劉 凱，謝 楠，王宇希，劉新軼

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水產(chǎn)研究所，浙江 杭州 310024)

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)，又稱青蝦、河蝦，是一種重要的經(jīng)濟(jì)性甲殼類動(dòng)物，分類學(xué)上隸屬于長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)。它們適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、食性雜、生長(zhǎng)快、養(yǎng)殖效益高，因此成為中國(guó)淡水蝦類養(yǎng)殖中的重要資源之一[1-2]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)健康飲食需求的不斷增加，沼蝦的市場(chǎng)需求也在逐漸增長(zhǎng)。同時(shí)，科學(xué)家們也在探索如何更好地利用沼蝦的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，為人類帶來(lái)更多的健康福利。微衛(wèi)星DNA(Microsatellite)是一種由少量核苷酸(1～6個(gè))為基本單位串聯(lián)重復(fù)形成的一段序列，也被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat，STR)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列 (Simple sequence repeat，SSR)。SSR多態(tài)性分析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、種群遺傳多樣性檢測(cè)、遺傳圖譜的構(gòu)建以及生產(chǎn)性狀位點(diǎn)的連鎖分析和QTL分析等方面[2-6]。目前有關(guān)日本沼蝦SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的報(bào)道相對(duì)較少。本研究利用測(cè)序分型方法開(kāi)發(fā)日本沼蝦的SSR分子標(biāo)記，以期為其種質(zhì)選育、遺傳多樣性的檢測(cè)等提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

試驗(yàn)所用日本沼蝦包括錢塘江群體(QT)、武義群體(WY)、高塘湖群體(GT)、肇慶群體(ZQ)和南寧群體(NN)，均于2021年采自國(guó)內(nèi)5個(gè)日本沼蝦野生區(qū)域，分別采集樣本6尾進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，取其尾部肌肉后，用無(wú)水乙醇保存?zhèn)溆??；蚪MDNA的提取采用常規(guī)的酚氯法[7]。對(duì)基因組DNA進(jìn)行定量后，用Covaris M220超聲波儀將DNA剪切成片段，并通過(guò)以下步驟純化以制備測(cè)序文庫(kù)[8]：對(duì)DNA片段進(jìn)行末端過(guò)濾、加A，并與測(cè)序接頭連接，進(jìn)而進(jìn)行Illumina測(cè)序。最后，構(gòu)建的文庫(kù)通過(guò)雙末端測(cè)序過(guò)程進(jìn)行測(cè)序。上海派森諾生物科技有限公司完成了測(cè)序過(guò)程。對(duì)原始讀數(shù)的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制采用Fastp ver.0.20.1預(yù)處理程序[9]，使用默認(rèn)參數(shù)。

1.2 多態(tài)性SSR序列的篩選

參照本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的無(wú)參考基因組SSR開(kāi)發(fā)方法[10]篩選出含多態(tài)性SSR的序列。開(kāi)發(fā)方法簡(jiǎn)述如下：利用WY_4和NN_5兩個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)ebwt2InDel軟件[11]從這兩個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)中尋找包含Insertion/Deletion (InDel)標(biāo)記的序列?；诎琁nDel標(biāo)記的序列，利用SSR篩選軟件MISA[12]搜索包含SSR的序列并刪除非SSR型InDel標(biāo)記的序列，得到最終序列。最后基于得到的最終序列，利用Primer3 ver.2.5.0設(shè)計(jì)SSR引物[13]，以滿足PCR驗(yàn)證的需要。MISA搜索設(shè)置：2個(gè)堿基重復(fù)6次及6次以上，3～6個(gè)堿基重復(fù)4次及4次以上。

1.3 SSR的測(cè)序分型

利用SSRgenotyper軟件[14]，對(duì)30尾日本沼蝦進(jìn)行了SSR的基因分型，對(duì)原程序的部分代碼進(jìn)行了改動(dòng)，以直接讀取MISA搜索的結(jié)果，修改后的代碼可在https：//github.com/zergger/SSRgenotyper地址中獲取。參數(shù)設(shè)置為Q=30、S=1、M=0.1、B=30、m=3，輸出格式設(shè)置為genepop格式，以自行篩選的含SSR的序列作為參考序列。分型之前，利用軟件BWA-MEM ver.1.0.5[15]將fastp過(guò)濾后獲得的clean reads比對(duì)到包含SSR的序列上，使用軟件SAMtools ver.1.6[16]刪除重復(fù)、低質(zhì)量的clean reads后，獲得用于基因分型的SAM文件。基于獲得的SAM文件，利用SSRgenotyper軟件獲得最終的SSR分型結(jié)果。采用TouchDown PCR，使用HotStart MasterMix(購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司)及5～10個(gè)樣本對(duì)其中3對(duì)引物進(jìn)行了PCR驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃10 s，退火5 s，72 ℃15 s，起始退火溫度60 ℃，每個(gè)循環(huán)降低1 ℃，共10個(gè)或12個(gè)循環(huán)；98 ℃10 s，48 ℃或50 ℃退火5 s，72 ℃15 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。采用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行常規(guī)電泳。

