoo B C等[16]設(shè)計(jì)了一種攜帶外源DNA的“編輯質(zhì)?！?，通過基因槍法將質(zhì)粒成功導(dǎo)入酵母線粒體和萊茵衣藻葉綠體中。但是由于單個(gè)細(xì)胞可能存在多個(gè)線粒體及植物線粒體基因組通常也存在不穩(wěn)定性、缺乏強(qiáng)選擇性標(biāo)記等[14]缺陷，線粒體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也沒有得到普遍應(yīng)用。

2 轉(zhuǎn)化方法

目前，已有關(guān)于小球藻的轉(zhuǎn)化方法的研究，但選擇合適的轉(zhuǎn)化方法仍然是實(shí)現(xiàn)外源蛋白在小球藻中表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一。1991年，Jarvis E E等[17]使用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法在橢圓小球藻(C.ellipsoidea)中實(shí)現(xiàn)了熒光素酶(Luciferase)基因的瞬時(shí)表達(dá)，這是在小球藻中首次實(shí)現(xiàn)核轉(zhuǎn)化。之后，對(duì)于小球藻轉(zhuǎn)化方法的研究逐漸增多。通過開發(fā)并優(yōu)化一種可靠高效的轉(zhuǎn)化方法，可以大大提高小球藻的轉(zhuǎn)化效率。本文總結(jié)了5種轉(zhuǎn)化方法，分析并闡述其優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用。

2.1 聚乙二醇介導(dǎo)法

聚乙二醇(Polyethylene glycol mediated method，PEG)介導(dǎo)法，又被稱為玻璃珠法，是通過利用聚乙二醇與玻璃珠協(xié)同作用，造成細(xì)胞膜產(chǎn)生瞬間空隙，從而使外源 DNA 得以進(jìn)入細(xì)胞的方法[18]。PEG介導(dǎo)法使用設(shè)備簡單、操作方便，對(duì)宿主細(xì)胞的損傷較小[7]，是最早用于使外源基因轉(zhuǎn)移到微藻的方法之一，最初被用于模式藻萊茵衣藻的轉(zhuǎn)化[19]，之后在一些小球藻種的轉(zhuǎn)化體系中也得到了應(yīng)用。Hawkins R L等[20]利用PEG介導(dǎo)法，將帶有胞外分泌信號(hào)序列和外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到小球藻細(xì)胞中，在小球藻中實(shí)現(xiàn)了人生長激素(Human growth hormone，HGH)基因的瞬時(shí)表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)玻璃珠的大小也會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。楊博[18]利用PEG介導(dǎo)法，首次將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因轉(zhuǎn)化到普通小球藻基因組中，最后獲得(356±30)個(gè)克隆子/μg DNA，建立了一套穩(wěn)定而可靠的小球藻外源基因轉(zhuǎn)化體系。然而，PEG介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率通常較低[21]，且只能用于無細(xì)胞壁細(xì)胞。因此，在使用該方法時(shí)，需要選用無細(xì)胞壁突變體作為受體細(xì)胞，或使用物理、化學(xué)、生物等方法[22]去除細(xì)胞壁以獲得原生質(zhì)體。目前，多數(shù)研究采用復(fù)合酶解液或物理方法(如研磨或超聲破碎)對(duì)小球藻的細(xì)胞壁進(jìn)行破壞和去除。

2.2 電穿孔法

電穿孔是一種常用的細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化方法，通過施加特定強(qiáng)度的脈沖電場，改變細(xì)胞膜的表面結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上打開微孔，以便外源 DNA 通過此孔進(jìn)入受體細(xì)胞，并在恢復(fù)狀態(tài)后整合到細(xì)胞染色體組中[23]。電穿孔法是目前小球藻遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用最為廣泛的方法，具有操作簡便、轉(zhuǎn)化效率較高等優(yōu)點(diǎn)。

