周德聰 貝寧 李建紅 王葉青 陳聲妹

(1海南省老年病醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,海南 海口 571100;2海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

腦卒中又叫缺血性腦梗死,是導(dǎo)致患者死亡及長(zhǎng)期殘疾的主要原因〔1〕。目前研究認(rèn)為,腦缺血梗死后,缺血缺氧刺激引起的炎癥及氧化應(yīng)激性反應(yīng),是導(dǎo)致腦卒中患者神經(jīng)元炎性損傷凋亡及神經(jīng)功能缺損癥狀發(fā)生的關(guān)鍵因素,且用抗炎及抗應(yīng)激治療思路可達(dá)到緩解腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)損傷的目的〔2〕。

缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是協(xié)調(diào)缺氧變化、介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)低氧反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,已有研究發(fā)現(xiàn)腦卒中缺血缺氧刺激條件下,HIF-1α活性升高可通過誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18的轉(zhuǎn)錄活化來加重神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷進(jìn)程,并認(rèn)為HIF-1α可作為判定腦卒中嚴(yán)重程度的潛在靶標(biāo)分子〔3〕。Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NLRP)3可與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)及半胱天冬蛋白酶-1前體(Pro-Caspase-1)相互結(jié)合成炎癥復(fù)合體,誘導(dǎo)IL-1β、IL-18等炎癥因子的成熟及分泌,研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體與腦卒中過程中的神經(jīng)免疫效應(yīng)細(xì)胞,如巨噬或小膠質(zhì)細(xì)胞極化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切〔4〕。有研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α可通過直接或間接增強(qiáng)NLRP3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)NLRP3表達(dá),來參與腦卒中后神經(jīng)元炎性損傷及凋亡過程〔5〕。但引起HIF-1α/NLRP3軸活化的基因調(diào)控機(jī)制還不明確。

miRNA是控制人類大腦各種功能所必需的調(diào)節(jié)因子,腦缺血梗死后多種miRNA的異常表達(dá)可影響神經(jīng)免疫效應(yīng)細(xì)胞活化,并介導(dǎo)神經(jīng)元炎性損傷發(fā)生〔6〕。miR-138為一種抑癌因子,其控制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移,延緩腦膠質(zhì)瘤患者病情發(fā)展〔7〕,但其在腦卒中過程中的研究還未見報(bào)道。已有研究〔8〕發(fā)現(xiàn),miR-138為HIF-1α的上游靶向調(diào)節(jié)因子,預(yù)示腦卒中患者HIF-1α/NLRP3軸的異常活化,很可能與miR-138的異常表達(dá)有關(guān)。本研究建立大鼠腦卒中模型,探究干預(yù)調(diào)控miR-138后對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響,以期為腦卒中的基因靶向治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 清潔健康SD雄性大鼠95只,7～8周齡,體質(zhì)量280～300 g,購自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0056。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,符合3R原則,批號(hào):IAU-2020011032。miR-138激動(dòng)劑(miR-138 agomir)及其陰性對(duì)照(agomir-NC)均由銳博生物公司合成;HIF-1α激活劑-奧替普拉(Oltipraz,貨號(hào):HY-12519,美國(guó)MCE公司);IL-1β、IL-18等酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購自深圳海思安生物技術(shù)有限公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(貨號(hào):YT8072)購自北京伊塔生物科技有限公司;尼氏染液(貨號(hào):OX02559)購自上海圻明生物科技有限公司;TUNEL染色液(貨號(hào):FK-MB793J)購自上海延慕實(shí)業(yè)有限公司;M1型巨噬細(xì)胞極化表面標(biāo)志物-CD11c、NLRP3、HIF-1α、IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1等兔抗大鼠抗體均購自美國(guó)abcam公司。

1.2腦卒中患者標(biāo)本采集 取2016年1月至2020年1月于海南省老年病醫(yī)院腦病科確診的腦卒中患者60例(初次發(fā)病,發(fā)病后24 h內(nèi)入院治療),男33例,女27例;平均年齡(63.00±8.00)歲;美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS)評(píng)分為4～15分,排除腦出血傾向。納入標(biāo)準(zhǔn):參照全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》〔9〕確診為腦卒中。排除標(biāo)準(zhǔn):排除短暫性腦缺血發(fā)作、心源性腦栓塞、外傷性腦血管病、隱匿性腦血管畸形、出血性腦梗死等神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者。同期選擇醫(yī)院健康體檢者20例,平均年齡(62.00±9.00)歲,男12例,女8例。收集腦卒中患者及健康體檢者血清2 ml,用RNA提取試劑盒方法提取血清中總RNA后,用qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)miR-138表達(dá)?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?。

