黃文博 杜申釗 曾靜 谷耀東

(南陽市中心醫(yī)院口腔科,河南 南陽 473000)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是常見的頭頸部惡性腫瘤,占口腔惡性腫瘤的90%,由于其惡性程度高,易發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者5年生存率不高,因此從分子水平研究OSCC發(fā)生發(fā)展機制,對其靶向治療具有重要意義〔1,2〕。長鏈非編碼RNA癌易感性候選基因(LncRNA CASC)9屬于LncRNA,研究顯示,LncRNA CASC9在OSCC組織與細胞系中上調(diào)表達,與OSCC臨床分期、腫瘤大小、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),抑制LncRNA CASC9表達,可顯著抑制OSCC細胞增殖、遷移與侵襲〔3〕。報道顯示,LncRNAs可通過競爭性結(jié)合microRNA(miRNA)反應(yīng)元件來靶向miRNA以抑制miRNA功能,如抑制LncRNA CASC9表達可通過調(diào)節(jié)miR-195-5p/丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)4軸加重敗血癥誘導(dǎo)的急性肺損傷〔4〕。有研究顯示,miR-195在OSCC中發(fā)揮抑癌基因的作用,過表達miR-195可抑制OSCC細胞增殖與侵襲〔5〕。另有研究顯示, miR-195-5p能通過靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A抑制宮頸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移,并能促進腫瘤移植模型小鼠存活〔6〕。LncRNA CASC9是否通過調(diào)控miR-195-5p/VEGFA軸影響OSCC細胞增殖、凋亡和遷移尚未見報道,本研究將探索LncRNA CASC9對OSCC細胞增殖、凋亡、遷移的影響,并初步探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 人OSCC細胞系SCC15、CAL27、SCC-4和Tca83及人正?？谇火つそ腔毎?hNOK)購自美國ATCC細胞庫;抑制LncRNA CASC9表達質(zhì)粒(si-CASC9)及陰性對照(si-NC)、miR-195-5p模擬物(miR-195-5p mimics)及陰性對照(miR-NC)、miR-195-5p抑制劑(miR-195-5p inhibitor)及陰性對照(NC inhibitor)、VEGFA過表達質(zhì)粒(VEGFA)及對照(pc-DNA)、miR-195-5p、LncRNA CASC9及U6、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司;Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(L3000-015)、海腎-螢火蟲熒光素酶雙檢測試劑盒(16186)購自Thermo Scientific;TriQuick Reagent(總RNA提取試劑,R1100)、膜聯(lián)蛋白Ⅴ異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(CA1020)、CCK-8試劑盒(CA1210)購自北京索萊寶;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(D7168M)及SYBR Green qPCR Mix(D7260)購自Beyotime公司;兔抗人VEGFA(65373)、增殖細胞核抗原(PCNA,13110)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3(14220)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9(13667)抗體購自美國CST公司。

1.2組織與細胞標本 選擇2018年4月至2021年6月在南陽市中心醫(yī)院進行手術(shù)治療的OSCC患者51例,手術(shù)過程中取OSCC組織及癌旁組織,患者術(shù)前未經(jīng)任何放、化療等抗腫瘤治療,術(shù)后經(jīng)病理診斷為OSCC。SCC15、CAL27、SCC-4、Tca83及hNOK細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測OSCC組織與癌旁組織及細胞中LncRNA CASC9表達。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3細胞轉(zhuǎn)染及分組 SCC15細胞以2×105個/孔接種到6孔板中,待細胞貼壁生長時,使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑對細胞進行轉(zhuǎn)染,將SCC15細胞分為空白對照(Control)組、si-NC組、si-CASC9組、miR-NC組、miR-195-5p mimics組、si-CASC9+miR-195-5p inhibitor組、si-CASC9+NC inhibitor組、miR-195-5p mimics+pc-DNA組、miR-195-5p mimics+VEGFA組,每組設(shè)置6個復(fù)孔,轉(zhuǎn)染48 h后檢驗轉(zhuǎn)染效率。

