楊桂琴，李曉東*，路瑋靜，姜 璠，陳紫琴，張偉妮，2，陳新華

(1.福建農(nóng)林大學(xué)海洋學(xué)院，福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海水養(yǎng)殖生物育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)，中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)，隸屬鱸形目(Perciformes)、石首魚(yú)科(Sciaenidae)、黃魚(yú)屬(Larimichthys)，肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，也是福建省網(wǎng)箱養(yǎng)魚(yú)產(chǎn)量最高的魚(yú)種[1-3]。近年來(lái)，隨著大黃魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，其養(yǎng)殖量日益攀升，養(yǎng)殖密度逐漸增大，導(dǎo)致大黃魚(yú)養(yǎng)殖環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，進(jìn)而出現(xiàn)由細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)引發(fā)的疾病頻發(fā)[4-6]，其中以近年來(lái)流行暴發(fā)的大黃魚(yú)刺激隱核蟲(chóng)病危害最為廣泛，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于刺激隱核蟲(chóng)病的組織病理學(xué)已有很多報(bào)道，當(dāng)蟲(chóng)體在宿主中發(fā)育時(shí)，受侵染的皮膚會(huì)形成“白點(diǎn)”，嚴(yán)重感染的個(gè)體會(huì)出現(xiàn)上皮細(xì)胞壞死、脫落的現(xiàn)象，更甚者細(xì)胞凋亡、宿主死亡[9-10]。在感染刺激隱核蟲(chóng)病的大黃魚(yú)中發(fā)現(xiàn)，患病魚(yú)的各內(nèi)臟組織器官都有明顯的病變特征，包括肝臟充血萎縮、脾臟腫脹、膽囊發(fā)炎、腸道內(nèi)充滿了大量的黃白色黏液[11]。

目前，有研究表明海水魚(yú)類體內(nèi)寄生的纖毛蟲(chóng)大多以盾纖毛蟲(chóng)為主，易感染的魚(yú)類主要是牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大菱鲆(Scophthlmusmaximus)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)和鱸魚(yú)(Perchspp.)，該蟲(chóng)病在魚(yú)類育苗期、養(yǎng)成期均可發(fā)生，一旦感染，傳染速度非常快，發(fā)病率極高，會(huì)造成魚(yú)類規(guī)模性死亡[12-13]。在分離鑒定出的多種盾纖毛蟲(chóng)中，貪食邁阿密蟲(chóng)(Miamiensisavidus)可引起細(xì)點(diǎn)牙鯛(Dentexdentex)盾纖毛蟲(chóng)病，患病魚(yú)會(huì)出現(xiàn)體表出血、背鰭潰爛、皮膚褪色、大量腹水的現(xiàn)象[14]；由尾絲蟲(chóng)屬(Uronemasp.)引起的珊瑚礁魚(yú)盾纖毛蟲(chóng)病，患病魚(yú)的骨骼肌發(fā)炎、皮膚及鰓細(xì)胞壞死[15]；由蟹棲異阿腦蟲(chóng)(Mesanophryscarcini)引起的養(yǎng)殖大菱鲆盾纖毛蟲(chóng)病，患病魚(yú)的病灶部位變白、浮腫，病魚(yú)組織出現(xiàn)多處明顯病變[16]。然而在大黃魚(yú)體表寄生的盾纖毛蟲(chóng)病的病理學(xué)分析鮮有報(bào)道，因此本研究通過(guò)對(duì)自然患病大黃魚(yú)與正常大黃魚(yú)的組織病理變化進(jìn)行比較研究，分離出盾纖毛蟲(chóng)病原體，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)特征分析，探討大黃魚(yú)盾纖毛蟲(chóng)病的病理過(guò)程和發(fā)病機(jī)理，同時(shí)初步分析并推測(cè)盾纖毛蟲(chóng)的分屬地位，為海水魚(yú)類在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖出現(xiàn)的盾纖毛蟲(chóng)病的預(yù)防及診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用大黃魚(yú)體質(zhì)量為(7.0±2.5)g，購(gòu)自福建省羅源縣澤洋水產(chǎn)有限公司，均為海水養(yǎng)殖網(wǎng)箱中健康人工繁育個(gè)體，采用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行飼養(yǎng)，養(yǎng)殖環(huán)境溫度為(19±1)℃。在適應(yīng)性養(yǎng)殖第3天開(kāi)始，個(gè)別大黃魚(yú)體表出現(xiàn)小白點(diǎn)，之后逐漸形成白斑。經(jīng)檢查選取健康大黃魚(yú)與患病魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 蟲(chóng)體培養(yǎng)

