李會玉 孔青 郝彥雷

(河北以嶺醫(yī)院,河北 石家莊 050090)

糖尿病足(DF)是常見的糖尿病相關(guān)并發(fā)癥,發(fā)病機制與血管損傷、神經(jīng)系統(tǒng)異常及機體感染相關(guān)〔1〕。近些年,中藥在DF的治療中逐漸發(fā)揮重要作用,認為采用益氣活血類藥物可通過加快血管新生進而抑制DF炎癥,改善皮膚組織潰瘍。中醫(yī)認為DF屬于消渴病繼發(fā)病證,可以采用活血化瘀、清熱瀉火、補腎、抗炎的中藥治療,通心絡膠囊包括多種中藥材,具有益氣活血的功效〔2〕。神經(jīng)功能、腎功能不全等會引起DF,DF潰瘍后會產(chǎn)生較多毒性物質(zhì),被人體吸收之后不能及時代謝排出體外,反過來就會加重腎臟負擔。nephrin、podocin是足細胞裂孔隔膜相關(guān)蛋白,nephrin主要在腎小球足細胞中表達,但是當發(fā)生病理改變后其表達降低,因此檢測其表達可作為腎小球足細胞損傷的重要標志〔3〕。podocin是一種支架蛋白,其表達異常時會導致蛋白尿增多等腎臟損傷〔4〕。單核巨噬細胞是具有調(diào)節(jié)炎癥及免疫功能的因子,當皮膚出現(xiàn)損傷時M1型巨噬細胞增加,M2 型巨噬細胞減少,導致促炎抗炎免疫失衡,可加快潰瘍程度〔5,6〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)具有調(diào)節(jié)微循環(huán),加快皮膚組織修復的作用〔7〕。本實驗研究中藥通心絡膠囊對糖尿病足大鼠nephrin,podocin 水平、巨噬細胞M1表型及VEGF蛋白的作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級健康SD大鼠50只,體質(zhì)量200～300 g,由北京博爾西公司提供〔生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)-2019-0124〕,常規(guī)飼養(yǎng),溫濕度適應,自由取食和水。本次實驗已通過河北以嶺醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批,批號:Y-2019-01-25。

1.2藥物 通心絡膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司,批號:20090430),由人參、水蛭、全蝎、蟬蛻、赤芍、土鱉蟲、檀香、降香、酸棗仁、乳香、冰片等組成,用1.47 g生藥/g,0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制,4 ℃保存。

1.3實驗試劑 聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(廣州市百菱生物科技有限公司,貨號:PM008),蘇木素-伊紅(HE)染色液(上海西格生物科技有限公司,貨號:XG-X6822),PCR儀(上海三崴醫(yī)療設備公司,型號:FACSVia),CD68、精氨酸酶(ARG)-1、CD163酶、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)一抗(上海滬鼎生物科技有限公司,編號:B-02142),VEGF、缺氧誘導因子(HIF)-1α一抗(北京百奧萊博生物科技有限公司,貨號:YT848-MEU),辣根過氧化物酶二抗(上海李記生物科技有限公司,貨號:AP31L014)。

1.4模型建立及干預 50只大鼠中隨機抽取10只作為健康組進行對照,剩余大鼠按照參考文獻〔8〕建立動物模型,所有大鼠適應環(huán)境1 w后采用高脂飼料喂養(yǎng)30 d,禁食24 h,將鏈脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.2)溶液中,配成濃度為1%的溶液,單次腹腔注射40 mg/kg,后采用普通飼料喂養(yǎng)3 d,當外周空腹血糖≥16.7 mmol /L 為糖尿病大鼠造模成功〔9〕。普通飼料喂養(yǎng)30 d,采用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,YLS-5Q 超級控溫燙傷儀0.5 kg壓力及80 ℃下作用4 s,燙傷處皮膚出現(xiàn)蒼白、腫脹、破潰等為糖尿病足動物建模成功,健康組不予特殊處理。采用隨機數(shù)字表法將40只建模成功大鼠分為模型組,通心絡低、中、高劑量組,每組10只。健康組、模型組給予2 ml 生理鹽水灌胃;通心絡低、中、高劑量組分別給予通心絡膠囊0.50、0.75、1.00 g/kg灌胃,1次/d,共12 w。

1.5大鼠足部病理形態(tài) 取各組大鼠,麻醉后處死取足部組織及腎臟組織,10%甲醛固定組織,沿著縱方向進行切片,切片4 μm,低溫保存以便后續(xù)試驗。10%硝酸脫鈣液進行脫鈣,采用HE及Masson 染色,觀察病理形態(tài)及愈合情況、炎性細胞、新生膠原分布及新生管腔等情況。

