章陽 劉暉杰 曹立功 許華

(湖北文理學院附屬醫(yī)院(襄陽市中心醫(yī)院)腫瘤科,湖北 襄陽 441021)

臨床數(shù)據(jù)顯示,大多數(shù)乳腺癌患者在完全切除后最終會復發(fā)或轉移〔1〕。盡管乳腺癌的治療已有所改進,但由于抗藥性和嚴重的副作用,開發(fā)治療乳腺癌的新方法仍然是重要的目標〔2〕。苦杏仁苷具有許多生物學作用,包括抗感染、抗炎、抗氧化及化學預防活性。有研究發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷具有抗癌特性,可涉及腫瘤發(fā)生、細胞周期調節(jié)、凋亡、血管生成、免疫活性調節(jié)和轉移的多種生物學途徑〔3〕。Mani等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷可抑制前列腺癌細胞黏附和遷移。細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶成員之一,已有研究證明ERK參與多種人類癌癥(肺癌、三陰性乳腺癌)的發(fā)生與發(fā)展〔5,6〕。核因子(NF)-κB是一種多功能轉錄因子,在炎癥免疫及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用〔7〕,付強等〔8〕研究顯示,異丙酚可抑制NF-κB表達,進而抑制肝癌HepG2細胞增殖,促進其凋亡。ERK信號已被證明直接調節(jié)NF-κB的活化,并且這種調節(jié)與乳腺癌細胞的上皮-間質轉化和遷移有關〔9〕。目前未見苦杏仁苷對乳腺癌作用機制的相關文獻。本研究基于ERK/NF-κB通路探討苦杏仁苷對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、侵襲、遷移的影響,以期為乳腺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 乳腺癌MDA-MB-231細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,批號CL-0237。

1.2主要藥物、試劑及儀器 苦杏仁苷(西安萊葆生物技術有限公司,原料藥,純度99.8%,批號29883-11-7);紫杉醇注射液(百時美施貴寶公司,批號ED-1005-36);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司,批號XC4713、XC4585);噻唑藍(MTT)試劑盒、二甲基亞砜、基質膠、結晶紫染液、逆轉錄試劑盒(上海北諾生物科技有限公司,批號K0241、K0722、K0913、K1318、K5714);Trizol試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)、RIPA裂解緩沖液、電化學發(fā)光(ECL)底物試劑盒(美國Invitrogen公司,批號SE-4785-8、SE-2033-7、SE-3512、SE6019-7);ERK、NF-κB、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、羊抗鼠二抗(英國Abcam公司,批號ab5123、ab50167、ab20173、ab00129);酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司,型號1200);顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司,型號XSP-2C);實時熒光定量PCR儀(德國耶拿分析儀器股份公司,型號qTOWER);化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(北京原平皓生物技術有限公司,型號Tanon 5200)。

1.3細胞培養(yǎng)及分組 將乳腺癌MDA-MB-231細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在5%CO2濃度的培養(yǎng)箱(37 ℃)中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細胞,將細胞隨機分為:對照組、紫杉醇組、苦杏仁苷低劑量組、苦杏仁苷高劑量組。各組處理方法如下,對照組:細胞濃度為5×106個/ml的細胞液在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng);紫杉醇組:細胞培養(yǎng)方法同對照組,加入濃度為10 μg/ml的紫杉醇〔10〕;苦杏仁苷低、高劑量組細胞培養(yǎng)方法同對照組,分別加入濃度為20、40 μg/ml的苦杏仁苷〔11〕。以上各組每孔設6個平行樣,培養(yǎng)72 h。

1.4MTT法測定細胞增殖水平 將細胞接種在96孔板中,濃度為1×103個/孔,按1.3中方式干預處理72 h后,將MTT溶液加入孔中,4 h后,加入200 μl二甲基亞砜,并將細胞在37 ℃輕微搖動下再溫育10 min。設置空白組,空白組僅含有培養(yǎng)液、MTT和二甲基亞砜。最后,使用酶標儀在490 nm下測量每個孔的光密度(OD)值。計算細胞存活率〔細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%〕。

1.5Transwell小室測定細胞侵襲遷移水平 將30 ml稀釋的基質膠均勻接種到Transwell小室上腔中,并在37 ℃下形成凝膠。將懸浮在300 ml無血清培養(yǎng)基中的乳腺癌MDA-MB-231細胞(1×105個)接種到小室的上層隔室中,在下層隔室中填充600 ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,按1.3中方式干預處理72 h后,擦洗膜上表面的細胞,將侵襲遷移到膜下表面的細胞用4%多聚甲醛固定,10%結晶紫染色,并在顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞。