電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率受到多種因素的影響，包括細(xì)胞壁、電場強(qiáng)度、脈沖時(shí)間、質(zhì)粒濃度等。Chow K C等[24]發(fā)現(xiàn)，在較高的電場強(qiáng)度下，獲得的轉(zhuǎn)化效果更好，但是電壓過高會(huì)導(dǎo)致重組質(zhì)粒無法穩(wěn)定整合到細(xì)胞染色體組中。Muoz C F等[25]在開發(fā)預(yù)測微藻最佳電穿孔條件的方法時(shí)發(fā)現(xiàn)：較低的細(xì)胞濃度、光強(qiáng)和小DNA片段的傳遞可以產(chǎn)生更高的轉(zhuǎn)化效率。但有些種屬，比如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)[26]，由于其具有硅質(zhì)化的細(xì)胞壁，因此無法使用電穿孔直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化。針對(duì)這種情況，通常采用制備原生質(zhì)體或使用滲透液滲透細(xì)胞壁，如使用山梨醇和甘露醇預(yù)先處理受體細(xì)胞，改變細(xì)胞壁通透性，以此增加質(zhì)粒 DNA 進(jìn)入細(xì)胞的概率。

2.3 微粒子轟擊法

微粒子轟擊法，又叫基因槍法，是一種可以將DNA遞送到完整細(xì)胞的有效方法。它通過利用高壓氦氣或氮?dú)馑查g產(chǎn)生的沖擊力，向細(xì)胞中發(fā)射黏附有質(zhì)粒DNA的金屬(鎢或金)微粒子，從而穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞[27]。Chen Y[28]等最初在橢圓小球藻中利用微粒子轟擊實(shí)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酸酶(β-Glucuronidase，GUS)基因的瞬時(shí)表達(dá)，表明微粒子轟擊是一種用于小球藻轉(zhuǎn)化的可行方法。Wang K等[6]通過直徑約550 nm的金載體微顆粒將重組質(zhì)粒轟擊轉(zhuǎn)化至普通小球藻的葉綠體中，獲得了(212±48)個(gè)克隆子/μg DNA的轉(zhuǎn)化值。趙熙寧[29]通過微粒子轟擊介導(dǎo)蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)的轉(zhuǎn)化，最終獲得了高蛋白產(chǎn)量的優(yōu)質(zhì)蛋白核小球藻工程株。

微粒子轟擊法的影響因素主要包括微粒子直徑、轟擊距離和DNA濃度等。雖然需要使用昂貴的基因槍設(shè)備，但操作簡單、適用范圍廣。葉綠體基因組轉(zhuǎn)化的唯一有效方法是微粒子轟擊或生物法[19]。但使用的金屬顆粒一般帶有生物毒性，可能會(huì)對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生損傷。

2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是一種常用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其原理是將目的基因插入到根瘤農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)Ti質(zhì)粒上的T-DNA 區(qū)，通過農(nóng)桿菌侵染將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞的核基因組中[30]。近些年來，研究發(fā)現(xiàn)該方法也可用于小球藻的遺傳轉(zhuǎn)化。Sharma P K等[31]首次報(bào)道了一種在索羅金小球藻(C.sorokiniana)中高效穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，最終獲得了(220±5)個(gè)克隆子/106細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值。馮興標(biāo)等[32]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法有效提高了小球藻中蝦青素的含量。與其他方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡便、宿主范圍廣泛、可轉(zhuǎn)移大片段DNA，以及準(zhǔn)確將低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因整合到轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域等顯著優(yōu)勢[33]。

在農(nóng)桿菌附著植物細(xì)胞的過程中，植物細(xì)胞缺口會(huì)釋放酚類化合物如乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，然后誘導(dǎo)毒力基因Vir進(jìn)行表達(dá)，從而將外源DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞基因組中[30]。Yang B等[7]研究發(fā)現(xiàn)小球藻只有在加入AS后才能進(jìn)行轉(zhuǎn)化。Sharif N等[34]的研究結(jié)果表明，細(xì)菌密度為OD600=1.0、共培養(yǎng)溫度為25 ℃、共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH為5.5、共培養(yǎng)3 d、乙酰丁香酮濃度為100 μmol/L是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化普通小球藻的最佳條件。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系中，可對(duì)農(nóng)桿菌濃度、小球藻細(xì)胞狀態(tài)、共培養(yǎng)條件及乙酰丁香酮濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以提高小球藻的轉(zhuǎn)化效率。

2.5 納米載體介導(dǎo)法

納米載體介導(dǎo)法是一種新型的小球藻遺傳轉(zhuǎn)化方法。磁性納米粒子是從金屬氧化物中制備的基因載體。它可以通過修飾表面與大量核酸分子靜電吸附結(jié)合，形成復(fù)合體，在磁場作用下滲透到細(xì)胞中，從而將目的基因傳遞到核基因組中。曹蘇珊等[35]使用磁性納米顆粒介導(dǎo)法成功將報(bào)告基因EGFP傳遞到核基因組，在橢圓小球藻中獲得了EGFP綠色熒光的瞬時(shí)表達(dá)。磁性納米顆粒與質(zhì)粒緊密結(jié)合形成的靜電吸附可以防止外源基因被胞內(nèi)核酸酶酶解，從而避免了細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的降低[36]。作為一種新型的轉(zhuǎn)化方法，該技術(shù)具有轉(zhuǎn)化速度快、操作方便、表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn)，但也存在轉(zhuǎn)化效率低、成本高等缺陷。