1.6RT-PCR檢測nephrin、podocin表達 根據(jù)Trizol試劑說明從細胞系中提取和純化總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cRNA,PCR儀進行擴增,SYBR Green PCR Master mix 試劑盒檢測nephrin、podocin表達。RT-PCR條件:95 ℃預變性30 s, 95 ℃ 變性5 s,60 ℃ 31 s,40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計算Nephrin、podocin相對表達。引物序列:Nephrin:上游引物:5′-CCAGAGTGGACGAACTATATTGGA-3′,下游:5′-GACCAGTAACTGCCCGTTATCC-3′;podocin:上游引物:5′-CCTTTCCATGAGGTGGTAACCA-3′,下游:5′-GGATGGCTTTGGACACATGAG-3′;β-actin上游引物:5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′,下游:5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′。

1.7多重免疫熒光檢測傷口組織中 M1 型和 M2 型巨噬細胞數(shù)量 取各組足部創(chuàng)面組織,石蠟切片(3 μm)磷酸鹽沖洗15 min,反復2次,0.2%～0.5%的細胞通透劑通透,5%血清封閉60 min,加入一抗CD68、ARG-1、CD163 和iNOS孵化過夜,后采用二抗封片。Strata Quest 軟件計算,計算M1 和 M2 型巨噬細胞數(shù)量占總巨噬細胞數(shù)的百分比(%)。

1.8Western印跡檢測細胞中VEGF、HIF-1α蛋白表達水平 取各組細胞,胰蛋白酶消化,離心,取上清液。放入樣孔中,進行電泳實驗。電泳后將樣品轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,清洗樣品,將其放置在Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)溶液中室溫下混勻10 min,封閉蛋白1 h后,將其置于4 ℃環(huán)境孵育過夜。加入一抗VEGF、HIF-1α(1∶500),TBST沖洗,4 ℃孵育24 h,加入二抗(1∶2 000)孵育40 min,再采用TBST清洗蛋白樣本,后凝膠成像分析蛋白含量。

1.9檢測DF大鼠足部潰瘍面積 采用黑絲記號筆沿著大鼠潰瘍邊緣畫出輪廓,采用相機拍照,均由同一醫(yī)生完成,完成后導入計算機,應用ImageJ1.46醫(yī)學圖像分析軟件進行分析。

1.10統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠足部病理形態(tài) HE染色:模型組潰瘍組織存在大量炎癥細胞表達,且膠原纖維組織薄弱及組織排列稀疏;與模型組相比,通心絡低、中、高劑量組足部病理形態(tài)有所改善,且以高劑量組最顯著。Masson 染色:模型組創(chuàng)面潰瘍未完全愈合,且存在大量炎癥因子,與模型組相比,通心絡各劑量組有所改善,見圖1。

圖1 各組足部病理形態(tài)(×200)

2.2各組nephrin、podocin表達 HE染色:健康組腎臟組織排列清晰,模型組腎小球萎縮,炎性細胞浸潤。與模型組相比,各劑量通心絡組腎組織病理顯著改善,見圖2。健康組nephrin、podocin表達水平顯著高于模型組(P<0.05);與模型組相比,通心絡低劑量組nephrin、podocin表達顯著升高(P<0.05);與通心絡低劑量組相比,通心絡中劑量組nephrin、podocin表達顯著升高(P<0.05);與通心絡中劑量組相比,通心絡高劑量組nephrin、podocin表達顯著升高(P<0.05),見表1。

圖2 各組腎組織病理形態(tài)(HE染色,×100)

表1 各組Nephrin、podocin、VEGF、HIF-1α及CD68+、iNOS+、ARG-1、CD163+水平對比

2.3創(chuàng)面中MI、M2型巨噬細胞數(shù)量 各組CD68+表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與健康組相比,模型組iNOS+表達顯著增加(P<0.05);與模型組相比,通心絡低、中、高劑量組iNOS+表達顯著降低,且以高劑量組效果最顯著(P<0.05)。與健康組相比,模型組ARG-1表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,通心絡低、中、高劑量組ARG-1表達顯著升高,且以高劑量組效果最顯著(P<0.05)。與健康組相比,模型組CD163+表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比, 通心絡低、中、高劑量組CD163+表達顯著升高,且以中劑量組效果最顯著(P<0.05)。與健康組相比,模型組M1型巨噬細胞顯著增加、M2型巨噬細胞顯著減少(P<0.05);與模型組相比,通心絡各劑量組M1型巨噬細胞顯著減少、M2型巨噬細胞顯著增加,且以高劑量組效果最顯著(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 各組MI、M2型巨噬細胞數(shù)量(免疫熒光染色,×200)

2.4各組VEGF、HIF-1α蛋白表達 健康組VEGF、HIF-1α表達顯著高于模型組(P<0.05),模型組VEGF、HIF-1α表達顯著低于通心絡低劑量組(P<0.05),通心絡低劑量組VEGF、HIF-1α表達顯著低于通心絡中劑量組(P<0.05),通心絡中劑量組VEGF、HIF-1α表達顯著低于通心絡高劑量組(P<0.05),見表1、圖4。