1.4qRT-PCR檢測LncRNA CASC9、miR-195-5p表達 使用總RNA提取試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后,qRT-PCR檢測 LncRNA CASC9、miR-195-5p表達。引物序列(5′-3′):LncRNA CASC9上游引物:AGATGAAGCCGGTACCTCAGAT,下游:TCACTTTAAAGAGGGAGAGGAG;GAPDH上游引物:TATGATGATATCAAGAGGGTAGT,下游:TG TATCCAAACTCATTGTCATAC;miR-195-5p上游引物:GGCGTCGTATCCAGTGCAAT,下游:GTCGTATCCAGTGCGTGTCG;U6上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA,下游:AACGCTTCACGAATTTGCGT。反應(yīng)結(jié)束后,分別以GAPDH、U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt方法計算LncRNA CASC9、miR-195-5p相對表達量。

1.5miR-195-5p與 LncRNA CASC9、VEGFA的靶向關(guān)系驗證 通過生物信息學(xué)(StarBase、targetscan數(shù)據(jù)庫)分析顯示 LncRNA CASC9、VEGFA與miR-195-5p有靶向結(jié)合位點,分別構(gòu)建LncRNA CASC9、VEGFA的野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒,并分別與miR-NC、miR-195-5p mimics共轉(zhuǎn)染SCC15細胞,雙熒光素酶系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。

1.6CCK-8法檢測細胞增殖 轉(zhuǎn)染后的SCC15細胞制備成2×106個/ml的單細胞懸液,以每孔100 μl接種至96孔板中,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h時每孔加入10 μl CCK-8溶液,孵育2 h,酶標儀測定波長450 nm處吸光度(OD)值。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 SCC15細胞轉(zhuǎn)染48 h后,使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡,流式細胞儀計算細胞凋亡率。

1.8Transwell實驗檢測細胞遷移 轉(zhuǎn)染后的SCC15細胞使用無血清培養(yǎng)液稀釋,取200 μl培養(yǎng)液加至Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,取出Transwell板,10%甲醛固定10 min,0.1%Giemsa染色5 min,顯微鏡觀察,隨機觀察5個視野,計算每個視野平均遷移細胞數(shù)目。

1.9Western印跡法檢測VEGFA、PCNA、Caspase-3、MMP-9蛋白表達 離心收集各組轉(zhuǎn)染后的SCC15細胞,加入RIPA裂解液離心提取總蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度,取20 μg蛋白變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入VEGFA、PCNA、Caspase-3、MMP-9一抗稀釋液(按照說明書進行稀釋),室溫孵育2 h,加入二抗孵育1 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色,以β-actin為內(nèi)參,ImageJ5.0軟件分析灰度值。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析及SNK-q檢驗;采用GraphPad Prism8.0繪制生長曲線與作圖。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA CASC9在OSCC組織及細胞中上調(diào)表達 qRT-PCR結(jié)果顯示,LncRNA CASC9在OSCC組織與細胞中(2.47±0.25)較癌旁組織(1.02±0.15)表達顯著上調(diào)(P<0.05)。與hNOK細胞(1.02±0.15)比較,SCC15細胞(3.24±0.50)、CAL27細胞(2.13±0.43)、SCC-4細胞(2.85±0.38)及Tca83細胞(1.97±0.31)LncRNA CASC9表達水平顯著升高(P<0.05),且SCC15細胞中LncRNA CASC9表達水平最高,故選擇SCC15細胞系進行后續(xù)實驗。

2.2抑制LncRNA CASC9表達對SCC15細胞增殖、凋亡及遷移的影響 SCC15細胞中抑制LncRNA CASC9表達后,與si-NC組比較,CCK-8實驗結(jié)果顯示,SCC15細胞增殖活性(24、48、72 h)明顯降低(P<0.05);Transwell實驗結(jié)果顯示,SCC15細胞遷移數(shù)目顯著降低(P<0.05);流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);Western印跡結(jié)果顯示,PCNA、MMP-9蛋白表達水平顯著降低,Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見圖1、圖2、表1、表2、圖3。

圖1 抑制LncRNA CASC9表達對SCC15細胞凋亡的影響

圖2 Transwell檢測各組SCC15細胞遷移(結(jié)晶紫染色,×200)