3 轉(zhuǎn)化影響因素

3.1 細(xì)胞壁

微藻的細(xì)胞壁是由碳水化合物、碳?xì)浠衔?、蛋白質(zhì)和其他成分組成的復(fù)雜多聚體[8]。小球藻的細(xì)胞壁隨著生長發(fā)育會(huì)逐漸形成兩層結(jié)構(gòu)，厚度約為17～21 nm[37-38]，這種細(xì)胞壁是外源DNA進(jìn)入微藻細(xì)胞的一個(gè)巨大物理屏障。

若使用農(nóng)桿菌或PEG介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，需要獲得細(xì)胞壁缺陷型藻株或制備原生質(zhì)體。酶解法是制備藻細(xì)胞原生質(zhì)體的常用方法，具有條件溫和、對(duì)細(xì)胞損傷程度小等優(yōu)點(diǎn)。纖維素是大多數(shù)小球藻種細(xì)胞壁的主要成分[39]。研究表明，同時(shí)使用纖維素酶和崩潰酶預(yù)處理小球藻，可以顯著提高原生質(zhì)體制備率[39]。Yang B等[5]使用了含有纖維素酶、離析酶和果膠酶的酶混合液預(yù)處理小球藻的細(xì)胞壁，最終得到了超過80%的原生質(zhì)體產(chǎn)率。盡管破壞細(xì)胞壁不是所有藻類成功轉(zhuǎn)化的必要條件，但它是細(xì)胞滲透到足以有效穿透外源DNA和細(xì)胞死亡之間的微妙平衡[8]，可以有效提高轉(zhuǎn)化效率。在萊茵衣藻中，高效率轉(zhuǎn)化通常只報(bào)道在無細(xì)胞壁突變體或已去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體細(xì)胞中[8]。因此，在小球藻基因轉(zhuǎn)化研究中，細(xì)胞壁的處理是提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵步驟之一。

3.2 選擇標(biāo)記和報(bào)告基因

在轉(zhuǎn)化體系中，通常會(huì)將帶有某一特定抗性的選擇標(biāo)記或帶有熒光報(bào)告基因的質(zhì)粒與目的DNA融合后，轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中，便于后續(xù)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。選擇標(biāo)記是指將編碼某一抗生素的抗性基因?qū)爰?xì)胞中表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有對(duì)該抗生素的抗性特質(zhì)。表1列出了目前常用于小球藻遺傳轉(zhuǎn)化篩選的抗生素抗性選擇標(biāo)記。

表1 用于不同種類小球藻的抗生素抗性基因及最佳篩選濃度Tab.1 The resistant genes and optimal screening concentration of antibiotic for different species of Chlorella

不同的藻種對(duì)抗生素有不同的敏感濃度，在選擇抗生素時(shí)，需要提前考慮藻的種類和其本身的抗性，并設(shè)置一系列抗生素濃度梯度，觀察抑制野生型藻株生長的最佳作用濃度，這是小球藻基因工程改造中的重要部分。

報(bào)告基因是指編碼具有酶活性或易于從各種細(xì)胞蛋白中識(shí)別的蛋白質(zhì)[7]。例如在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光的綠色熒光蛋白[11]、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和藍(lán)綠色熒光蛋白[38]。成功表達(dá)熒光報(bào)告基因的細(xì)胞，在一定的激發(fā)波長下，會(huì)發(fā)出相應(yīng)的熒光，以此來驗(yàn)證質(zhì)粒是否整合成功。但考慮到小球藻細(xì)胞具有固有的光合色素和一些熒光物質(zhì)，如葉綠體紅色熒光[46]，因此熒光報(bào)告基因需要在強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下才能達(dá)到高表達(dá)水平，以此區(qū)別于背景熒光。

