鄧明 鄧芳 陳志堅

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405;2香港大學(xué)深圳醫(yī)院中醫(yī)科;3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)

胃癌具有早期癥狀不明顯、起病隱匿的特點,患者確診時,大多數(shù)疾病已進(jìn)入晚期,并伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移,使胃癌的防治變得困難〔1〕。此外,化療藥物大多具有較強(qiáng)的毒副作用,限制了其應(yīng)用〔2〕。因此,開發(fā)療效強(qiáng)且副作用小的胃癌治療藥物具有重要意義。近年來,傳統(tǒng)中草藥及其活性成分因具有療效強(qiáng)、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢使其在腫瘤治療的應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注。龍膽苦苷(GP)是中草藥龍膽的主要活性成分,具有抗炎、保肝利膽等功效〔3〕。研究還顯示,GP可通過抑制核因子相關(guān)因子(Nrf)2信號通路的激活誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡,發(fā)揮抗卵巢癌作用〔4〕。但目前,GP對胃癌細(xì)胞惡性行為的影響和機(jī)制還未知。LINC00473是一種長鏈非編碼RNA(lncRNA),參與結(jié)直腸癌、食管鱗癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的發(fā)展進(jìn)程,影響放化療敏感性〔5～7〕。有報道稱,LINC00473在胃癌中表達(dá)增加,其高表達(dá)與臨床分期、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征關(guān)系密切,干擾其表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲,是胃癌治療的潛在分子靶點〔8〕。Starbase軟件預(yù)測顯示,miR-6838-5p可能LINC00473的下游靶點。胃癌細(xì)胞中miR-6838-5p表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-6838-5p通過靶向G蛋白調(diào)節(jié)誘導(dǎo)神經(jīng)突增生蛋白(GPRIN)3抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號通路進(jìn)而減弱胃癌細(xì)胞的惡性行為〔9〕。本研究以LINC00473/miR-6838-5p軸為切入點,探究GP對胃癌細(xì)胞HGC-27細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 HGC-27細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫;RPMI1640培養(yǎng)液、四甲基噻唑藍(lán)染色法(MTT)和胰蛋白酶購自北京索萊寶;龍膽苦苷,純度≥98%,購自上海源葉生物;胎牛血清購自浙江天杭;PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物);LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol(美國Invitrogen);LINC00473小干擾RNA(si-LINC00473)和過表達(dá)載體(pcDNA-LINC00473)、小干擾RNA陰性對照序列(si-NC)和空載體(pcDNA)、LINC00473野生型和突變型熒光素酶報告載體(WT-LINC00473、MUT-LINC00473)、miR-6838-5p模擬物(mimics)和對照序列(miR-NC)、引物序列均購自上海吉凱基因。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HGC-27細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),然后在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行進(jìn)一步實驗。

1.3MTT法檢測細(xì)胞增殖 2.5×104個HGC-27細(xì)胞接種于96孔板中,12 h后分為低(L)、中(M)、高(H)-GP組和對照(Control)組。L、M、H-GP組分別用終濃度為10、20、40 μmol/L〔10〕的GP培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,對照組常規(guī)培養(yǎng)24 h。然后,加MTT(5 g/L)20 μl,再培養(yǎng)4 h。加二甲基亞砜150 μl,混勻,酶標(biāo)儀測量490 nm處的光密度(OD)值。

