肖遙 胡有志 周健華 魯曉斌 肖金鳳 黃笑語 許方雷 華麗

(湖北省中醫(yī)院心內(nèi)科,湖北 武漢 430061)

冠心病常會引起心肌缺血、心泵功能受損等,是常見的心血管疾病〔1〕。隨著國內(nèi)老齡化的增加,冠心病可能會成為我國疾病死亡的首位原因〔2,3〕。心室重構(gòu)是冠心病產(chǎn)生與發(fā)展的主要原因〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)〔5〕,自噬在冠心病中發(fā)揮重要的作用。自噬可將細胞內(nèi)損傷、衰老的蛋白質(zhì)及損壞的細胞器進行消化、降解并清除,與心肌損傷聯(lián)系密切。心肌細胞凋亡可促進冠心病的發(fā)展,細胞凋亡分為線粒體途徑與死亡受體途徑。線粒體被激活后會釋放相關(guān)蛋白,可與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9等結(jié)合形成凋亡復(fù)合體,促進心肌細胞凋亡〔6〕。血府逐瘀合劑具有活血化瘀功效,對冠心病的治療已得到臨床證實〔7〕,但關(guān)于其具體治療機制,仍然需要深入了解。且其對于冠心病心室重構(gòu)、心肌細胞線粒體影響的相關(guān)文獻較少,具體研究機制尚不明確。本文探討血府逐瘀合劑通過抑制自噬對冠心病大鼠血管重塑及心肌細胞線粒體的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠50只,體質(zhì)量220～330 g,購于江蘇艾菱菲生物公司〔許可證號:SYXK(蘇)2019-0254〕,于實驗室常規(guī)飼養(yǎng)1 w。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理審查會批準(zhǔn)(批號:Y2019-010-21)。

1.2實驗試劑 血府逐瘀合劑中藥材(北京同仁堂);TUNRL工作液(武漢恒意賽生物公司);自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3抗體(LC3)Ⅱ一抗(上海信裕生物公司);辣根過氧化物酶二抗(北京博爾?？萍脊?;動物線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性定量測試試劑盒(上海哈靈生物公司)。

1.3血府逐瘀合劑制備 血府逐瘀合劑由桃仁70 g,紅花、當(dāng)歸、柴胡各60 g,生地黃50 g,枳殼40 g,川芎、赤芍、桔梗、甘草各30 g,牛膝20 g組成。按比例取藥材,清洗2次,加雙蒸水浸泡0.5 h后煎煮0.5 h,收集煎煮液,藥渣再加水煎煮20 min,合并煎煮液,濃縮至含生藥2 g/ml滅菌,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4模型建立、分組及給藥 取40只健康大鼠麻醉后連接心電圖儀,氣管插管并連接呼吸機,暴露心臟左冠狀動脈前降支根部,結(jié)扎該血管段,結(jié)扎成為標(biāo)志為心電圖 ST 段明顯改變及左室前壁表面發(fā)紺。術(shù)后每只大鼠均使用青霉素 8 U 抗感染 3 d。10只未進行建模的大鼠為健康組,40只模型大鼠分為模型組、中藥低組、中藥中組、中藥高組各10只,健康組與模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng),中藥低、中、高組依次分別給予血府逐瘀合劑10、20、40 g/kg灌胃。給藥治療1次/d,連續(xù)治療21 d。

1.5蘇木素-伊紅(HE)與Masson染色觀察心肌組織病理形態(tài) 將大鼠麻醉后處死,取出心肌組織,4%多聚甲醛固定,脫水,浸蠟,包埋,5 μm 切片,進行 HE、Masson 染色后,顯微鏡下觀察病理形態(tài)。

1.6TUNEL檢測心肌細胞凋亡情況 取各組大鼠心肌組織石蠟切片,脫水后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min,加入20 μg/ml的蛋白酶K溶液,23 ℃孵育0.5 h,PBS沖洗后,放入3%的H2O2,15 min后再次PBS沖洗,擦片后放入50 μl的TUNEL反應(yīng)液,37 ℃孵育1 h,PBS沖洗,加入50 μl轉(zhuǎn)化劑聚甲氧基二甲醚(POD),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,漂洗后蘇木素復(fù)染,0.2%氨水反藍,晾干后加中性樹膠及蓋玻片,光鏡下觀察心肌細胞。心肌細胞非凋亡呈現(xiàn)藍色,凋亡呈現(xiàn)棕黃色,每張切片選擇5個非重疊事業(yè),計算心肌細胞凋亡率,凋亡/總細胞×100%。

1.7免疫組化檢測LC3Ⅱ 取各組心肌組織切片脫蠟,乙醇脫水,二甲苯透明,抗原修復(fù)。后將切片置于耐高溫染色架上,放于沸騰的修復(fù)液中,1～2 min后取出。稍置,自來水沖冷,室溫放置20 min后取出玻片,蒸餾水沖洗兩次;PBS洗2～3次各5 min;用含3%正常山羊血清的PBS孵育20 min;加入一抗,用兔抗鼠LC3Ⅱ抗體(稀釋度1∶300),37 ℃孵育2 h;加入二抗,用生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶300),37 ℃孵育30 min;加入辣根酶標(biāo)記鏈霉蛋白素(1∶300),37 ℃孵育20 min;采用DAB法顯色;干燥,乙醇脫水,透明、中性樹膠封片;染色后,采用Image-ProPlus6.0圖像分析,每個切片在顯微鏡下隨機選用5個400倍視野觀察。

