安寧 許濤 張曉霞 楊濤 許美霞

(華中科技大學同濟醫(yī)學院 1附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉與危重病研究所,湖北 武漢 430022;2武漢市第四醫(yī)院重癥醫(yī)學科)

在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)早期即出現(xiàn)肺纖維化,但其具體的機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),ARDS肺纖維化的發(fā)生與肺泡上皮細胞再生障礙、纖維蛋白代謝異常、血管生成反應增強等有關(guān)外,肺成纖維細胞增殖是肺纖維化的關(guān)鍵因素〔1～5〕。線粒體融合蛋白(Mfn)2是近年新發(fā)現(xiàn)的一種增殖抑制基因,其憑借結(jié)構(gòu)和功能上的特征,參與調(diào)控多種細胞的增殖、凋亡等生物學過程。本研究通過轉(zhuǎn)染攜帶不同Mfn2基因片段腺病毒,探討Mfn2基因影響肺成纖維細胞增殖抑制ARDS肺纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1試劑與材料 人胚肺成纖維細胞(HELF)購于中國科學院細胞資源庫。脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司,考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所,Sircol膠原測定試劑盒購于英國Biocolor公司,rMfn2多克隆抗體及二抗購于GenWay Biotech Inc公司,Ras、Raf-1多克隆抗體、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)單克隆抗體(來源于兔)購自Abcam公司,抗兔二抗購自武漢博士德生物有限公司,引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務有限公司合成。

1.2HELF的培養(yǎng) 取HELF細胞株,用含體積分數(shù)10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞,每12 h更換新的培養(yǎng)基,每5～6 d傳代1次,取對數(shù)生長期細胞備用。

1.3腺病毒重組體構(gòu)建及感染 Mfn2基因開放讀碼框編碼含有757個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),包括N端三磷酸鳥苷(GTP)酶結(jié)構(gòu)域(aa1-264)、C端跨膜區(qū)(aa265-757)。通過構(gòu)建腺病毒重組體Adv-Mfn21-264-綠色熒光蛋白(GFP)、Adv-Mfn2265-757-GFP、Adv-Mfn21-757-GFP分別轉(zhuǎn)染肺成纖維細胞,使其分別過表達Mfn2的N端GTP酶結(jié)構(gòu)域(aa1-264)、C端跨膜區(qū)(aa265-757)及Mfn2的全長氨基酸(aa1-757)。腺病毒重組體Adv-Mfn21-264-GFP、Adv-Mfn2265-757-GFP、Adv-Mfn21-757-GFP及腺病毒空載體Adv-vector由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務有限公司構(gòu)建并測序鑒定。

1.4實驗分組 將HELF分為:Control組、Adv-vector組、LPS組、Adv-Mfn21-264-GFP組、Adv-Mfn2265-757-GFP組、Adv-Mfn21-757-GFP組。Control組:予以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;Adv-vector組:用含100 MOI腺病毒載體Adv-vector培養(yǎng)48 h后,DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h;LPS組:模型組給予5 μg/ml LPS+培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h;Adv-Mfn21-264-GFP組:含100 MOI腺病毒載體Adv-Mfn21-264培養(yǎng)48 h后,經(jīng)驗證過表達Mfn2的N端GTP酶結(jié)構(gòu)域(aa1-264),繼續(xù)LPS(濃度5 μg/ml)、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;Adv-Mfn2265-757-GFP組:含100 MOI腺病毒載體Adv-Mfn2265-757培養(yǎng)48 h,經(jīng)驗證過表達Mfn2的C端跨膜區(qū)(aa265-757),繼續(xù)LPS(濃度5 μg/ml)、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;Adv-Mfn21-757-GFP組:含100 MOI腺病毒載體Adv-Mfn21-757培養(yǎng)48 h,經(jīng)驗證過表達Mfn2的全長氨基酸(aa1-757),繼續(xù)LPS(濃度5 μg/ml)、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.5噻唑藍(MTT)法檢測HELF增殖情況 取對數(shù)生長期HELF以5×104接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),按分組分別誘導處理之后,每組樣本設(shè)4個復孔,置入培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h。吸棄舊的培養(yǎng)液,每孔分別加20 μl 的MTT,孵育4 h后,吸出上清液,加入100 μl的二甲基亞砜(DMSO),震蕩20 min,在570 nm的波長下,用多功能酶標儀測量光密度(OD)值。