盾纖毛蟲(chóng)培養(yǎng)液制備：剪取5.0 g大黃魚(yú)肉，充分研磨糜爛后，加入適量的蒸餾水，用經(jīng)0.45 μm混合纖維濾膜過(guò)濾的海水與研磨的魚(yú)肉混勻后再進(jìn)行高溫高壓滅菌處理，待冷卻后，先用紗布濾除多余的肉渣，再用0.45 μm混合纖維濾膜過(guò)濾肉湯，將10 mL過(guò)濾的肉湯加入100 mL過(guò)濾的海水中，形成的海水肉湯培養(yǎng)基即為盾纖毛蟲(chóng)培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)所用的纖毛蟲(chóng)分離自患病大黃魚(yú)體表發(fā)白潰爛處，將分離得到的蟲(chóng)體接種于海水肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化培養(yǎng)。在肉湯培養(yǎng)狀態(tài)下，蟲(chóng)體游動(dòng)極其活躍，喜在組織碎屑中聚集，并通過(guò)體前端的尖頂在基質(zhì)中鉆營(yíng)；單個(gè)蟲(chóng)體在2～3 d內(nèi)可通過(guò)二分裂快速繁殖形成高密度的蟲(chóng)體群。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 解剖觀察

活體解剖瀕死大黃魚(yú)，用肉眼和解剖鏡觀察患病魚(yú)體表及其內(nèi)臟組織病變情況，并與健康大黃魚(yú)作比較，以確定該病的主要病變情況及病變部位，再以此為依據(jù)合理選擇組織切片的病理材料。

1.3.2 寄生蟲(chóng)檢查

將患病大黃魚(yú)體表黏液、鰭條、鰓片、病灶潰爛部位的深層組織制成水浸片進(jìn)行鏡檢，挑取少量肝臟、脾臟、腸道進(jìn)行壓片檢查。

1.3.3 光鏡樣品制備及觀察

用解剖剪、鑷子分別取患病大黃魚(yú)和健康大黃魚(yú)的鰓、肝臟、脾臟、腸、肌肉、皮膚 6 種組織。先用10%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)過(guò)70%乙醇清洗數(shù)次，再用70%～100%乙醇逐級(jí)脫水45～60 min，然后用二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片，HE染色，中性樹(shù)膠封片，最后顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.3.4 盾纖毛蟲(chóng)的形態(tài)觀察

多聚甲醛固定觀察：吸取1 mL蟲(chóng)液加至1.5 mL EP離心管中，吸取少量體積分?jǐn)?shù)為10%多聚甲醛溶液滴入離心管中，搖勻滅活之后，從中吸取蟲(chóng)液滴在干凈載玻片上，并緩慢蓋上蓋玻片，由低倍鏡到高倍鏡依次觀察并拍照記錄保存。

掃描電鏡觀察：將需要制樣的蟲(chóng)體離心(3 000 r/min、5 min)后，用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛電鏡固定液固定5 min以上，采取王印庚等[17]研究的步驟進(jìn)行制片，并用掃描電鏡觀察及拍照記錄保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖觀察與發(fā)病癥狀