1.4Transwell測定細(xì)胞遷移和侵襲 將HGC-27細(xì)胞(1.0×105個)再接種到涂有基質(zhì)膠的上腔中進(jìn)行侵襲實驗。在遷移實驗中,不加基質(zhì)膠,將HGC-27細(xì)胞(5.0×104個)注入上腔。上腔填充無血清培養(yǎng)基,下腔填充含10% FBS的培養(yǎng)基。24 h用4.0%多聚甲醛溶液固定Transwell腔15 min,再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min。使用顯微鏡(200倍鏡)獲得圖像并計數(shù)。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測LINC00473和miR-6838-5p基因表達(dá) 細(xì)胞接種和處理同1.3。用Trizol試劑從HGC-27細(xì)胞中提取總RNA,使用反向輔助第一鏈cDNA合成試劑盒對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。采用LightCycler?480 Real-Time PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR分析。引物序列:LINC00473上游5′-GCACACACAAGCACTCATGT-3′,下游5′-CAGCAGGCAGATTCCAAAGG-3′;GAPDH上游5′-GCCATCACAGCAACACAGAA-3′,下游5′-GCCATACCAGTAAGCTTGCC-3′;miR-6838-5p上游5′-GCACTCCTGGATGCCAATCT-3′,下游5′-CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC-3′;U6上游5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′。LINC00473、miR-6838-5p水平采用2-△△Ct法進(jìn)行定量分析。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將LipofectamineTM2000分別與si-LINC00473、si-NC、pcDNA-LINC00473、pcDNA、miR-6838-5p mimics或miR-NC混合均勻后,轉(zhuǎn)染至HGC-27細(xì)胞。24 h后,RT-qPCR測量LINC00473或miR-6838-5p表達(dá)以驗證轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染si-LINC00473、si-NC、miR-6838-5p mimics或miR-NC的細(xì)胞均用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng),記為si-LINC00473組、si-NC組、miR-6838-5p組、miR-NC組。轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC00473、pcDNA的細(xì)胞均用含GP終濃度為40 μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,記為H-GP+pcDNA-LINC00473組、H-GP+pcDNA組。然后分別按照1.3和1.4檢測細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

1.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CLINC00473與miR-6838-5p靶向關(guān)系 用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法分別與WT-LINC00473和miR-NC(或miR-6838-5p mimics)或MUT-LINC00473和miR-NC(或miR-6838-5p mimics)。24 h后收集并裂解細(xì)胞。離心(半徑10 cm,3 500 r/min,10 min)后取上清液,測量熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗或單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1GP對HGC-27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與Control組比較,不同劑量GP組HGC-27細(xì)胞OD值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低(P<0.05),且不同劑量GP組間各檢測指標(biāo)兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27中LINC00473和miR-6838-5p表達(dá)的影響 與Control組比較,不同劑量GP組HGC-27細(xì)胞中LINC00473表達(dá)顯著降低(P<0.05),miR-6838-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05),且不同劑量GP組間LINC00473和miR-6838-5p表達(dá)比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組HGC-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲數(shù)及LINC00473和miR-6838-5p表達(dá)

2.3敲減LINC00473對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移及侵襲的影響 轉(zhuǎn)染si-LINC00473的HGC-27細(xì)胞中LINC00473表達(dá)(0.22±0.03)顯著低于轉(zhuǎn)染si-NC的HGC-27細(xì)胞(1.01±0.04;t=47.400,P<0.05),說明轉(zhuǎn)染si-LINC00473的HGC-27細(xì)胞中LINC00473表達(dá)較轉(zhuǎn)染si-NC的HGC-27細(xì)胞敲減。si-LINC00473組HGC-27細(xì)胞OD值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著低于si-NC組(P<0.05)。見表2。

2.4上調(diào)miR-6838-5p對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移及侵襲的影響 miR-6838-5p組 HGC-27細(xì)胞中miR-6838-5p表達(dá)顯著高于miR-NC組(2.57±0.25 vs 1.02±0.04;t=18.366,P<0.05),說明轉(zhuǎn)染miR-6838-5p mimics的HGC-27細(xì)胞中miR-6838-5p表達(dá)較轉(zhuǎn)染miR-NC的HGC-27細(xì)胞上調(diào)。miR-6838-5p組HGC-27細(xì)胞OD值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見表2。