2.5大鼠足部潰瘍面積 模型組足部潰瘍面積〔(0.81±0.05)cm2〕高于通心絡低劑量組〔(0.54±0.07)cm2〕,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.93,P<0.05)。與通心絡低劑量組相比,通心絡中劑量組潰瘍面積〔(0.42±0.05)cm2〕顯著減少(t=4.41,P<0.05)。與通心絡中劑量組相比,通心絡高劑量組潰瘍面積〔(0.23±0.02)cm2〕顯著減少(t=11.16,P<0.05)。

1～5:健康組,模型組,通心絡低、中、高劑量組圖4 Western印跡檢測各組VEGF、HIF-1α水平

3 討 論

缺氧是血管形成損傷的重要原因,缺氧環(huán)境下VEGF 表達降低,HIF-1α的反式激活,促使血管生成能力減慢,進而降低血管再生,導致糖尿病患者傷口愈合延遲〔10〕。原因可能在于HIF-1α能夠與活性氧簇(ROS)結(jié)合后提高對乙二醛酶(GLO)Ⅰ修飾作用,破壞HIF-1α穩(wěn)定性,進而導致血管生成能力減慢,延遲傷口愈合。研究表明〔11〕,糖尿病組織缺氧缺血,機體HIF-1α 表達下調(diào),VEGF表達抑制導致血管新生受阻,組織持續(xù)性循環(huán)障礙,加重局部組織缺氧缺血,導致壞死。通過動物及臨床研究表明,DF上調(diào)VEGF、HIF-1α可顯著改善創(chuàng)面愈合〔12,13〕。中醫(yī)將DF歸屬于“消渴”“脫疽”病的范疇,發(fā)病機制與先天稟賦不足、情志失衡及勞欲過度相關(guān)〔14,15〕。通心絡膠囊是由多味中藥組成的中藥制劑,其中人參有滋補益氣及增加免疫力的功效,人參皂苷是主要活性成分,可加快糖分氧化,提高琥珀酸脫氫酶表達可加快胰島素釋放,故發(fā)揮抗血糖作用。通心絡膠囊中水蛭、全蝎、蟬蛻、蜈蚣、冰片均可發(fā)揮活血、止痛、祛風等作用。研究發(fā)現(xiàn)〔16〕通心絡膠囊可通過提高DF缺血組織中VEGF表達,顯著加快血管新生。本研究與上述研究結(jié)論相似,提示通心絡膠囊可通過促進VEGF、HIF-1α表達,促進DF大鼠創(chuàng)面愈合。

DF潰瘍后會產(chǎn)生較多毒性物質(zhì),被人體吸收之后不能及時代謝排出體外,反過來就會加重腎臟負擔。nephrin、podocin是腎小球足細胞損傷的標志。足細胞主要存在于深腎臟腎小球基底膜的外側(cè),其損傷會提高蛋白尿,進而導致腎小球硬化發(fā)展為終末期腎臟疾病。研究表明〔17〕,上調(diào) nephrin、podocin 表達可有效保護腎臟。本研究結(jié)果與上述結(jié)論相似,表明通心絡膠囊可顯著改善DF大鼠腎病理損傷,并提高足細胞數(shù)目而增加腎臟保護。研究機制可能在于通心絡膠囊主要成分人參可發(fā)揮抗氧化應激,改善腎小球基底膜增厚,提高足細胞數(shù)目而改善腎組織病理損傷的作用〔18〕。

巨噬細胞極化主要分為M1及M2細胞極化,細胞因子可與巨噬細胞表面受體結(jié)合后,調(diào)節(jié)多種生物學效果。M1主要為促炎癥作用,M2主要為抗炎癥作用,在DF中M1型巨噬細胞被激活可激活致炎因子而導致組織損傷,而M2型巨噬細胞呈現(xiàn)低表達抗炎癥作用弱化〔19,20〕。DF小鼠模型中,在晚期糖基化的作用下,M2型巨噬細胞表達降低導致VEGF表達下調(diào),潰瘍組織中呈現(xiàn)高炎癥表達,導致不愈合表型〔21〕。脂肪組織源性干細胞(ADSCs)移植到大鼠皮膚缺損創(chuàng)面中,促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化,抗炎的同時可加快潰瘍組織修復〔22〕。本研究提示,通心絡膠囊通過抑制M1型巨噬細胞數(shù)目的增加,減少炎癥浸潤,促進創(chuàng)面愈合,與上述結(jié)論相似。

綜上,通心絡膠囊可促進VEGF/HIF-1α表達,使巨噬細胞向M1極化,促進創(chuàng)面愈合,提高nephrin/podocin表達水平,減輕由DF導致的腎臟負擔。