在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性養(yǎng)殖過(guò)程中，前3 d未發(fā)現(xiàn)大黃魚(yú)體表出現(xiàn)明顯的病變特征，第4天時(shí)在魚(yú)體表及鰭條可見(jiàn)顆粒狀的小白點(diǎn)，患病魚(yú)靜臥池底或在出水口邊緣緩慢游動(dòng)，體色變暗，攝食減少，活力下降，黏液增多。在養(yǎng)殖5～6 d時(shí)，部分大黃魚(yú)眼睛白濁、鰓蓋充血，嚴(yán)重時(shí)體表或頭部皮膚組織呈塊狀發(fā)白潰爛，皮下組織肌肉發(fā)紅，表皮病灶多有浮腫現(xiàn)象，魚(yú)體失去皮膚的屏障保護(hù)，導(dǎo)致盾纖毛蟲(chóng)侵染入更深層組織，使死亡的大黃魚(yú)只剩下一層白膜。同時(shí)鏡檢體表病灶部位發(fā)現(xiàn)大量盾纖毛蟲(chóng)寄生；剖檢后未見(jiàn)內(nèi)臟器官病變和寄生蟲(chóng)(圖1)。健康魚(yú)一經(jīng)感染，幾乎全部死亡。

注：圖中紅色圓圈代表大黃魚(yú)病變組織。a.頭部發(fā)白；b.體表局部塊狀泛白，鰓蓋充血；c.背鰭發(fā)白；d.剖檢，上為健康大黃魚(yú)，下為患病大黃魚(yú)。Notes：The red circle in the picture represented the diseased tissue of L.crocea. a. Head whitening；b. Local massive whitening of the body surface，gill cover hyperemia；c. Whitening of the dorsal fin；d. Autopsy showed healthy L.crocea at the top and diseased L.crocea at the bottom.

2.2 組織病理

與健康大黃魚(yú)相比，患病大黃魚(yú)的體表、肝臟、肌肉組織均表現(xiàn)出明顯的組織病理變化；而魚(yú)鰓、脾臟、腸道等組織未發(fā)現(xiàn)明顯病變，因此未將圖片列出。

2.2.1 體表皮膚及皮下組織

大黃魚(yú)病灶多發(fā)于頭部、鰭基部和體表皮膚。從圖2患病魚(yú)皮膚組織和體表黏液鏡檢中明顯觀察到有盾纖毛蟲(chóng)的寄生。不僅盾纖毛蟲(chóng)的寄生會(huì)造成魚(yú)體組織水腫，而且其大量繁殖也會(huì)使感染的組織體積擴(kuò)大，導(dǎo)致表皮病灶處多伴隨有浮腫現(xiàn)象的發(fā)生，從而引發(fā)組織壞死，大部分組織空間被盾纖毛蟲(chóng)占據(jù)(圖2c)，使細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、碎裂、細(xì)胞溶解，組織變性、潰散、壞死，結(jié)締組織炎性細(xì)胞增多。

注：圖中箭頭代表盾纖毛蟲(chóng)。a. 健康魚(yú)；b. 患病魚(yú)；c. 4倍顯微鏡下的體表黏液盾纖毛蟲(chóng)。Notes：The arrow in the picture represented the scuticociliatida. a. Healthy fish；b. Sick fish；c.Scuticociliatida on the body surface under a 4X microscope.

2.2.2 肝臟

如圖3所示，健康大黃魚(yú)近似橢圓的多角形細(xì)胞為實(shí)質(zhì)細(xì)胞，以放射性排列向四周擴(kuò)散，部分胰臟組織嵌入肝組織中，經(jīng)HE染色呈紫藍(lán)色的為胰腺細(xì)胞間結(jié)締組織，其呈現(xiàn)出較強(qiáng)的嗜堿性。在患病大黃魚(yú)肝臟中未發(fā)現(xiàn)寄生的纖毛蟲(chóng)，發(fā)生明顯的組織變化是肝臟細(xì)胞增生，細(xì)胞之間的界限不明顯，中央靜脈被壓迫，單核細(xì)胞增多，實(shí)質(zhì)細(xì)胞變大，結(jié)締組織的嗜堿性減弱。

注：a. 健康魚(yú)；b. 患病魚(yú)。Notes：a.Healthy fish；b.Sick fish.