表1 抑制LncRNA CASC9表達對SCC15細胞凋亡及遷移的影響

表2 抑制LncRNA CASC9表達對SCC15細胞增殖的 影響

圖3 各組SCC15細胞PCNA、Caspase-3、MMP-9蛋白表達

2.3LncRNA CASC9靶向調(diào)控miR-195-5p 如圖4所示,經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LncRNA CASC9與miR-195-5p有結(jié)合位點,CASC9-wt、CASC9-mut分別與miR-NC、miR-195-5p mimics共轉(zhuǎn)染SCC15細胞后,雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示,與miR-NC比較,CASC9-wt與miR-195-5p mimics共轉(zhuǎn)染SCC15細胞相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見表3;抑制LncRNA CASC9表達后,Control組、si-NC組及si-CASC9組miR-195-5p表達分別為1.05±0.12、1.01±0.13和1.87±0.21,si-CASC9組顯著高于si-NC組(P<0.05),抑制LncRNA CASC9表達可顯著提高miR-195-5p表達水平。

圖4 LncRNA CASC9與miR-195-5p靶向預(yù)測

表3 相對熒光素酶活性檢測結(jié)果

2.4過表達miR-195-5p對SCC15細胞增殖、凋亡及遷移的影響 SCC15細胞中過表達miR-195-5p后,與miR-NC組比較,CCK-8實驗結(jié)果顯示,SCC15細胞增殖活性(48、72 h)明顯降低(P<0.05);Transwell實驗結(jié)果顯示,SCC15細胞遷移數(shù)目顯著降低(P<0.05);流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);Western印跡結(jié)果顯示,PCNA、MMP-9蛋白表達水平顯著降低,Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見圖5、圖6、表4、表5、圖7。

圖5 過表達miR-195-5p對SCC15細胞凋亡的影響

表4 過表達miR-195-5p對SCC15細胞增殖的影響

表5 過表達miR-195-5p對SCC15細胞凋亡及遷移的影響

圖7 各組SCC15細胞PCNA、Caspase-3、MMP-9蛋白表達

2.5抑制miR-195-5p表達逆轉(zhuǎn)抑制LncRNA CASC9表達對SCC15細胞增殖、凋亡及遷移的作用 SCC15同時細胞轉(zhuǎn)染si-CASC9與miR-195-5p inhibitor后,與si-CASC9+NC inhibitor組比較,CCK-8實驗結(jié)果顯示,si-CASC9+miR-195-5p inhibitor組SCC15細胞增殖活性(24、48、72 h)明顯升高(P<0.05);Transwell實驗結(jié)果顯示,SCC15細胞遷移數(shù)目顯著增加(P<0.05);流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);Western印跡結(jié)果顯示,PCNA、MMP-9蛋白表達水平顯著升高,Caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見圖8、圖9、表6、表7、圖10。

圖8 流式細胞儀檢測各組SCC15細胞凋亡

圖9 Transwell檢測各組SCC15細胞遷移(結(jié)晶紫染色,×200)

表6 同時抑制miR-195-5p與LncRNA CASC9表達對SCC15細胞增殖的影響

表7 同時抑制miR-195-5p與LncRNA CASC9表達對SCC15細胞凋亡及遷移的作用

1～3:si-CASC9組、si-CASC9+NC inhibitor組、si-CASC9+miR-195-5p inhibitor組圖10 各組SCC15細胞PCNA、Caspase-3、MMP-9蛋白表達

2.6miR-195-5p與VEGFA的靶向關(guān)系驗證 如圖11所示,miR-195-5p與VEGFA基因有靶向結(jié)合位點,VEGFA-wt、VEGFA-mut分別與miR-NC、miR-195-5p mimics共轉(zhuǎn)染SCC15細胞,雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示,與miR-NC比較,VEGFA-wt與miR-195-5p mimics共轉(zhuǎn)染SCC15細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),且過表達miR-195-5p后,Control組、miR-NC組及miR-195-5p mimics組VEGFA表達分別為1.01±0.11、1.03±0.10和0.25±0.04,miR-195-5p mimics組顯著低于miR-NC組(P<0.05),過表達miR-195-5p可顯著抑制VEGFA蛋白表達水平,見表8、圖12。