除了肉眼可以觀察到的顯性選擇標(biāo)記外，還有一些隱性選擇標(biāo)記可用于篩選轉(zhuǎn)化子。NR基因編碼了一種介導(dǎo)硝酸鹽向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化的酶，NR基因突變體不能利用硝酸鹽，因此在僅以硝酸鹽為氮源的培養(yǎng)基中無法生長。另外，APT基因編碼一種催化腺嘌呤轉(zhuǎn)化為腺苷酸的蛋白質(zhì)，APT突變體會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在含有2-氟腺嘌呤的培養(yǎng)基中不受抑制地生長[9]。這種通過基因突變導(dǎo)致翻譯提前終止，蛋白無法表達(dá)的隱性選擇標(biāo)記可以減少外源基因的插入和抗生素的使用，具有提高經(jīng)濟(jì)效益和減少環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子

啟動(dòng)子是基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，強(qiáng)啟動(dòng)子會(huì)調(diào)控基因的高表達(dá)[47]。花椰菜花葉病毒35S (CaMV35S)啟動(dòng)子是小球藻中應(yīng)用最廣泛的組成型啟動(dòng)子之一[7]，已被成功用于普通小球藻[5]、橢圓小球藻[17]、蛋白核小球藻[48]。來自植物的組成型啟動(dòng)子也可以發(fā)揮作用。如玉米的泛素啟動(dòng)子已成功驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在小球藻中的高效表達(dá)[44]，而水稻肌動(dòng)蛋白的Actin1啟動(dòng)子也被認(rèn)為可以促進(jìn)小球藻中的基因表達(dá)。Niu Y F等[45]克隆了NR基因的啟動(dòng)子和終止子，驅(qū)動(dòng)誘導(dǎo)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Chloramphenicol acetyltransferase，CAT)報(bào)告基因的表達(dá)，結(jié)果顯示CAT的表達(dá)會(huì)受到硝酸鹽的誘導(dǎo)，提出了一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在小球藻中的應(yīng)用體系。

一般來說，外源啟動(dòng)子的表達(dá)效率低于內(nèi)源啟動(dòng)子。在小球藻中被鑒定并分離出的光系統(tǒng)Ⅰ蛋白D (psaD)啟動(dòng)子，是首次報(bào)道的可以驅(qū)動(dòng)真核微藻和高等植物基因表達(dá)[49]的小球藻內(nèi)源性啟動(dòng)子。Shin J H等[50]從小球藻核基因組中分離到兩個(gè)氮饑餓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，通過添加信號(hào)肽，成功實(shí)現(xiàn)了人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)多肽的表達(dá)和分泌。為了高效驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，研究者會(huì)在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)加入一些調(diào)控元件，如增強(qiáng)子來激活啟動(dòng)子發(fā)揮功能。研究表明在中性粒細(xì)胞肽(Neutrophil peptide-1，NP-1)基因上游區(qū)域添加一個(gè)ω增強(qiáng)子后，可以增加基因表達(dá)[51]。在Liu J等[52]構(gòu)建的小球藻(C.zofingiensis)轉(zhuǎn)化體系中，將內(nèi)源性八氫番茄紅素去飽和酶啟動(dòng)子的第一個(gè)內(nèi)含子序列克隆后，添加到啟動(dòng)子序列上游，轉(zhuǎn)化效率提高了91%。這些研究證實(shí)了增強(qiáng)子或調(diào)控元件在促進(jìn)小球藻轉(zhuǎn)基因表達(dá)中可以發(fā)揮重要的作用。

4 蛋白表達(dá)

小球藻擁有完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，因此可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾和加工。此外，小球藻具有生長周期短、食用安全性高、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域。表2列出了不同種類小球藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化率或蛋白表達(dá)量。

表2 不同種類小球藻的轉(zhuǎn)化率或蛋白表達(dá)量Tab.2 The transformation rate or expressed proteins in different species of Chlorella

Hawkins R L等[20]發(fā)現(xiàn)在小球藻中表達(dá)的異源蛋白HGH的產(chǎn)量約為200～600 ng/mL。雖然比報(bào)道的大腸桿菌(Escherichiacoli)中的HGH(0.5～2.4 μg/mL)產(chǎn)量低。但該研究為在小球藻中表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白提供了良好的開端。

