王緒臻 王曉華 李曉燕 黃雯靜

(濟南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病風(fēng)濕科,山東 濟南 271100)

糖尿病腎病是糖尿病并發(fā)癥之一,腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細胞凋亡等均可造成腎小管上皮細胞損傷〔1,2〕。中藥具有毒副作用小與藥效良好等特點,并可減緩糖尿病腎病的發(fā)展進程〔3,4〕。葛根屬于豆科植物野葛干燥根部,研究表明葛根異黃酮可減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷〔5〕。但葛根異黃酮與糖尿病腎病相關(guān)研究報道相對較少。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在多種疾病發(fā)生及發(fā)展中可發(fā)揮重要調(diào)控作用,研究表明,LncRNA TTTY15在缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞中表達上調(diào)〔6〕。但TTTY15在糖尿病腎病中的作用尚未可知。本研究旨在探討葛根異黃酮對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 葛根購自亳州市億弘堂藥業(yè)有限公司;人腎小管上皮細胞HK-2購自上海通派生物;噻唑藍(MTT)試劑與細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物;si-NC、si-TTTY15、pcDNA、pcDNA-TTTY15購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-10檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物。

1.2葛根異黃酮提取〔7〕稱取葛根15 g,加入70%、95%乙醇75 ml,加熱回流3次,2 h/次,收集濾液后減壓蒸餾,回收乙醇,濃縮至干,葛根異黃酮濃度為69.6 mg/g,加入二甲基亞砜(DMSO)溶解后稀釋,濃度分別為50、100、200 μg/ml。

1.3實驗分組 HK-2細胞接種于6孔板(1×104個/孔)后加入含有濃度為30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h〔8〕,記為HG組。NG組用含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基處理。分別加入含有不同濃度(50、100、200 μg/ml)葛根異黃酮與含有濃度為30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為HG+葛根異黃酮L組、HG+葛根異黃酮M組、HG+葛根異黃酮H組。將si-NC、si-TTTY15分別轉(zhuǎn)染至HK-2細胞,用含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為HG+si-NC組、HG+si-TTTY15組。將pcDNA、pcDNA-TTTY15分別轉(zhuǎn)染至HK-2細胞,再用含200 μg/ml葛根異黃酮與30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為HG+葛根異黃酮+pcDNA組、HG+葛根異黃酮+pcDNA-TTTY15組。

1.4MTT檢測細胞增殖 96孔板中接種各組細胞(1×103/孔),每孔加入MTT溶液20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)基,加入150 μl DMSO,避光振蕩孵育5 min,酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(A490 nm)并計算細胞增殖抑制率〔(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100%〕。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌各組HK-2細胞,加入500 μl結(jié)合緩沖液,凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。

1.6利用試劑盒檢測SOD活性與MDA水平 裂解各組HK-2細胞,取細胞裂解液,檢測SOD活性、MDA水平。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測TNF-α、IL-1β、IL-10水平 取各組HK-2細胞培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說明檢測TNF-α、IL-1β、IL-10水平。

1.8qRT-PCR檢測TTTY15表達水平 采用Trizol試劑分別提取各組HK-2細胞總RNA,RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行擴增,應(yīng)用熒光定量PCR儀檢測TTTY15表達量。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1葛根異黃酮對高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷的影響 與NG組比較,HG組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與HG組比較,HG+葛根異黃酮L組、HG+葛根異黃酮M組、HG+葛根異黃酮H組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性,見圖1、表1。

2.2葛根異黃酮對高糖誘導(dǎo)的HK-2中TTTY15表達的影響 與NG組比較,HG組TTTY15表達顯著升高(P<0.05);與HG組比較,HG+葛根異黃酮L組、HG+葛根異黃酮M組、HG+葛根異黃酮H組TTTY15表達顯著降低(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表1。

圖1 葛根異黃酮抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡

2.3葛根異黃酮對高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激的影響 與NG組比較,HG組MDA、TNF-α、IL-1β的水平顯著升高,SOD活性和IL-10水平顯著降低(P<0.05);與HG組比較,HG+葛根異黃酮L組、HG+葛根異黃酮M組、HG+葛根異黃酮H組MDA、TNF-α、IL-1β水平顯著降低,SOD活性和IL-10水平顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性,見表1。

表1 葛根異黃酮對高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷、TTTY15表達及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的影響

2.4沉默TTTY15對高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷氧化應(yīng)激的影響 與HG+si-NC組比較,HG+si-TTTY15組細胞增殖抑制率、細胞凋亡率及MDA、TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.05),SOD活性和IL-10水平顯著升高(P<0.05),見表2、圖2。

表2 沉默TTTY15對高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷氧化應(yīng)激的影響

圖2 沉默TTTY15抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡

2.5過表達TTTY15對葛根異黃酮處理的高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷的影響 與HG+葛根異黃酮+pcDNA組比較,HG+葛根異黃酮+pcDNA-TTTY15組細胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖3、表3。

2.6過表達TTTY15對葛根異黃酮處理的高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激的影響 與HG+葛根異黃酮+pcDNA組比較,HG+葛根異黃酮+pcDNA-TTTY15組MDA、TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05),SOD活性和IL-10水平顯著降低(P<0.05),見表3。

圖3 過表達TTTY15可減弱葛根異黃酮對 高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡的作用

表3 過表達TTTY15可減弱葛根異黃酮對高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷及氧化應(yīng)激的作用

3 討 論

中藥及其活性成分具有抗炎、抗氧化等作用,并可減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷〔9〕。LncRNA可充當(dāng)miRNA競爭性內(nèi)源RNA分子參與糖尿病腎病發(fā)生及發(fā)展過程〔10,11〕。葛根異黃酮可抑制氧化應(yīng)激而保護糖尿病小鼠〔12〕。葛根異黃酮可促進軟骨細胞增殖而抗軟骨退變〔13〕。葛根可通過抑制炎癥及氧化應(yīng)激從而減輕結(jié)腸炎損傷〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn),葛根異黃酮可促進高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞增殖及抑制細胞凋亡、氧化應(yīng)激,與相關(guān)文獻報道結(jié)果相似〔15〕。本研究還提示,葛根異黃酮可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)從而減輕細胞損傷,與相關(guān)報道結(jié)果相似〔16〕。TTTY15在缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞中呈高表達,敲低其表達可減輕神經(jīng)細胞損傷〔17〕。TTTY15高表達可促進缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷〔18〕。敲低TTTY15表達可減輕心肌缺血再灌注損傷〔19〕。本研究提示,葛根異黃酮可能通過抑制TTTY15表達而減緩糖尿病腎病的發(fā)展進程。

綜上,葛根異黃酮可通過抑制TTTY15表達而促進高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷,TTTY15可為糖尿病治療藥物的研發(fā)提供新方向,還可為揭示葛根異黃酮治療糖尿病腎病的作用機制奠定實驗基礎(chǔ)。但葛根異黃酮治療糖尿病腎病的潛在作用機制及其是否可用作臨床用藥均尚需探究。