1.3腦卒中模型建立及分組 取健康大鼠80只,麻醉后參照文獻(xiàn)〔10〕方法結(jié)扎大鼠右側(cè)中動(dòng)脈建立腦卒中模型,術(shù)后7 d,以大鼠出現(xiàn)行走困難、左前肢屈曲或行走時(shí)左側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒現(xiàn)象,視為造模成功(共成功75只,2只術(shù)后感染死亡,2只術(shù)中手術(shù)失敗死亡,1只未出現(xiàn)行走困難等腦卒中表型特征而剔出實(shí)驗(yàn))。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、miR-138激動(dòng)劑(miR-138 agomir)組、agomir-NC組、HIF-1α激活劑組、miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組,每組15只。另取15只健康大鼠只暴露右側(cè)中動(dòng)脈,不進(jìn)行結(jié)扎,作為假手術(shù)組。

miR-138 agomir組及agomir-NC組用腦立體定向儀經(jīng)右側(cè)腦室注射miR-138 agomir及agomir-NC試劑各50 μl,1次/2 d進(jìn)行干預(yù)治療;HIF-1α激活劑組參照文獻(xiàn)〔11〕經(jīng)腹腔注射HIF-1α激活劑(奧替普拉,0.5 mg/kg),1次/2 d進(jìn)行干預(yù)治療;miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組給予miR-138 agomir的同時(shí),經(jīng)腹腔注射奧替普拉。模型組及假手術(shù)組腹腔注射10 ml/kg生理鹽水進(jìn)行干預(yù)治療,各組連續(xù)給藥4 w后,進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4改良神經(jīng)功能損害程度評(píng)分(mNSS)評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損程度 各組給藥結(jié)束后,參照文獻(xiàn)〔12〕方法對(duì)運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡、反射等行為進(jìn)行mNSS評(píng)分,總分18分,評(píng)分越高預(yù)示神經(jīng)功能缺損行為越嚴(yán)重。

1.5TTC染色觀察腦梗死面積檢測(cè) 隨機(jī)取6只大鼠,麻醉處死后,取完整腦組織,切成厚為20 μmol/L的連續(xù)切片,按TCC染色液說明書方法染色后,Image Pro Plus5.0圖像處理系統(tǒng)掃描并計(jì)算觀察腦梗死面積(染成白色部位)及非梗死部位面積,根據(jù)公式:腦梗死面積=梗死面積/(梗死面積+非梗死面積)×100%,評(píng)價(jià)腦梗死程度。

1.6尼氏及TUNEL染色觀察海馬神經(jīng)元損傷及凋亡變化 剩余大鼠斷頭處死,取完整腦組織,冰上剝離海馬組織,將海馬組織分成兩部分,一部分海馬組織置于-80 ℃保存?zhèn)溆?另一部分用4%多聚甲醛固定后,制成5 μmol/L的石蠟切片,取相同部位石蠟切片,進(jìn)行尼氏及TUNEL染色后,置于光鏡下觀察神經(jīng)元染色情況,TUNEL染色切片,用Image Pro Plus6.0系統(tǒng)檢測(cè)單位面積內(nèi)凋亡細(xì)胞(陽性染色為棕黃色)數(shù)目,并計(jì)算凋亡細(xì)胞比例,凋亡細(xì)胞比例=(凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目)×100%。

1.7免疫組化染色檢測(cè)海馬組織CD11c、NLRP3陽性表達(dá) 海馬組織石蠟切片,脫蠟、水化、透化及抗原修復(fù)處理后,加入1∶200的CD11c、NLRP3抗體孵育過夜,1∶400的二抗羊抗兔IgG孵育40 min后,進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色及蘇木素染色處理后,Image Pro Plus5.0圖像系統(tǒng)測(cè)單位面積內(nèi)陽性染色的平均光密度(AOD)值。

1.8qRT-PCR法檢測(cè)miR-138表達(dá) 提取血清及海馬組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,行PCR(反應(yīng)條件:92 ℃預(yù)變性50 s、1個(gè)循環(huán),95 ℃變性20 s、60 ℃退火60 s、46個(gè)循環(huán))。以U6為內(nèi)參用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-138(引物序列:正向-5′-GGCAGTGTGTGAATCG-3′,反向-5′-CAGGGCTTGTCGTAGAG-3′)相對(duì)表達(dá)水平。各引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.9Western印跡檢測(cè)海馬組織蛋白表達(dá) 將冰凍海馬組織于4 ℃解凍后,粉碎勻漿后提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白總濃度,取60 μg蛋白行加樣電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜操作,5%脫脂奶粉封閉,滴加1∶700的一抗(HIF-1α、NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1)抗體及1∶1 500的內(nèi)參β-actin抗體孵育過夜,滴加辣根過氧化酶(HRP)羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育80 min,化學(xué)發(fā)光液及顯影液浸泡曝光、晾干,以ImageJ軟件分析條帶相對(duì)灰度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清miR-138表達(dá)比較 與健康組(1.00±0.00)相比,腦卒中組血清中miR-138表達(dá)(0.32±0.06)顯著降低(P<0.05)。