小球藻中表達(dá)的重組蛋白可用于生產(chǎn)天然餌料。Kim D H等[40]在橢圓小球藻中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化了比目魚生長激素(Flounder growth hormone，fGH)基因，最后測定fGH的蛋白量超過了400 μg。將轉(zhuǎn)化后的小球藻喂養(yǎng)比目魚30 d后，其生長速度提高了25%。Reddy P H等[48]將含有傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)VP2基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到蛋白核小球藻中，Western blot分析證實(shí)了IBDV VP2蛋白可以在蛋白核小球藻中表達(dá)，該蛋白可以保護(hù)雞免受雞傳染病病毒IBDV的侵害。這些研究證實(shí)了小球藻中外源蛋白穩(wěn)定表達(dá)的可行性，為工業(yè)化生產(chǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的食用蛋白提供了可靠依據(jù)。

目前也有許多針對(duì)小球藻進(jìn)行的外源抗菌肽的表達(dá)研究。Koo J等[41]將牛乳鐵蛋白N葉基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在普通小球藻中實(shí)現(xiàn)了乳鐵蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。乳鐵蛋白是一種可以在非免疫防御系統(tǒng)中起作用的抗菌肽，對(duì)革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌都具有抗菌活性。何藝賓[54]利用電穿孔轉(zhuǎn)化法，在轉(zhuǎn)基因小球藻中實(shí)現(xiàn)了抗菌肽融合基因的穩(wěn)定表達(dá)，并證實(shí)了該抗菌肽能夠抑制嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生長。

小球藻作為表達(dá)治療性蛋白質(zhì)的潛在平臺(tái)也引起了人們的關(guān)注。Bai L L等[43]將突變的防御素(Mutated NP-1)NP-1基因轉(zhuǎn)化到橢圓小球藻中，并分離出了具有生物活性的防御素。藏花酸是稀有藥用植物藏紅花的主要活性成分之一，是一種潛在的藥用藥物。Lou S等[42]通過將藏花酸合成途徑中的關(guān)鍵基因crtRB和ZCD1引入普通小球藻中，成功產(chǎn)生了具有活性的藏花酸。雖然小球藻能夠進(jìn)行復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和修飾，產(chǎn)生的活性蛋白質(zhì)可以用作抗原和抗體[55]，但其生產(chǎn)量往往低于細(xì)菌或植物系統(tǒng)。適當(dāng)添加信號(hào)肽序列[50]和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)序列[37]或許有助于建立高效的蛋白表達(dá)和分泌系統(tǒng)。

CRISPR/Cas9通過使用gRNA序列將核酸酶(Cas9)引導(dǎo)到受體細(xì)胞的基因組中，可以精確編輯原核和真核物種的基因組。盡管在萊茵衣藻中首次成功應(yīng)用了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，但結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)化效率很低，這可能是因?yàn)镃as9對(duì)藻細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[56]。除了較低的轉(zhuǎn)化效率外，需要用于篩選的明顯表型也是目前CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在微藻中使用的局限之一[8]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[56]和高效基因表達(dá)框的改良，可能有利于基因編輯技術(shù)在小球藻轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

5 總結(jié)與展望

小球藻是高值生物產(chǎn)物和功能蛋白質(zhì)的一種重要來源。通過利用各種技術(shù)工具對(duì)小球藻進(jìn)行基因組編輯和蛋白表達(dá)，擴(kuò)展其作為表達(dá)宿主，具有經(jīng)濟(jì)性和環(huán)境可行性。目前，電穿孔和基因槍法是小球藻轉(zhuǎn)化的常用方法，其中基因槍法是用于葉綠體基因組轉(zhuǎn)化的最有效方法。常用于植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，不需要提前制備原生質(zhì)體，在小球藻轉(zhuǎn)化體系中也有巨大的應(yīng)用潛力。啟動(dòng)子、功能表達(dá)載體和合適的選擇標(biāo)記是小球藻轉(zhuǎn)化體系的重要組成部分。構(gòu)建和利用植物病毒載體，密碼子優(yōu)化、插入調(diào)控元件、使用內(nèi)源性啟動(dòng)子等操作可以提高外源基因插入的效率和穩(wěn)定性，并增加蛋白表達(dá)量。

小球藻作為一種生命活動(dòng)簡單的真核微藻，在功能營養(yǎng)餌料和改善生態(tài)環(huán)境方面都有可觀的前景。盡管不斷的探索和研究使小球藻基因工程改造領(lǐng)域取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但在其成為成熟的表達(dá)系統(tǒng)之前仍有許多障礙需要克服。開發(fā)一種適合小球藻高效、穩(wěn)定表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)化體系，對(duì)于生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品和功能性營養(yǎng)品具有重要而深遠(yuǎn)的意義。