2.2.3 肌肉

如圖4所示，健康大黃魚(yú)肌肉組織中肌細(xì)胞排列緊密、條紋清晰，細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣?；疾〈簏S魚(yú)肌細(xì)胞著色不均勻，大部分區(qū)域漿溶解，肌原纖維明顯斷裂、彎曲不齊，肌纖維間隙增大。

注：a. 健康魚(yú)；b. 患病魚(yú)。Notes：a.Healthy fish；b. Sick fish.

2.3 盾纖毛蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)

由圖5可知，蟲(chóng)體外形為飽滿的水滴狀，皮膜薄而無(wú)缺刻，頂端略尖，常向后背彎曲，后端渾圓，周身長(zhǎng)有纖毛，體排列稀疏；蟲(chóng)體大小約(20～35)μm×(10～20)μm，體內(nèi)具有多個(gè)2～5 μm 的圓形食物泡，細(xì)胞質(zhì)無(wú)色，顯微鏡下可見(jiàn)位于中央?yún)^(qū)的不透明大核，呈圓形，體后端含有一個(gè)透明的伸縮泡和一根長(zhǎng)鞭毛。通過(guò)活體甲醛國(guó)定顯微鏡及掃描電鏡觀察，初步分析及推測(cè)該盾纖毛蟲(chóng)可能為水滴偽康纖蟲(chóng)(Pseudocohnilembuspersalinus)。

注：a. 甲醛固定顯微鏡觀察；b. 掃描電鏡觀察；c. 盾纖毛蟲(chóng)形態(tài)裂解過(guò)程。Notes：a. Formaldehyde fixed microscope；b. Scanning electron microscope；c. Morphological cleavage process of Scuticociliatida.

將肉湯培養(yǎng)基與盾纖毛蟲(chóng)混合連續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)盾纖毛蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)明顯變緩慢，而且出現(xiàn)盾纖毛蟲(chóng)原地打轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。當(dāng)培養(yǎng)2 d(圖5c-1)、3 d(圖5c-2)、4 d(圖5c-3)、5 d(圖5c-4)后，盾纖毛蟲(chóng)逐漸表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)緩慢且形態(tài)變形、開(kāi)始裂解的現(xiàn)象。培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，蟲(chóng)體裂解程度越大，直至蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)完全裂解，胞質(zhì)流出。連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中盾纖毛蟲(chóng)裂解形態(tài)變化如圖5c(1～4)所示。