1.4 數(shù)據(jù)處理

微衛(wèi)星的等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度以及 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，利用GenAlEx ver.6.51b2進(jìn)行處理[17]。其中，多態(tài)性信息含量(Polymorphic information content，PIC)的計(jì)算采用Cervus ver.3.0.7進(jìn)行處理[18]。Hardy-Weinberg平衡利用PopGene ver.1.32軟件[19]進(jìn)行檢驗(yàn)，采用Likelihood ratio方法，同時(shí)采用Bonferroni修正進(jìn)行顯著性判別[20]。

2 結(jié)果與分析

通過(guò)ebwt2InDel軟件從WY_4和NN_5兩個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)中尋找包含InDel標(biāo)記的序列779條。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的無(wú)參考基因組SSR開(kāi)發(fā)方法從779條含InDel標(biāo)記的序列中篩選出含多態(tài)性SSR的序列137條，去除包含復(fù)合型SSR的序列26條，最終得到包含完美型SSR的序列111條。以包含完美型SSR的111條序列為模板，利用SSRgenotyper軟件對(duì)5個(gè)群體共30個(gè)樣本進(jìn)行SSR分型。測(cè)序分型結(jié)果顯示，111條含SSR的序列中，共有19個(gè)SSR可以成功分型，分型成功率為17.12%。分型成功的19個(gè)SSR均為3堿基重復(fù)4～6次，其中以ATC/ATG為單位的重復(fù)序列占比最多，為6個(gè)(31.58%)。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer3針對(duì)分型成功的19個(gè)SSR序列設(shè)計(jì)了引物19對(duì)(表1)。采用TouchDown PCR對(duì)其中3對(duì)引物進(jìn)行了PCR驗(yàn)證。由于Cluster813下游引物的GC含量少，Tm值較低，因此PCR驗(yàn)證中將退火溫度降低至48 ℃。由圖1可見(jiàn)，3對(duì)引物均可擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期大小基本一致。

表1 測(cè)序分型法獲得的日本沼蝦SSR多態(tài)性位點(diǎn)引物的基本信息Tab.1 Basic information of microsatellite primers of M.nipponense obtained by genotyping by sequencing

有關(guān)每個(gè)位點(diǎn)的遺傳多樣性，包括每個(gè)基因座的等位基因數(shù)(Na)、觀察到的雜合性(Ho)、期望雜合度(He)、香儂信息指數(shù)(SI)、多態(tài)性信息含量(PIC)和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的概率(PHW)等分型數(shù)據(jù)如表2所示。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)表明，本研究篩選的19個(gè)SSR標(biāo)記中7個(gè)偏離了Hardy-Weinberg平衡，計(jì)算出的PHW值小于Bonferroni修正后的P值0.002 6。根據(jù)Botstein D等[21]基于PIC的分類，19個(gè)SSR分為低度信息含量的標(biāo)記2個(gè)、中度信息含量的標(biāo)記17個(gè)。

表2 測(cè)序分型法獲得的日本沼蝦SSR多態(tài)性位點(diǎn)的特征分析Tab.2 Characteristic of microsatellite primers of M.nipponense obtained by genotyping by sequencing

3 討論

SSR在許多遺傳應(yīng)用中是首選的標(biāo)記類型，包括基因組作圖、保護(hù)遺傳學(xué)、多倍體親子鑒定、系統(tǒng)地理學(xué)和群體遺傳學(xué)[22]。作為分子標(biāo)記，SSR具有廣泛的優(yōu)勢(shì)，包括高度多態(tài)性、共顯性遺傳以及在各種體外條件下的可重復(fù)性[23-24]。然而，傳統(tǒng)的基于PCR、凝膠電泳或毛細(xì)管電泳的SSR開(kāi)發(fā)方法存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)且效率低等問(wèn)題。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和成本的下降，對(duì)整個(gè)群體進(jìn)行SSR基因分型測(cè)序正在成為相對(duì)于傳統(tǒng)的基于PCR/電泳方法的一種具有吸引力的替代方案。本研究使用SSRgenotyper從自行開(kāi)發(fā)的共111個(gè)微衛(wèi)星中鑒定出19個(gè)多態(tài)性SSR位點(diǎn)，基因分型效率超過(guò)90%(超過(guò)90%的個(gè)體都獲得了分型結(jié)果)。