圖11 miR-195-5p與VEGFA的靶向預(yù)測

表8 相對熒光素酶活性檢測結(jié)果

圖12 Western印跡檢測各組VEGFA蛋白表達

2.7上調(diào)VEGFA表達逆轉(zhuǎn)過表達miR-195-5p對SCC15細胞增殖、凋亡及遷移的作用 SCC15細胞同時轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimics與VEGFA質(zhì)粒后,與miR-195-5p mimics+pc-DNA組比較,CCK-8實驗結(jié)果顯示,miR-195-5p mimics+VEGFA組SCC15細胞增殖活性(48、72 h)明顯升高(P<0.05);Transwell實驗結(jié)果顯示,SCC15細胞遷移數(shù)目顯著增加(P<0.05);流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);Western印跡結(jié)果顯示,PCNA、MMP-9蛋白表達水平顯著升高,Caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見表9、圖13、圖14、表10、圖15。

表9 同時過表達VEGFA和miR-195-5p對SCC15細胞增殖的影響

圖14 Transwell檢測各組SCC15細胞遷移(結(jié)晶紫染色,×200)

表10 同時過表達VEGFA和miR-195-5p對SCC15細胞凋亡及遷移的影響

1～3:miR-195-5p mimics組、miR-195-5p mimics+pc-DNA組、miR-195-5p mimics+VEGFA組圖15 各組細胞VEGFA、PCNA、MMP-9蛋白表達

3 討 論

LncRNA可通過參與調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞周期及分化等過程參與多種病理生理過程,多項報道顯示,CASC11、結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(CCAT)1、磷酸酶和張力同源物假基因(PTENP)1等多種LncRNA異常表達與OSCC有關(guān),可參與調(diào)控OSCC細胞的增殖、遷移與侵襲,與OSCC的惡性進展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)〔7～9〕。LncRNA CASC9在食管癌、鼻咽癌和肝細胞癌等多種腫瘤中表達上調(diào),發(fā)揮癌基因的作用〔10,11〕。LncRNA CASC9可通過調(diào)節(jié)miR-423-5p/性別決定區(qū)域Y-BOX(SOX)12軸調(diào)控舌鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔12〕。Yang等〔13〕研究顯示,LncRNA CASC9在OSCC組織與細胞中高表達,且LncRNA CASC9高表達與患者的腫瘤大小、臨床分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及總生存時間有關(guān),在OSCC細胞中敲除LncRNA CASC9表達可顯著抑制細胞增殖,促進細胞自噬和凋亡,但其具體作用機制有待進一步研究。本研究qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,LncRNA CASC9在OSCC組織與細胞表達顯著上調(diào),且在SCC15細胞中LncRNA CASC9表達水平最高,故選擇SCC15細胞系進行后續(xù)實驗。本研究結(jié)果提示,抑制LncRNA CASC9表達可顯著抑制SCC15細胞增殖及遷移,并促進細胞凋亡,與Yang等〔13〕報道結(jié)果類似。

LncRNA可通過ceRNA競爭性抑制miRNA而影響腫瘤的發(fā)展,如Zhang等〔14〕研究表明,LncRNA CASC9抑制miR-758-3p上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β2促進膀胱癌細胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), LncRNA CASC9與miR-195-5p存在靶向結(jié)合位點,且雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,LncRNA CASC9與miR-195-5p存在靶向關(guān)系。miR-195-5p為miRNA一種,OSCC中miR-195-5p呈低表達,過表達miR-195-5p可通過靶向抑制三重基序蛋白(TRIM)14抑制OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲〔15〕。miR-195-5p在其他腫瘤,如宮頸癌、肝癌中亦低表達,發(fā)揮抑癌作用〔16,17〕。本研究提示,LncRNA CASC9靶向miR-195-5p調(diào)控OSCC細胞增殖、凋亡與遷移。

研究顯示, miR-195-5p還可通過靶向抑制VEGFA表達來抑制骨肉瘤細胞遷移與侵襲〔18〕。VEGFA是促血管生長因子家族成員,可參與腫瘤血管生成,miR-195-5p/VEGFA在腫瘤的進展中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔19〕。本研究結(jié)果表明,抑制LncRNA CASC9表達可通過靶向調(diào)節(jié)miR-195-5p/VEGFA 軸,抑制SCC15細胞增殖及遷移,促進細胞凋亡。