3 討論

大黃魚(yú)是福建省重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類，其寄生蟲(chóng)病害主要有刺激隱核蟲(chóng)病[18]和單殖吸蟲(chóng)類本尼登蟲(chóng)病[19]，也有寄生于大黃魚(yú)的擬格拉夫渦蟲(chóng)病[20]，而關(guān)于大黃魚(yú)體內(nèi)感染寄生盾纖毛蟲(chóng)致病死亡的報(bào)道鮮有。通常感染盾纖毛蟲(chóng)病的魚(yú)類有牙鲆、大菱鲆、真鯛(Pagrusmajor)、花鱸(Lateolabraxmaculatus)、金槍魚(yú)(Thunnusspp.)、紅鰭東方鲀等海水魚(yú)類，一旦感染，均會(huì)造成嚴(yán)重的危害[12-13，21]。張善霹[8]首次報(bào)道了大黃魚(yú)因體表潰爛而大量死亡，并從體表病灶部分和內(nèi)臟觀察到大量盾纖毛蟲(chóng)。在相關(guān)研究[22]中，受到盾纖毛蟲(chóng)感染的魚(yú)類通常會(huì)出現(xiàn)體表黏液增多現(xiàn)象，并附著分布不規(guī)則的白色塊狀絮團(tuán)，患病魚(yú)消瘦、活力下降、易打圈式游動(dòng)，攝食量降低甚至絕食，這和本研究患病大黃魚(yú)出現(xiàn)的癥狀一致?；疾?yán)重的魚(yú)類體表和鰭基部會(huì)發(fā)紅或糜爛，魚(yú)鰓出血褪色、鰓蓋內(nèi)側(cè)紅腫，皮膚和皮下肌肉組織出血或壞死性潰瘍，此外有的病魚(yú)肝臟出血或糜爛，脾臟淤血、腫大，腸道松弛，腹腔積水，體內(nèi)和體表病灶處均出現(xiàn)大量寄生的盾纖毛蟲(chóng)[22-23]，這表明盾纖毛蟲(chóng)沒(méi)有明顯的宿主選擇性。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)患病大黃魚(yú)皮膚及皮下組織嚴(yán)重潰爛，鰓蓋發(fā)白充血，肌肉組織大部分區(qū)域的肌漿溶解，肌原纖維明顯斷裂、彎曲不齊，肌纖維間隙增大，肝臟組織中肝細(xì)胞增生，單核細(xì)胞增多，實(shí)質(zhì)細(xì)胞變大，結(jié)締組織的嗜堿性減弱；但僅有體表病灶處發(fā)現(xiàn)寄生的盾纖毛蟲(chóng)，體內(nèi)組織未發(fā)現(xiàn)明顯病變和盾纖毛蟲(chóng)。本實(shí)驗(yàn)大黃魚(yú)感染盾纖毛蟲(chóng)的主要部位是體表，可能是在購(gòu)買魚(yú)苗時(shí)，人員的挑選、搬動(dòng)導(dǎo)致了機(jī)體損傷，而在傷口尚未愈合時(shí)，運(yùn)輸造成的應(yīng)激反應(yīng)和實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水的飼養(yǎng)使盾纖毛蟲(chóng)侵入大黃魚(yú)體表受損部位、水質(zhì)被污染，進(jìn)而造成盾纖毛蟲(chóng)傳染性的傳播。本次大黃魚(yú)病害病程短，表明該蟲(chóng)擁有極強(qiáng)的繁殖力、傳染性，應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水養(yǎng)殖大黃魚(yú)者的廣泛關(guān)注。

盾纖毛蟲(chóng)病是室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖和海上網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚(yú)類常見(jiàn)的體內(nèi)寄生的纖毛蟲(chóng)疾病，其主要在小魚(yú)、中等大小的魚(yú)中發(fā)病，且魚(yú)體規(guī)格越小，發(fā)病率越高，有調(diào)查顯示盾纖毛蟲(chóng)病在小于10 cm魚(yú)的總發(fā)病率約為86.4%，常見(jiàn)發(fā)生于鲆鰈魚(yú)、鯛鱸魚(yú)、金槍魚(yú)、紅鰭東方鲀等養(yǎng)殖魚(yú)類，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。盾纖毛蟲(chóng)疾病的病原體主要有海洋尾絲蟲(chóng)(Uronemamarinum)、暗尾絲蟲(chóng)(Uronemanigricans)、舌齒鱸嗜污蟲(chóng)(Philasteridesdicentrarchi)、高鹽擬康纖蟲(chóng)(Pseudocohnilembuspersalinus)、水滴偽康纖蟲(chóng)、貪食邁阿密蟲(chóng)、指狀擬舟蟲(chóng)(Paralembusdigitiformis)、喙突擬梭蟲(chóng)(Paralembusrostratus)、蟹棲異阿腦蟲(chóng)、巨大擬阿腦蟲(chóng)(Paranophysmagna)等[13]。本次發(fā)現(xiàn)寄生于大黃魚(yú)體表的盾纖毛蟲(chóng)病原體經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為水滴偽康纖蟲(chóng)，但還需使用分子學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步的探究。