1.6HELF細胞內(nèi)膠原蛋白含量的測定 各組細胞體外培養(yǎng)約24 h后,提取細胞內(nèi)總蛋白,考馬斯亮藍法檢測細胞內(nèi)總蛋白水平,使用Sircol膠原試劑盒檢測細胞內(nèi)膠原蛋白水平,根據(jù)公式〔細胞內(nèi)膠原蛋白含量(μg/mg Prot)=待測樣本的細胞膠原含量(μg/ml)/待測樣本的細胞總蛋白含量(mg/ml)〕計算出細胞內(nèi)膠原蛋白水平在細胞內(nèi)總蛋白水平中變化比例。

1.7Western印跡檢測Raf-1、ERK1/2蛋白表達水平 收集各組待測細胞,裂解液提取總蛋白后,用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF)上,封閉液室溫封閉1 h,用5%脫脂奶粉溶液按 1∶1 000 稀釋兔抗Ras抗體,1∶700稀釋兔抗Raf抗體,1∶400稀釋兔抗ERK1/2抗體,室溫下孵育120～150 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜后,加入1∶2 000稀釋的二抗,孵育2 h,經(jīng)PBS再次洗膜后,用電化學發(fā)光(ECL)顯影。

1.8實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測Ras、Raf-1、Erk1/2基因的表達水平 收集各組細胞,使用Trizol試劑提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA反轉(zhuǎn),逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作模板,GAPDH為內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄cDNA的反應條件:25 ℃ 5 min,50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,4 ℃ 10 min;RT-qPCR條件:第一循環(huán)50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。繪制溶解曲線,最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進行分析。引物序列:GAPDH正義鏈5′-CCCATCTAT GAGGGTTACGC-3′、反義鏈5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′;Ras正義鏈5′-ATTTGCCATCAACAACACCA-3′、反義鏈5′-GAGCAGCCAGGTCACACTT-3′;Raf-1正義鏈5′-CATCAACAACCGAGACCAGA-3′、反義鏈5′-CAGTCAGCCACCAACCTCTT-3′;Erk1/2正義鏈5′-CTTCCAACCTCCTGCTGAAC-3′、反義鏈5′-TCTGTCAAG AACCCTGTGTGA-3′。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行方差分析,兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1MTT法觀察肺成纖維細胞增殖情況 Control組與Adv-vector組細胞增殖水平無明顯差異(P>0.05);與Control組比較,LPS組第2、3、4、5、6天細胞增殖水平均明顯增加(P<0.01);轉(zhuǎn)染不同Mfn2基因片段后,與LPS組比較,Adv-Mfn21-264-GFP組、Adv-Mfn2265-757-GFP組、Adv-Mfn21-757-GFP組肺成纖維細胞增生受到抑制,細胞增殖水平明顯下降(P<0.01)。見表1。

表1 各組HELF細胞增殖情況值,n=3)

2.2HELF細胞內(nèi)膠原蛋白的含量變化 與Control組比較,LPS組膠原蛋白含量明顯增加(P<0.01);與LPS組比較,Adv-Mfn21-264-GFP組、Adv-Mfn2265-757-GFP組、Adv-Mfn21-757-GFP組細胞內(nèi)膠原蛋白含量明顯下降(P<0.01)。見表2。

