牛勝男 王丹 陳紅旭 林慧嬌 王春梅 孫靖輝 孫紅霞 張成義 陳建光 李賀 敬舒

(北華大學(xué) 1藥學(xué)院,吉林 吉林 132000;2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3附屬醫(yī)院)

腸缺血再灌注(II/R)是一種由原發(fā)或繼發(fā)性腸道疾病引起的腸道組織缺血、缺氧,甚至壞死的綜合征〔1,2〕。腸組織在缺血再灌注過程中可經(jīng)由多種途徑釋放ROS,過量的ROS超過人體消除能力即引起氧化應(yīng)激而損害機(jī)體。另外,腸組織中多種細(xì)菌微生物可穿越腸屏障,并隨再灌注過程的血流到達(dá)其他組織器官,引起遠(yuǎn)隔組織發(fā)生炎癥反應(yīng)〔3,4〕。急性肺損傷(ALI)就是一種常見的II/R所致的遠(yuǎn)隔器官功能障礙,目前急需安全有效的治療方法。而基于其相關(guān)發(fā)生機(jī)制,以抗氧化及抗炎為靶點(diǎn)的天然產(chǎn)物治療已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。

華中五味子為木蘭科植物華中五味子的干燥成熟果實(shí),具備增益津液、斂肺止咳等功效〔5～7〕。安五脂素(Anwu)為華中五味子中的活性單體化合物〔8,9〕。研究表明,Anwu在過度疲勞及衰老等動(dòng)物模型中顯示出較強(qiáng)的抗氧化、抗炎等作用〔10～13〕。本課題組前期研究顯示,Anwu對II/R大鼠空腸及肝組織損傷具有顯著的保護(hù)作用〔14,15〕,但關(guān)于其對II/R致肺損傷的影響尚無研究。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及還原型谷胱甘肽(GSH)作為抗氧化酶發(fā)揮著重要的作用,丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化物降解的主要產(chǎn)物是氧化損傷程度的經(jīng)典標(biāo)志物〔16,17〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6及IL-1β是重要的促炎因子和炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物〔18,19〕。本實(shí)驗(yàn)從抗氧化及炎癥兩方面探討五味子Anwu對大鼠II/R致遠(yuǎn)隔肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1材料與儀器 雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量225～250 g,購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證編號:SCXK(吉)2018-0003);Anwu,四川省維克奇生物科技有限公司;SOD測定試劑盒、CAT測定試劑盒、GSH測定試劑盒、MDA測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;TNF-α、IL-6、IL-1β測定試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN集團(tuán)公司;FSH-2型高速勻漿機(jī)購自江蘇省金壇億通電子;LD5-10B高速離心機(jī)購自北京市離心機(jī)廠;超低溫冰箱(-80 ℃)購自日本SANY公司。

1.2動(dòng)物分組、給藥及模型建立 32只雄性SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham,僅剖腹手術(shù))組、II/R(II/R,缺血45 min+再灌注60 min)組、假手術(shù)+Anwu(Sham+Anwu,僅剖腹手術(shù),無缺血+Anwu預(yù)處理)組、II/R+Anwu(II/R+Anwu,缺血45 min+再灌注60 min+Anwu)組。Sham+Anwu組及II/R+Anwu組,給予Anwu(7 mg/kg)灌胃給藥,Sham組及II/R組灌胃給予與Sham+Anwu、II/R+Anwu組相同給藥體積的羧甲基纖維素鈉,1次/d,連續(xù)灌胃14 d。

給藥第13天灌胃后對大鼠進(jìn)行禁食處理,但飲水自由。于給藥第14天進(jìn)行造模處理。給藥第14天,選擇與前一天相同時(shí)間點(diǎn)灌胃給藥,以保證禁食時(shí)間達(dá)到24 h,灌胃60 min后,稱量大鼠體質(zhì)量,根據(jù)5 ml/kg的給藥體積及體質(zhì)量計(jì)算麻醉給藥量,選用濃度為10%的烏拉坦對大鼠進(jìn)行腹腔注射注射,深度麻醉后,于大鼠劍突下腹正中線處做約2 cm切口,暴露腸系膜上動(dòng)脈。Sham及Sham+Anwu組僅需分離腸系膜上動(dòng)脈。II/R和 II/R+Anwu 組在分離腸系膜上動(dòng)脈后,使用無創(chuàng)傷型動(dòng)脈夾對腸系膜上動(dòng)脈進(jìn)行夾閉處理,45 min后移除動(dòng)脈夾,恢復(fù)血液流動(dòng)即為再灌注階段,60 min后模型建立結(jié)束。摘取大鼠肺組織,生理鹽水漂洗干凈,吸干水分,以備生化指標(biāo)的檢測。

1.3組織病理學(xué)檢查 取各組肺組織,用濃度為10%甲醛溶液固定,然后用梯度乙醇脫水,石蠟包埋,切片(4 μm厚)。蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.4肺組織氧化相關(guān)生化指標(biāo)活性或含量檢測 取肺組織,加生理鹽水制備成10倍的勻漿稀釋液,以3 500 r/min離心10 min,收集上清液,用于檢測氧化相關(guān)生化指標(biāo)SOD、CAT、GSH、MDA的活性或含量。