為驗(yàn)證SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，本研究從5個(gè)地理群體中選擇了30個(gè)樣本，以確保驗(yàn)證樣本的多樣性；設(shè)計(jì)了19對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增篩選出19個(gè)多態(tài)性SSR位點(diǎn)，并對(duì)其中的3對(duì)引物進(jìn)行了PCR和電泳分析。電泳結(jié)果驗(yàn)證了基于測(cè)序方法進(jìn)行基因分型的準(zhǔn)確性，凝膠電泳得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期大小基本一致。實(shí)際上，基于測(cè)序的SSR基因分型方法早已有之。在魚類驗(yàn)證中，基于測(cè)序的基因分型方法的準(zhǔn)確率超過(guò)90%[10]。Lewis D H等[14]將其應(yīng)用在植物上，驗(yàn)證結(jié)果顯示二核苷酸和四核苷酸SSR的不一致性最高(分別為5.7%和5.0%)，重復(fù)次數(shù)超過(guò)15次的SSR最不一致(20.3%)，但它們僅占總SSR數(shù)的不到0.4%。三核苷酸SSR是最常見(jiàn)的類型，占所有基因分型SSR位點(diǎn)的72.9%。Han J等[25]進(jìn)行了基因組測(cè)序分型中SNP和SSR的比較研究，結(jié)果表明在群體遺傳分析中，這兩種方法具有高度一致性。此外，基于SSR的遺傳分析還揭示了一些與SNP分析不同的結(jié)果[25]。

SSR核心序列的突變率相對(duì)較高(10-5～10-3)，這會(huì)導(dǎo)致SSR長(zhǎng)度的變化，從而產(chǎn)生SSR多態(tài)性[26]。SSR寡核苷酸的重復(fù)數(shù)在同一物種的不同基因型間差別很大，一般很少用于多態(tài)性分析。根據(jù)Weber J L[27]的研究，只有當(dāng)雙堿基重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)大于10次時(shí)，SSR標(biāo)記才有可能表現(xiàn)出較高的PIC值。當(dāng)重復(fù)次數(shù)大于16時(shí)，可提供的PIC值在0.5以上。這也是本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置MISA搜索條件的依據(jù)：2個(gè)堿基重復(fù)6次及6次以上，3～6個(gè)堿基重復(fù)4次及4次以上?；跓o(wú)參考基因組SSR方法篩選并經(jīng)測(cè)序分型驗(yàn)證后獲得的SSR標(biāo)記都是三堿基重復(fù)，其重復(fù)次數(shù)都在4～6次之間，沒(méi)有檢測(cè)到具有多態(tài)性的雙堿基重復(fù)，這可能與分型方法有關(guān)，也可能與樣本或物種有關(guān)。而Lewis D H等[14]在植物上驗(yàn)證的結(jié)果也表明，三核苷酸SSR是最常見(jiàn)的類型。此外，在日本沼蝦中，使用無(wú)參考基因組SSR篩選方法獲得的多態(tài)性SSR標(biāo)記的有效率較低，這也可能與物種有關(guān)。在三角魴(Megalobramaterminalis)中，采用無(wú)參考基因組SSR篩選方法篩選的SSR標(biāo)記中，多態(tài)性標(biāo)記的比例可以達(dá)到90%以上[10]。將驗(yàn)證多態(tài)性的樣本限定到WY和NN兩個(gè)群體上，篩選出的多態(tài)性SSR標(biāo)記數(shù)量可以提升到27個(gè)(文中未列出)。這表明作為參考的包含SSR的序列保守性不強(qiáng)造成比對(duì)率低，或者是由日本沼蝦樣本的序列多樣性較高造成比對(duì)率低。

一些研究表明，重復(fù)次數(shù)較少的SSR標(biāo)記往往難以檢測(cè)出多態(tài)性。Valdes A M等[28]的研究結(jié)果顯示，人類(Homosapiens)中重復(fù)次數(shù)低于5的SSR，幾乎檢測(cè)不出多態(tài)性。而Smulders M J M等[29]則認(rèn)為，重復(fù)次數(shù)多的SSR既能在種間又能在種內(nèi)產(chǎn)生多態(tài)性，但重復(fù)次數(shù)少的SSR僅能在種間產(chǎn)生多態(tài)性。Xu Z等[30]對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)進(jìn)行的研究也表明，核心序列重復(fù)次數(shù)較少的SSR標(biāo)記往往是單態(tài)性的，或等位基因數(shù)目非常少，PIC值也偏低。因此，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記往往需要仔細(xì)選擇重復(fù)次數(shù)較多的核心序列，以提高SSR標(biāo)記的多態(tài)性和可靠性。但隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SSR基因分型測(cè)序正在成為相對(duì)于傳統(tǒng)的基于PCR/電泳方法的一種具有吸引力的替代方案。由于SSR基因分型測(cè)序的高分辨率，即使傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中難以檢測(cè)到的低重復(fù)次數(shù)SSR標(biāo)記，其多態(tài)性也可檢測(cè)到。本實(shí)驗(yàn)所獲得的SSR序列重復(fù)數(shù)大部分在4～5次，但使用SSR基因分型測(cè)序依然可以檢測(cè)到多態(tài)性，PIC值大多達(dá)到了中度信息含量，這對(duì)遺傳多樣性分析也是有利的。