1.8血管重塑 取各組大鼠5 μm心肌組織石蠟切片3張,60 ℃溫箱中烤片,HE 染色后,二甲苯透明中性樹膠封片。共聚焦顯微鏡下選取圓形橫斷面的冠狀動脈,彩圖像顯微分析系統(tǒng)測量冠狀動脈壁厚度、管腔直徑、管壁面積及管腔面積,計算冠狀動脈壁厚度、管腔直徑比值,冠狀動脈管壁面積、管腔面積比。

1.9心肌線粒體酶復(fù)合物活性 取各組大鼠心肌組織,心肌細胞線粒體勻漿由上海如吉生物公司提供的動物硬組織線粒體分離(粗提)試劑盒提取,心肌細胞線粒體呼吸酶復(fù)合物琥珀酸脫氫酶(SDH)、細胞色素氧化酶(CCO)活性由動物線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性定量測試試劑盒測定。所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.10免疫印跡檢測LC3Ⅱ蛋白表達 取各組大鼠心肌組織,研磨后勻漿,離心10 min,取上清液,二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白濃度,煮沸變性后電泳,后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5% 脫脂奶粉封閉 2 h,加入LC3Ⅱ一抗(1∶200) 4 ℃孵育過夜,PBS清洗后,辣根過氧化物酶二抗(1∶500)室溫孵育 2 h,PBS清洗,電化學(xué)發(fā)光試劑后凝膠成像系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌組織病理形態(tài) HE染色:健康組心肌細胞排列有序、結(jié)構(gòu)清晰。模型組心肌細胞雜亂無章、形態(tài)模糊、伴有炎癥細胞浸潤;中藥低、中、高組心肌組織形態(tài)有所改善,且以中藥高組效果較為顯著。Masson:健康組心肌組織排列規(guī)整;模型組心肌梗死區(qū)被大量膠原組織取代(藍染區(qū)),心肌細胞排列混亂,結(jié)構(gòu)模糊;各給藥組心肌組織形態(tài)有所改善,且以中藥高組效果較為顯著。見圖1。

2.2各組心肌細胞凋亡比較 健康組心肌細胞凋亡指數(shù)〔(5.24±0.31)%〕顯著低于模型組〔(36.24±3.81)%;t=25.650、P<0.001〕。模型組凋亡指數(shù)顯著高于中藥低組〔(27.24±2.13)%;t=6.520,P<0.001〕。中藥低組凋亡指數(shù)顯著高于中藥中組〔(20.14±2.05)%;t=7.595、P<0.001〕。中藥中組心肌凋亡指數(shù)顯著高于中藥高組〔(13.14±1.52)%;t=8.674、P<0.001〕。見圖2。

2.3各組心肌組織中LC3Ⅱ水平比較 大鼠心肌組織中LC3Ⅱ蛋白染色后為棕黃色顆粒。健康組心肌組織幾乎無染色,細胞排列散亂、分布稀疏,模型組心肌組織染色較深,分布均勻,排列緊密。與模型組比較,中藥低、中、高組心肌組織有所改善,且以高劑量較為明顯。健康組LC3Ⅱ蛋白表達顯著低于模型組及中藥低、中、高組(P<0.05);與模型組相比,中藥低、中、高組LC3Ⅱ蛋白表達顯著降低(P<0.05);與中藥低組相比,中藥中、高組LC3Ⅱ蛋白表達顯著降低(P<0.05),中藥高組顯著低于中藥中組(P<0.05)。見表1、圖3、圖4。

2.4各組血管重構(gòu)比較 健康組冠狀動脈壁厚度、管壁厚度/管腔直徑、管壁面積/管腔面積明顯低于模型組(P<0.05),模型組上述指標(biāo)水平明顯高于中藥低組(P<0.05),中藥低組上述指標(biāo)水平明顯高于中藥中組(P<0.05)。中藥中組冠狀動脈壁厚度、管壁厚度/管腔直徑、管壁面積/管腔面積明顯高于中藥高組(P<0.05)。見表1。

2.5各組SDH、CCO活性比較 健康組SDH、CCO活性顯著高于模型組及中藥低、中、高組(P<0.05);模型組SDH、CCO活性顯著低于中藥低、中、高組(P<0.05);中藥低組SDH、CCO活性顯著低于中藥中、高組(P<0.05);中藥中組SDH、CCO活性顯著低于中藥高組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組心肌組織病理學(xué)(×100)

圖2 各組心肌細胞凋亡(TUNEL染色,×400)

表1 各組LC3Ⅱ值及血管重構(gòu)、SDH、CCO活性比較

圖3 各組心肌組織中LC3Ⅱ水平(免疫組化染色,×400)