2.5過表達(dá)LINC00473逆轉(zhuǎn)GP對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲及miR-6838-5p表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC00473的HGC-27細(xì)胞中LINC00473表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA的細(xì)胞(3.56±0.13 vs 1.00±0.04,t=56.464,P<0.05),說明過表達(dá)LINC00473的HGC-27細(xì)胞構(gòu)建成功。與H-GP+pcDNA組比較,H-GP+pcDNA-LINC00473組HGC-27細(xì)胞OD值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.6LINC00473靶向負(fù)調(diào)控miR-6838-5p Starbase軟件預(yù)測顯示,LINC00473與miR-6838-5p存在結(jié)合位點。見圖1。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LINC00473與miR-6838-5p的HGC-27細(xì)胞熒光素酶活性(0.35±0.02)較共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-LINC00473與miR-NC的HGC-27細(xì)胞熒光素酶活性(0.99±0.07)顯著降低(t=26.373,P<0.05);共轉(zhuǎn)染MUT-LINC00473與miR-6838-5p的HGC-27細(xì)胞熒光素酶活性(0.97±0.07)較共轉(zhuǎn)染MUT-LINC00473與miR-NC的HGC-27細(xì)胞熒光素酶活性(1.00±0.05)顯著降低(t=1.046,P=0.311),說明LINC00473可靶向結(jié)合miR-6838-5p。此外,轉(zhuǎn)染si-LINC00473的HGC-27細(xì)胞中miR-6838-5p表達(dá)高于轉(zhuǎn)染si-NC的HGC-27細(xì)胞(2.53±0.22 vs 1.05±0.04;t=19.856,P<0.05),說明敲減LINC00473促進(jìn)HGC-27細(xì)胞中miR-6838-5p表達(dá)。

表2 各組癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移及侵襲比較

圖1 LINC00473與miR-6838-5p存在結(jié)合位點

3 討 論

GP是龍膽科龍膽屬植物龍膽的有效成分之一,屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類,具有抗炎、抗氧化等作用〔11〕。近年來研究還顯示,GP發(fā)揮一定的抗腫瘤作用,具有開發(fā)為抗腫瘤藥物的潛在價值。如Li等〔12〕研究顯示,GP可劑量依賴性阻滯卵巢癌SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制細(xì)胞遷移和侵襲,并發(fā)揮抗卵巢癌作用;趙忠偉等〔13〕研究顯示,GP對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程具有顯著抑制作用。本研究結(jié)果表明,GP對胃癌HGC-27細(xì)胞遷移、侵襲和增殖具有阻礙作用,提示其是一種很有前途的胃癌天然治療藥物。

lncRNA和微小RNA(miRNA)同屬于非編碼RNA,且lncRNA可以作為ceRNA競爭性海綿miRNA來調(diào)節(jié)mRNA表達(dá),二者均對腫瘤發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用。作為一種lncRNA,LINC00473在胰腺癌〔14〕、神經(jīng)膠質(zhì)瘤〔15〕和食管鱗狀細(xì)胞癌〔16〕等腫瘤中表達(dá)增高,干擾其表達(dá)能夠阻礙細(xì)胞的惡性行為,是腫瘤治療的潛在分子靶點。本研究顯示,敲減LINC00473顯著削弱了胃癌HGC-27細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,這與Zhang等〔8〕報道結(jié)果一致,提示LINC00473可能促進(jìn)胃癌進(jìn)展。本研究提示,GP可能通過降低LINC00473表達(dá)來抑制HGC-27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

同時,本研究結(jié)果顯示,LINC00473可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-6838-5p。miR-6838-5p在三陰性乳腺癌細(xì)胞呈低表達(dá),上調(diào)miR-6838-5p通過靶向抑制WNT3A阻礙三陰性乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程,miR-6838-5p可能為三陰性乳腺癌的治療提供了新靶點〔17〕。本研究結(jié)果表明,上調(diào)miR-6838-5p對胃癌HGC-27細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力具有顯著抑制作用,與Zhou等〔9〕報道結(jié)果一致,提示miR-6838-5p起抑癌基因作用抑制胃癌細(xì)胞惡性行為。此外,GP對胃癌細(xì)胞中miR-6838-5p的表達(dá)具有顯著促進(jìn)作用,而過表達(dá)LINC00473則逆轉(zhuǎn)了GP對HGC-27細(xì)胞中miR-6838-5p表達(dá)的促進(jìn)作用,進(jìn)一步提示GP通過調(diào)控LINC00473/miR-6838-5p軸抑制胃癌細(xì)胞惡性行為。

綜上所述,GP對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用,其可能通過抑制細(xì)胞中LINC00473表達(dá)進(jìn)而提高miR-6838-5p表達(dá)發(fā)揮作用,GP可能是治療胃癌高水平LINC00473的有效方法。本研究未來將通過動物實驗在體內(nèi)驗證GP的抗胃癌作用;同時,lncRNA調(diào)控的miRNA的靶基因?qū)ξ赴┌l(fā)生發(fā)展的影響也尚需進(jìn)一步探究。