2.2miR-138上調(diào)對(duì)神經(jīng)功能缺損及腦梗死面積的影響 與假手術(shù)組相比,模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-138 agomir組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積顯著降低(P<0.05);HIF-1α激活劑組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,HIF-1α激活劑組、agomir-NC組及miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3miR-138上調(diào)對(duì)腦卒中大鼠海馬神經(jīng)元損傷及凋亡的影響 尼氏及TUNEL染色可見,假手術(shù)組海馬神經(jīng)元排列整齊,細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,僅有少量染成棕黃色的凋亡細(xì)胞。模型組可見海馬神經(jīng)元排列紊亂,神經(jīng)元細(xì)胞腫脹、破裂及核固縮等損傷現(xiàn)象明顯,神經(jīng)元凋亡率顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。miR-138 agomir組神經(jīng)元排列稍整齊,神經(jīng)元細(xì)胞破裂及核固縮等病理損傷緩解,神經(jīng)元凋亡率顯著低于模型組(P<0.05)。HIF-1α激活劑組神經(jīng)元損傷進(jìn)一步加重,可見空泡化的神經(jīng)元形成,神經(jīng)元凋亡率較模型組及miR-138 agomir組顯著升高(P<0.05)。agomir-NC組神經(jīng)元損傷較模型組相近,神經(jīng)元凋亡率與模型組相比差異不顯著(P>0.05),較miR-138 agomir組顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組神經(jīng)元損傷加重,凋亡率顯著升高(P<0.05),見表1、圖1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積、神經(jīng)元凋亡率及CD11c、NLRP3陽性表達(dá)比較

圖1 各組海馬組織(×400)

2.4miR-138上調(diào)對(duì)海馬組織CD11c及NLRP3陽性表達(dá)的影響 免疫組化染色可見,CD11c及NLRP3可在海馬神經(jīng)元中呈陽性表達(dá)。與假手術(shù)組相比,模型組CD11c及NLRP3陽性表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-138 agomir組CD11c及NLRP3陽性表達(dá)顯著降低(P<0.05);HIF-1α激活劑組CD11c及NLRP3陽性表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,HIF-1α激活劑組、agomir-NC組及miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組CD11c及NLRP3陽性表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 各組海馬組織CD11c及NLRP3表達(dá)(免疫組化染色,×400)

2.5miR-138上調(diào)對(duì)海馬組織miR-138/HIF-1α/NLRP3信號(hào)軸的影響 與假手術(shù)組相比,模型組海馬組織miR-138表達(dá)顯著降低,HIF-1α、NLRP3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-138 agomir組海馬組織miR-138表達(dá)顯著升高,HIF-1α、NLRP3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);HIF-1α激活劑組HIF-1α、NLRP3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組miR-138表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組HIF-1α、NLRP3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);HIF-1激活劑組及agomir-NC組miR-138表達(dá)顯著降低,HIF-1α、NLRP3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表2、圖3。

2.6miR-138上調(diào)對(duì)海馬組織IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比,模型組海馬組織IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-138 agomir組IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);HIF-1α激活劑組IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,HIF-1α激活劑組、agomir-NC組及miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表2、圖3。

表2 各組海馬組織miR-138、HIF-1α、NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)比較

1～6:假手術(shù)組、模型組、miR-138 agomir組、HIF-1α激活劑組、agomir-NC組、miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組圖3 各組海馬組織HIF-1α、NLRP3、IL-1β、IL-18、 Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達(dá)

3 討 論

腦卒中后,神經(jīng)元廣泛性缺血缺氧壞死、病變及凋亡是導(dǎo)致腦神經(jīng)功能障礙發(fā)生的根本原因,而腦部炎癥反應(yīng)是神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷的主要過程之一〔13〕。大量研究發(fā)現(xiàn),缺血缺氧刺激、凋亡均會(huì)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化及炎癥介質(zhì)的大量釋放,炎癥介質(zhì)在促進(jìn)循環(huán)免疫細(xì)胞向缺血部位趨化的過程中,可進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)的惡化及神經(jīng)元的凋亡,并認(rèn)為炎癥反應(yīng)、炎癥消退是腦卒中后神經(jīng)功能損傷及修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔14〕。巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞,其M1型極化,具有促炎特性,檢測(cè)M1型極化表面特異性物質(zhì)CD11c表達(dá),可反應(yīng)組織促炎反應(yīng)特性〔15〕。本研究結(jié)果提示,腦卒中模型造模成功,且炎癥反應(yīng)參與腦卒中后神經(jīng)元損傷過程。