2.3肺成纖維細胞Ras、Raf-1、ERK1/2蛋白及mRNA表達情況 與Conttrol組相比較,LPS組Ras、Raf-1、ERK1/2蛋白及mRNA表達明顯增加(P<0.01),轉(zhuǎn)染不同Mfn2基因片段后,與LPS組比較,Adv-Mfn21-264-GFP組、Adv-Mfn2265-757-GFP組、Adv-Mfn21-757-GFP組Ras、Raf-1、ERK1/2蛋白及mRNA表達明顯減少(均P<0.01)。見表2、圖1。

表2 各組細胞內(nèi)膠原蛋白含量、Ras、Raf-1及ERK1/2蛋白及mRNA表達水平

1～6:Control組、Adv-vector組、LPS組、Adv-Mfn21-264-GFP組、Adv-Mfn2265-757-GFP組、Adv-Mfn21-757-GFP組圖1 各組細胞Ras、Raf-1及Erk1/2蛋白的表達水平

3 討 論

Mfn2分布廣泛,其功能除介導線粒體融合外,還參與細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖及凋亡等生物學過程〔6,7〕。研究發(fā)現(xiàn),在血管平滑肌細胞(VSMC)異常增殖性疾病如高血壓,平滑肌細胞中的Mfn2表達顯著降低,而上調(diào)Mfn2表達可抑制VSMC的增殖〔8〕。在心肌纖維化疾病中,Mfn2可抑制氣道成纖維細胞增殖并誘導其凋亡〔9〕。同時研究發(fā)現(xiàn),Mfn2低表達與膀胱癌等腫瘤性疾病密切相關(guān)〔10〕。這些研究結(jié)果表明,Mfn2可以抑制多種細胞的增殖。前期研究〔11〕亦發(fā)現(xiàn),過表達Mfn2可抑制成纖維細胞的增殖,但其具體的效應結(jié)構(gòu)尚不清楚。而本研究結(jié)果提示,Mfn2的N端GTP酶結(jié)構(gòu)域、C端跨膜區(qū)可能均參與成纖維細胞增殖的調(diào)控。

Ras基因編碼4種高度保守的Ras蛋白,其活性通過與GTP或二磷酸鳥苷(GDP)結(jié)合進行調(diào)節(jié)。Ras是調(diào)節(jié)細胞生長及增殖的重要蛋白,其下游主要信號通路包括Ras-Raf-ERK1/2、Ras-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)及RalGEF,其中Ras-Raf-ERK1/2與細胞增殖功能密切相關(guān)。當Ras突變或被上游信號激活處于持續(xù)活化狀態(tài)時,它可激活下游效應蛋白,引起細胞異常增殖,甚至導致腫瘤發(fā)生〔6〕。Mfn2的N端GTP酶結(jié)構(gòu)域與Ras有相似的分子結(jié)構(gòu),而Mfn2的C端的跨膜區(qū)與Ras效應蛋白NORE1A有57%同源性,這些特殊結(jié)構(gòu)為Mfn2與Ras信號通路相互作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn),Mfn2的N端p21ras共有模體與Ras結(jié)合,通過Ras-Raf-ERK1/2細胞信號通路抑制B細胞淋巴瘤細胞的增殖〔12〕。在小鼠胚胎成纖維細胞中,Mfn2與Ras結(jié)合后抑制Ras蛋白活化,使下游Raf及ERK1/2失活,而剔除p21ras結(jié)構(gòu)后,Mfn2喪失了上述效應〔12,13〕。在VSMC和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中過表達Mfn2,Raf及ERK1/2水平下降〔14,15〕。這些研究提示,Mfn2可通過Ras-Raf-ERK1/2影響細胞增殖。我們前期通過Co-IP蛋白免疫共沉淀法檢測發(fā)現(xiàn)Mfn2可能通過與Ras結(jié)合抑制肺成纖維細胞增殖〔16〕。本研究結(jié)果提示,Mfn2的N端GTP酶結(jié)構(gòu)域、C端跨膜區(qū)均可通過調(diào)控Ras-Raf-ERK1/2信號通路影響成纖維細胞異常增殖,但具體的氨基酸相互作用關(guān)鍵位點后期仍需進一步研究。