1.6實時熒光定量PCR法測定細胞ERK、NF-κB mRNA表達 按1.3中方式干預處理72 h后,使用Trizol試劑盒提取細胞中總RNA,用逆轉錄試劑盒進行反轉錄,制備cDNA,根據(jù)試劑盒說明,逆轉錄條件設置如下:在37 ℃進行15 min的逆轉錄反應,在85 ℃進行5 s的逆轉錄酶失活。ERK、NF-κB、GAPDH引物由上海北諾生物科技有限公司設計合成。序列如下:ERK正向5′-CGATCGTAGCTAG CTAGCTAGTC-3′,反向5′-TTAGTCGATAGCTAGTAG CTAGC-3′;NF-κB正向5′-CTCGCTAGACTAGC TA GCTAGCTACG-3′,反向5′-AGGATCGTAGCTAGTCG ATCGTACCT-3′;GAPDH正向5′-CGAGATCGTAGC TAGCTAGATCGACT-3′,反向5′-TACTCGTAGCTA GAGAGAGCTGCTAGC-3′。使用熒光定量PCR試劑盒進行反應。反應條件如下:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸34 s,40個循環(huán)。反應體系包括:2 μl DNA模板,0.4 μl反向引物,0.4 μl正向引物,10 μl SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ和7.2 μl無菌蒸餾水。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法計算ERK、NF-κB mRNA相對表達。

1.7Western印跡法測定細胞ERK、NF-κB蛋白表達水平 按1.3中方式干預處理72 h后,使用RIPA裂解緩沖液從細胞中提取總蛋白,測定蛋白含量后,將蛋白質進行凝膠電泳,然后轉移到聚偏氟乙烯膜上,將膜用8%的牛奶浸泡2 h,并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,加入ERK、NF-κB和GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)孵育16 h,然后將膜用PBS洗滌3次,加入羊抗鼠二抗(1∶4 000)在室溫下孵育2 h。使用化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)和ECL底物試劑盒確定相對條帶密度,GAPDH用作內部對照。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞OD值、存活率及侵襲遷移能力比較 與對照組比較,紫杉醇組、苦杏仁苷低、高劑量組OD值、細胞存活率、穿膜數(shù)量顯著降低(P<0.05);與紫杉醇組比較,苦杏仁苷低劑量組上述指標顯著升高(P<0.05),苦杏仁苷高劑量組上述指標無顯著差異(P>0.05);與苦杏仁苷低劑量組比較,苦杏仁苷高劑量組上述指標顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組細胞OD值、存活率、侵襲、遷移能力、ERK、NF-κB mRNA及蛋白表達水平比較

圖1 各組細胞穿膜數(shù)比較(結晶紫染色,×200)

2.2各組細胞ERK、NF-κB mRNA及蛋白表達水平比較 與對照組比較,紫杉醇組、苦杏仁苷低、高劑量組ERK、NF-κB mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與紫杉醇組比較,苦杏仁苷低劑量組上述指標顯著升高(P<0.05),苦杏仁苷高劑量組上述指標無顯著差異(P>0.05);與苦杏仁苷低劑量組比較,苦杏仁苷高劑量組上述指標顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

1～4:對照組、紫杉醇組、苦杏仁苷低、高劑量組圖2 Western印跡檢測各組ERK、NF-κB蛋白表達

3 討 論

苦杏仁苷具有多種有益的生物學特性,包括抗炎和抗腫瘤活性〔12〕。Porras等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷對刺激性接觸性皮炎小鼠具有抗炎作用,這表明其具有抗炎活性。Moradipoodeh等〔14〕研究顯示,苦杏仁苷可通過增加促凋亡B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)和降低抗凋亡Bcl-2蛋白表達,從而促進人乳腺癌SK-BR-3細胞凋亡。孫卓琳等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷可抑制人肺癌NCI-H1299細胞體外增殖、侵襲和遷移。這些研究表明苦杏仁苷具有抑制腫瘤細胞惡性行為的作用。研究發(fā)現(xiàn),苦杏仁苷通過誘導氧化應激對乳腺癌細胞產(chǎn)生抗腫瘤作用〔16〕。本研究結果說明,苦杏仁苷能明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、侵襲和遷移。與上述他人研究結果一致〔13～16〕。

ERK/NF-κB通路參與腫瘤細胞的生物學活性,是炎癥和免疫反應的關鍵調節(jié)劑。Luo等〔17〕研究表明,微小RNA-577可上調ERK/NF-κB表達進而促進胃癌進展。Chen等〔18〕研究發(fā)現(xiàn),白細胞介素17A通過ERK/NF-κB信號通路介導的上皮細胞向間充質細胞轉化促進膽囊癌的侵襲性。Ning等〔19〕研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可抑制ERK/NF-κB信號傳導從而減弱黑色素瘤的進展。相關報道發(fā)現(xiàn),阻斷ERK/NF-κB信號傳導可抑制膠質母細胞瘤增殖,從而抑制腫瘤生長〔20〕。Wu等〔21〕研究顯示,芹菜素可調控非小細胞肺癌細胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/ERK/NF-κB軸,從而抑制非小細胞肺癌細胞的增殖并促進其凋亡。本研究結果說明,苦杏仁苷能明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞ERK、NF-κB mRNA和蛋白表達,進而抑制ERK/NF-κB通路的激活,這可能與苦杏仁苷的抗癌機制相關。