腦卒中過程,血液循環(huán)障礙使組織營(yíng)養(yǎng)及氧供減少而梗死,缺血組織在氧供減少情況下,具有介導(dǎo)及感受低氧反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子HIF-1以異源二聚體(HIF-1α)的形式穩(wěn)定存在及活化,HIF-1α的活化可與其亞基(HIF-1β)結(jié)合,促進(jìn)下游目的基因如IL-1β、IL-18的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合序列活化,而促進(jìn)IL-1β、IL-18的轉(zhuǎn)錄,IL-1β、IL-18活性的升高可促進(jìn)HIF-1α的進(jìn)一步活化,實(shí)現(xiàn)“炎癥-HIF-1α-炎癥”的正反饋循環(huán)而放大炎癥反應(yīng)〔16〕。Davis等〔17〕發(fā)現(xiàn),HIF-1α與腦卒中嚴(yán)重程度相關(guān),用蛋白酶體抑制劑抑制HIF-1α降解而促進(jìn)HIF-1α活化后,可降低IL-1β的生成而緩解神經(jīng)元缺氧性凋亡,證實(shí)HIF-1α可能是放大腦卒中后神經(jīng)炎性反應(yīng)損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。另外,HIF-1α的活化也可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化而進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究證實(shí),NLRP3為炎癥反應(yīng)的核心因子,在病原微生物、應(yīng)激刺激等引起固有免疫系統(tǒng)活化過程中,NLRP3可與ASC及pro-Caspase-1結(jié)合形成分子量約為700 kD的多蛋白復(fù)合體,即炎癥小體,來識(shí)別多種病原微生物、炎癥應(yīng)激、內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)的活化,而介導(dǎo)IL-1β、IL-18等免疫炎性分子的成熟及分泌,加大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的傳導(dǎo),而HIF-1α活化后可通過活性氧簇(ROS)生成或結(jié)合NLRP3啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域,來間接或直接誘導(dǎo)NLRP3的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)并參與組織炎性損傷過程〔18〕。Jiang等〔5〕發(fā)現(xiàn),用HIF-1α抑制劑YC-1抑制HIF-1α表達(dá)后,腦卒中大鼠模型NLRP3炎癥小體及下游IL-1β、IL-18炎癥因子表達(dá)均明顯減弱,大鼠神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)功能缺損癥狀均得到明顯緩解,證實(shí)抑制HIF-1介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活,可能是治療腦卒中的潛在策略。本研究也證實(shí),HIF-1介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活,可能是引起腦卒中后神經(jīng)元炎性損傷及凋亡的關(guān)鍵原因。但引起腦卒中HIF-1α/NLRP3炎癥反應(yīng)活化的靶向基因調(diào)控機(jī)制還不甚明確。

miRNAs已被證明可靶向多種基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)而參與腦卒中后炎癥反應(yīng)過程〔19〕。Yu等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),腦卒中患者血清中約有200種異常表達(dá)的miRNAs,且這些異常表達(dá)的miRNAs在腦卒中的診斷及預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮巨大作用。miRNAs中的miR-138為抑癌因子,其可在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中異常表達(dá)而參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的異常增殖過程〔7〕。已有研究發(fā)現(xiàn),miR-138可靶向抑制炎癥通路——核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB表達(dá)來抑制脊髓損傷患者促炎因子釋放及小膠質(zhì)細(xì)胞活化,發(fā)揮抗神經(jīng)炎性損傷作用〔21〕。另外,miR-138與HIF-1α之間有靶向結(jié)合位點(diǎn),Gai等〔8〕研究證實(shí),miR-138可靶向抑制HIF-1α表達(dá)來阻止心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧性凋亡,預(yù)示HIF-1α的活化可能與miR-138表達(dá)降低有關(guān)。本研究提示,miR-138發(fā)揮抗腦卒中后神經(jīng)元損傷及凋亡作用,可能與抑制HIF-1介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活有關(guān)。這為腦卒中的藥物研發(fā)及基因靶向治療,提供新思路。但腦卒中后神經(jīng)元炎性損傷及凋亡作用,往往需要多個(gè)miRNAs及mRNA調(diào)控,且HIF-1α啟動(dòng)NLRP3活化的具體機(jī)制研究較少,還存在許多盲點(diǎn),有待后續(xù)深入探究。