馬曉惠 王增強(qiáng) 程曉蕾 毛婷婷 陳宏

(天津市人民醫(yī)院皮膚科,天津 300121)

銀屑病是由免疫介導(dǎo)的嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量的慢性、炎癥性、復(fù)發(fā)性、系統(tǒng)性疾病〔1〕。其發(fā)病機(jī)制尚未明確,遺傳、免疫、環(huán)境、精神等因素均可能是其發(fā)病因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病可能與角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和新生血管的形成有關(guān)〔2〕。銀屑病皮損處存在血管異常和微循環(huán)障礙,而銀屑病的病理過程最早發(fā)生于真皮血管的異常增生〔3〕,所以對(duì)銀屑病機(jī)制的研究越來越多的集中在血管新生對(duì)銀屑病的影響。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β1具有免疫抑制作用,是角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)的負(fù)調(diào)控因子,通過 TGFβ1/活化素受體樣激酶(ALK)1/Smad同源物1/5重組蛋白(Smad1/5)途徑參與新生血管形成〔4〕。銀屑病、傷口愈合障礙、瘢痕形成及皮膚腫瘤等多種皮膚病的發(fā)病機(jī)制均與TGFβ1表達(dá)異常有關(guān)〔5〕。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)一方面可通過改變細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性,促進(jìn)血管的新生。另一方面,CTGF也可以促進(jìn)膠原蛋白合成,進(jìn)而合成ECM,支持新形成的血管床結(jié)構(gòu)〔6〕。CTGF是TGFβ1的下游介質(zhì),CTGF與TGFβ1具有較為相似的生物學(xué)特征并相互作用〔7〕。

有研究報(bào)道,祛風(fēng)清熱涼血方對(duì)尋常型銀屑病血熱毒熱證患者療效確切,但其作用機(jī)制尚不清楚〔8〕。本研究通過分析銀屑病面積嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評(píng)分及外周血中CTGF、TGFβ1水平以探討祛風(fēng)清熱涼血方治療銀屑病的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1病例診斷及入選標(biāo)準(zhǔn) 選取2018年1月至2019年7月天津市人民醫(yī)院皮膚性病科就診患者40例(治療組),依據(jù)中國(guó)銀屑病診療指南(2018完整版)〔9〕制定的尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn),治療前1個(gè)月未服用或外用其他治療銀屑病藥物者。男25例,女15例,年齡23～78歲,平均(45.50±17.26)歲。8 w后隨訪治療組20例,失訪率約為50%,失訪原因涉及皮損消退及病情好轉(zhuǎn)自動(dòng)停用中藥、旅居外地、更改其他治療方案等。健康對(duì)照組20 例,均來自同期在天津市人民醫(yī)院體檢的正常健康人,其中男11例,女9例,年齡24～59歲,平均年齡(33.90±8.78)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。入組對(duì)象均簽署知情同意書,且本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。

1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)重的心肺功能不全、嚴(yán)重的心律失常者;合并嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、自身免疫病、肝、腎、神經(jīng)、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者;妊娠、哺乳期婦女;嚴(yán)重內(nèi)臟功能不全、傳染性疾病;對(duì)本課題中藥制劑過敏者;中重度抑郁或精神病患者等不能配合治療方案者。退出實(shí)驗(yàn):不按規(guī)定按時(shí)服藥者;自行合并使用對(duì)研究治療有影響藥物的受試者;因嚴(yán)重不良事件必須停止治療者;無不良反應(yīng)但因其他原因而中斷治療者。

1.3標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)CTGF、TGFβ1在兩組中的表達(dá)。染色步驟按照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)試劑盒方法,磷酸鹽緩沖液(PBS)液代替一抗作陰性對(duì)照。 一抗為兔抗人CTGF多克隆抗體(工作濃度為1∶300)及兔抗人TGFβ1多克隆抗體(工作濃度為1∶200)。 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,抗原修復(fù)10 min (98 ℃),5 ml/L過氧化氫封閉30 min(37 ℃),山羊血清封閉30 min (37 ℃),一抗過夜(4 ℃),二抗30 min(37 ℃),三抗30 min(37 ℃),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色3 min,蘇木素染色4 min,鹽酸酒精分化5 s,自來水沖洗40 min,脫水、透明、封片。以健康對(duì)照組皮膚組織為陰性對(duì)照。用顯微鏡(OLYMPUS BX51)采集圖片,用圖像分析軟件(Image-Pro Plus6.0)測(cè)定陽性細(xì)胞光密度值及染色面積。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野(400倍)分別測(cè)定記錄陽性細(xì)胞的累積光密度值(IOD)和面積(area)值,計(jì)算出平均光密度(IOD/area)值,平均光密度值越大代表兩因子相對(duì)表達(dá)量越高。

1.4治療方法 治療組給予中藥湯劑祛風(fēng)清熱涼血方,方藥組成:赤芍10 g,金銀花15 g,黃柏10 g,白茅根20 g,炒牛蒡子10 g,生地20 g,連翹15 g,知母10 g,黃芩10 g,白鮮皮10 g,玄參10 g,苦參10 g,荊芥15 g,升麻2.5 g,甘草5 g,防風(fēng)10 g。每日1劑,水煎分早晚2次溫服。連續(xù)治療8 w。同時(shí)配合鹵米松,卡泊三醇外用。治療前,治療4、8 w后各抽血樣離心的血清,另收集健康對(duì)照組外周血清保存于-80 ℃冰箱。