圖4 各組心肌組織中LC3Ⅱ蛋白表達

3 討 論

細胞自噬異常會導(dǎo)致細胞凋亡。在心室重構(gòu)的初始階段,自噬能降解聚積的蛋白質(zhì),減少心肌組織質(zhì)量,拮抗心室肥厚,在一定程度上對心肌細胞起保護作用,但病態(tài)的、過度的細胞自噬會導(dǎo)致心肌細胞損傷及蛋白質(zhì)異常沉積〔8〕。細胞自噬異常高表達會損傷心肌細胞并致使其凋亡。LC3Ⅱ是自噬標(biāo)志物,當(dāng)自噬產(chǎn)生時,酶解掉一小段多肽的胞質(zhì)型LC3變?yōu)樽允审w模型LC3Ⅱ〔9〕。因此LC3Ⅱ水平可以反映自噬的強弱程度。研究發(fā)現(xiàn)〔10〕,冠心病基本病機為本虛標(biāo)實,氣虛血瘀是該病發(fā)展的主要因素。血府逐瘀湯具有活血化瘀功效,方中當(dāng)歸、生地黃等具有活血養(yǎng)血的功效,柴胡、枳殼、牛膝等具有活血祛瘀的作用。陳欣等〔11〕對心肌缺血再灌注損傷大鼠的實驗中提出,通過抑制LC3Ⅱ水平可以抑制細胞自噬,減少心肌細胞凋亡。竇錫彬等〔12〕研究中提出,血府逐瘀湯對與冠心病的治療效果顯著。本研究與上述研究結(jié)果相似,因此本文認為,血府逐瘀合劑通過抑制自噬減少心肌細胞凋亡。

SDH、CCO是呼吸鏈的標(biāo)志酶,可調(diào)控細胞能量的生成,其表達降低提示心肌能量生成障礙〔13〕。冠心病產(chǎn)生時電子傳遞障礙,使氧化受阻,磷酸化所需能量無從產(chǎn)生〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)〔15〕,在心力衰竭中,心肌細胞線粒體膜磷脂發(fā)生脫失,脫失程度與心功能、生存率呈反比。另有研究發(fā)現(xiàn)〔16〕,細胞自噬能力上調(diào)后,通過消化破損的線粒體等,減少其釋放凋亡因子,抑制細胞凋亡。血府逐瘀合劑是臨床治療冠心病的經(jīng)驗方,其中赤芍、當(dāng)歸具有強心作用,還可抑制線粒體相關(guān)蛋白表達。在本文中,SDH、CCO水平在經(jīng)過血府逐瘀合劑的干預(yù)后,水平增加,且以高劑量最為顯著。包太成等〔17〕研究中便提出,腦出血后血腫周圍神經(jīng)元細胞色素C于6 h即開始從線粒體釋放,1 d達高峰后下降,血府逐瘀湯能阻止細胞色素C的釋放,同時促進血腫的吸收。Li等〔6〕研究表明,通過降低SDH、CCO等水平,減少心肌細胞凋亡情況。本文研究與上述研究結(jié)果相似,推測血府逐瘀湯可能是通過調(diào)控細胞自噬,從而影響SDH、CCO水平,減少心肌細胞凋亡。

研究顯示〔18〕,冠心病患者均存在心室重構(gòu),且多種心血管危險因素及發(fā)病機制均與心室重構(gòu)相關(guān)。冠狀動脈灌注不足,致心肌缺血缺氧,通過每搏輸出量降低,腎血流量減少,激活交感神經(jīng)等系統(tǒng),該系統(tǒng)激活后一方面可使血管收縮,增加心臟前后負荷,另一方面可促使心肌細胞肥大、增生,引起管腔狹窄、心臟肥厚、血管壁增厚,使得心肌缺血加重,對神經(jīng)交感系統(tǒng)進一步激活,形成惡性循環(huán),加重病情。研究發(fā)現(xiàn)〔19〕,自噬參與了心肌肥厚、心室重構(gòu)、等多種心血管疾病的病理過程。本研究結(jié)果說明,血府逐瘀合劑在一定程度上干預(yù)了冠心病心室重構(gòu)。李雅等〔20〕研究顯示,通過降低冠心病大鼠冠狀動脈壁厚度、管壁厚度/管腔直徑、管壁面積/管腔面積,可改善心血管重構(gòu),從而改善心功能。郭嵐等〔21〕研究提出,細胞自噬可促進血管重塑。李敏靜等〔22〕在對肺動脈高血壓大鼠的實驗中提出,血府逐瘀湯能有效減輕大鼠肺血管重塑,減少血管壁膠原纖維含量,改善肺功能。本研究與上述研究結(jié)果相似,推測血府逐瘀合劑通過調(diào)控自噬改善血管重塑。

綜上所述,血府逐瘀合劑通過抑制自噬改善冠心病大鼠血管重塑并抑制心肌細胞線粒體凋亡,為冠心病臨床治療提供新的治療方案及依據(jù)。