1.5肺組織炎癥相關(guān)因子含量檢測 取大鼠肺組織,用生理鹽水制備成10倍的勻漿稀釋液,以3 500 r/min離心10 min,收集上清液,將所得的上清液用于檢測IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1組織病理學(xué)觀察 在光鏡下大鼠肺病理學(xué)變化,Sham組肺泡組織肺泡結(jié)構(gòu)無明顯變化,肺泡間隔無增厚,肺泡腔總體可見;而II/R組肺泡腔空隙狹小或無空隙,肺泡上皮細(xì)胞增厚,肺泡壁內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張,可見炎性細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增大;Sham+Anwu組與Sham組比較無顯著變化,II/R+Anwu組與II/R組相比,肺泡腔清晰可見,視野內(nèi)僅有較少的炎性細(xì)胞。見圖1。

2.2各組肺組織氧化相關(guān)生化指標(biāo)活性或含量檢測 II/R組肺組織的SOD、CATK活性及GSH含量均顯著低于Sham組,而MDA含量則顯著高于Sham 組(P<0.05);與II/R組比較,Sham+Anwu組及II/R+Anwu組肺組織SOD、CAT活性及GSH含量均顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表1。提示Anwu在II/R大鼠肺組織中顯示出顯著抗氧化作用,這可能是其保護(hù)大鼠肺損傷的原因之一。

2.3各組肺組織炎癥相關(guān)因子含量檢測 II/R組肺組織TNF-α、IL-6及IL-1β含量均明顯高于Sham組(P<0.05);與II/R組相比,Sham+Anwu組及II/R+Anwu組肺組織上述炎癥因子均顯著減少(P<0.01)。見表1。提示Anwu在II/R大鼠肺組織中顯示出顯著的抗炎作用,這可能是其保護(hù)大鼠肺損傷的另一原因。

圖1 各組肺組織病理(HE染色)

表1 各組肺組織中SOD、CAT、GSH活性及MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β含量

3 討 論

II/R損傷是臨床實(shí)踐中常見的人體組織器官破壞與急性血液循環(huán)障礙的病理生理機(jī)制之一。由于其特有的細(xì)菌組成、獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和代謝特征及重要的屏障作用,腸道亦是外傷、休克后肝臟、腦、肺臟等遠(yuǎn)隔器官功能受損的關(guān)鍵部位。研究顯示,II/R后腸道會發(fā)生一系列的病理生理改變,如產(chǎn)生游離基、膜脂過氧化、炎癥因子積聚、血管內(nèi)皮腫脹、細(xì)胞內(nèi)鈣失調(diào)、凋亡與壞死等〔20～22〕。腸管內(nèi)缺血后,腸黏膜屏障功能受損,腸道局部組織功能紊亂,加速了有害菌和內(nèi)毒素等物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán),巨噬細(xì)胞/單核系統(tǒng)進(jìn)一步活化,IL、TNF等細(xì)胞因子生成過量,從而引起全身性的非特異性炎癥反應(yīng),多器官功能衰竭和繼發(fā)性死亡〔23,24〕。

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致II/R損傷的兩種重要的相互關(guān)聯(lián)機(jī)制。當(dāng)活性氧破壞細(xì)胞膜時(shí),多不飽和脂肪酸及脂質(zhì)氧化變質(zhì)過程中降解產(chǎn)生主要物質(zhì)MDA,MDA能夠與游離狀態(tài)的氨基酸發(fā)生反應(yīng),進(jìn)而介導(dǎo)蛋白質(zhì)分子間與分子內(nèi)交聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞受損。SOD作為一種重要的抗氧化酶,能夠有效抑制機(jī)體氧化作用,對細(xì)胞損傷具有重要作用。GSH和CAT是分解H2O2的重要酶〔25〕。MDA、GSH、SOD和CAT可以反映機(jī)體氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是否平衡,是氧化損傷過程中的主要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前述報(bào)道是一致的。而給予Anwu后,大鼠肺組織相關(guān)氧化指標(biāo)得到顯著改善,提示Anwu可有效調(diào)節(jié)因II/R致大鼠肺組織損傷后的氧化與抗氧化之間的平衡,提高大鼠肺組織抗氧化能力,從而改善II/R肺損傷。

II/R損傷發(fā)生時(shí),大量的白細(xì)胞浸潤到肺組織中生成炎癥因子,毛細(xì)血管通透性增加,大量炎性因子如TNF-α,IL-6與IL-1β大量釋放〔26〕。TNF-α具有一因多效特性,可誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞活化,可啟動(dòng)炎性級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而加重病變區(qū)缺血再灌注損傷〔27〕。TNF-α還會通過刺激神經(jīng)膠質(zhì)等細(xì)胞,進(jìn)而誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子的合成、分泌和釋放。II/R后的炎癥損傷早期主要由促炎指標(biāo)TNF-α造成,進(jìn)而引起一系列加劇局部肺損傷的效應(yīng),激活嗜中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞,合成黏附分子及其他炎癥介質(zhì)(如IL-1β、IL-6等),加劇過氧化損傷〔28〕。本研究結(jié)果提示,Anwu可通過抑制炎癥發(fā)生,從而改善肺組織的微環(huán)境。

綜上,Anwu能夠改善II/R大鼠肺組織損傷,該作用與其在肺組織中發(fā)揮抗氧化及抗炎作用有關(guān)。