1.5療效評(píng)判 皮損情況根據(jù)PASI評(píng)分法評(píng)分,治療前及治療4、8 w后分別進(jìn)行1次PASI評(píng)分。分值0～72分〔10〕。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 參照Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)說明書進(jìn)行總RNA的提取。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(美國(guó)Thermo公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再進(jìn)行qPCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物序列:GAPDH正義:5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′,反義:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,CTGF正義:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,反義:5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′,TGFβ1正義:5′-ACACCAACTATTGCTTCAG-3′,反義:5′-ACAC CAACTATTGCTTCAG-3′。采用熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行相對(duì)定量分析。GAPDH作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt公式對(duì)CTGF、TGFβ1基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)計(jì)算。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7CTGF、TGFβ1水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),操作步驟按試劑盒說明書。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組CTGF、TGFβ1表達(dá) 健康對(duì)照組CTGF和TGFβ1在表皮全層及真皮中通常無表達(dá)或較低表達(dá);治療組皮損組織中CTGF和TGFβ1呈顯著高表達(dá)(P<0.001),可見表皮角化不全,棘細(xì)胞層明顯增厚,真皮毛細(xì)血管增生。見圖1、表1。

圖1 兩組皮膚組織GTFG、TGFβ1表達(dá)(免疫組化染色)

表1 兩組皮膚組織CTGF及TGFβ1表達(dá)比較

2.2祛風(fēng)清熱涼血方可降低尋常型銀屑病患者PASI評(píng)分 治療組經(jīng)祛風(fēng)清熱涼血方治療4、8 w后PASI評(píng)分較首診顯著下降(t=9.162、12.556,均P<0.05)。見表2。

2.3祛風(fēng)清熱涼血方可降低尋常型銀屑病患者外周血CTGF、TGFβ1表達(dá) 治療組首診和治療4 w血清中CTGF、TGFβ1表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05),首診、治療4、8 w CTGF、TGFβ1表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì),治療4 w與首診,治療8 w與首診相比,差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示,首診、治療4、8 w治療組CTGF、TGFβ1 mRNA明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05),且治療4、8 w顯著低于首診(P<0.05)。見表2。

表2 治療組首診、治療4、8 w PASI評(píng)分及兩組CTGF、TGFβ1表達(dá)比較

2.4CTGF、TGFβ1表達(dá)水平與尋常型銀屑病患者PASI評(píng)分相關(guān)性 尋常型銀屑病患者CTGF與TGFβ1呈顯著正相關(guān)(r=0.802),外周血CTGF表達(dá)水平(r=0.903)、TGFβ1表達(dá)水平與PASI評(píng)分均呈顯著正相關(guān)(r=0.545,均P<0.001)。

3 討 論

銀屑病是以局限或全身分布的鱗屑性紅斑或斑塊為典型臨床表現(xiàn),銀屑病皮損的組織病理表現(xiàn)為表皮角化過度、角化不全、棘層肥厚,真皮乳頭血管擴(kuò)張和淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)〔11〕。故多數(shù)研究認(rèn)為其發(fā)病與角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和新生血管的形成有關(guān),且最先發(fā)生病變的為微血管的形成,而隨著疾病的緩解這種血管新生的病理改變也會(huì)隨之消退〔12〕。

CTGF是血管重構(gòu)的必要因子,本研究結(jié)果顯示,尋常型銀屑病患者血清中CTGF呈高表達(dá),且隨著病情的好轉(zhuǎn),CTGF的表達(dá)亦逐漸下降?？紤]其機(jī)制可能由于CTGF的高表達(dá),從而促進(jìn)了血管新生,導(dǎo)致并加重了銀屑病的皮損〔13〕。TGFβ1可以通過刺激成纖維細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)血管新生及舒張,從而參與銀屑病的發(fā)生〔14〕。報(bào)道顯示TGFβ1能夠通過對(duì)Smads通路的激活而提升CTGF的表達(dá)量,CTGF表達(dá)上調(diào)則會(huì)進(jìn)一步激活TGFβ1和增強(qiáng)其的生物學(xué)效應(yīng)〔7〕。

銀屑病屬中醫(yī)學(xué)“白疕”范疇,本方由祛風(fēng)清熱解毒藥和涼血活血藥組成,現(xiàn)代藥理研究表明,祛風(fēng)清熱解毒類中藥具有抗菌消炎,調(diào)節(jié)免疫和抑制表皮細(xì)胞過度增殖作用〔15〕。涼血活血類中藥具有促進(jìn)組織的修復(fù)與再生,調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞因子的水平和抗血管新生的作用〔16〕。之前的研究發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)清熱涼血方治療能夠明顯改善銀屑病患者的PASI評(píng)分,中藥辨證治療銀屑病療效肯定〔9〕,但是由于缺乏足夠的現(xiàn)代分子生物學(xué)證據(jù)得不到廣泛推廣和運(yùn)用。 本研究顯示隨著中藥?kù)铒L(fēng)清熱涼血方對(duì)患者癥狀和證候的改善,外周血CTGF、TGFβ1表達(dá)水平下調(diào),這意味著祛風(fēng)清熱涼血方可能通過介導(dǎo)銀屑病患者CTGF、TGFβ1的表達(dá)下調(diào)發(fā)揮治療作用,推測(cè)中藥可能通過抑制血管新生相關(guān)因子,從而糾正銀屑病患者天然免疫功能紊亂,抑制變態(tài)免疫反應(yīng),進(jìn)而抑制銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,達(dá)到治療作用。但這些推測(cè)有待進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究探索相關(guān)因子作用通路,以確定血管新生在銀屑病中的確切機(jī)制及中藥的具體作用靶點(diǎn)。