李娜 曹狀 程顯斌 向新 胡雪 王思佳

(1吉林省醫(yī)療急救指揮中心,吉林 長春 130021;2吉林大學第二醫(yī)院甲狀腺外科; 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 3胃腸結(jié)直腸外科;4乳腺外科; 5吉林省人民醫(yī)院燒傷整形外科)

甲狀腺合成、貯存、分泌甲狀腺素,影響細胞的生長發(fā)育和組織代謝,是人體十分重要的內(nèi)分泌器官。甲狀腺癌是最常見的甲狀腺惡性腫瘤。其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢〔1,2〕。我國甲狀腺癌以每年20%的速度持續(xù)增長。甲狀腺癌的主要病理學類型包括甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺髓樣癌及甲狀腺未分化癌。甲狀腺乳頭狀癌和濾泡狀癌統(tǒng)稱為分化型甲狀腺癌,占成人甲狀腺癌的90%以上。其中甲狀腺乳頭狀癌分化較好,是最常見也是預后最好的病理類型。甲狀腺乳頭狀癌分為4種不同亞型,分別為經(jīng)典型、高細胞型、濾泡亞型、其他亞型。PRD-BF1和RIZ同源結(jié)構(gòu)域蛋白(PRDM)家族是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族,在人類腫瘤的形成與發(fā)展過程中扮演重要作用〔3〕。目前,PRDM家族共發(fā)現(xiàn)17 個家族成員〔4〕。研究發(fā)現(xiàn),PRDM蛋白能夠?qū)Σ煌陌谢蜻M行調(diào)控,影響癌癥的發(fā)生與發(fā)展。乙型肝炎病毒(HBV)感染患者PRDM1表達水平與對照組相比(HBV病毒曾經(jīng)感染者和健康者)顯著升高,其中HBV相關(guān)的肝細胞癌患者的PRDM1表達水平最高,PRDM1高表達的肝細胞癌患者預后較差〔5〕。PRDM1在肺癌細胞中低表達,低表達的PRDM1可促進肺癌細胞體外侵襲及體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移,與肺癌患者的不良預后有關(guān)〔6〕。PRDM2在睪丸生殖細胞腫瘤中低表達,其表達水平的變化受雌二醇和分化劑的調(diào)節(jié),能夠影響精原細胞GC-1的增殖與凋亡。PRDM2在睪丸生殖細胞腫瘤形成中具有潛在的抑癌基因作用〔7〕。PRDM5在結(jié)直腸癌和胃癌細胞系中表達降低,將PRDM5轉(zhuǎn)入癌細胞會抑制細胞的生長,表明PRDM5在胃腸道癌癥中發(fā)揮抑癌作用〔3〕。PRDM14在肺鱗癌和肺腺癌中高表達,在癌旁組織中低表達,而且PRDM14表達水平與肺癌的分化程度顯著相關(guān)〔8〕。

目前僅有少部分研究報道PRDM家族成員與甲狀腺癌相關(guān)。王璐〔9〕研究發(fā)現(xiàn),PRDM1在甲狀腺組織中表達明顯高于人體正常組織,而且在甲狀腺疾病中表達更顯著。Lal等〔10〕研究表明,PRDM2(RIZ1)在甲狀腺癌中表現(xiàn)為腫瘤抑制因子,RIZ1抑癌基因的轉(zhuǎn)錄激活是甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的一個常見過程,有可能作為甲狀腺癌潛在新治療靶點。Sorrentino等〔11〕發(fā)現(xiàn),PRDM12在甲狀腺癌中表達上調(diào)。Liu等〔12〕研究表明,PRDM16在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達下調(diào),PRDM16通過與其直接下游靶點丙酮酸羧化酶啟動子直接結(jié)合,在甲狀腺癌中表現(xiàn)出抗腫瘤作用和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制功能,抑制甲狀腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。Pan等〔13〕研究表明,PRDM16表達與甲狀腺癌的臨床分期有關(guān),可能成為潛在治療靶點。其他PRDM家族成員在甲狀腺癌中的作用仍然未知。因此,本研究重點探討PRDM家族在甲狀腺癌中的表達及與甲狀腺癌患者預后的關(guān)系,對部分家族成員在甲狀腺癌中的作用機制進行初步分析。

1 材料與方法

1.1PRDM家族在甲狀腺癌中表達分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)是在線分析癌癥組學的數(shù)據(jù)庫,通過腫瘤基因組圖譜計劃(TCGA)可深度挖掘分析PRDM家族在正常組織與腫瘤組織中的表達。打開UALCAN數(shù)據(jù)庫,選擇TCGA,篩選條件為:Gene symbol=PRDM1-PRDM16,TCGA dataset=thyroid cancer。分析PRDM家族在正常組織與腫瘤組織及不同腫瘤分期、種族、性別、年齡、腫瘤分化程度、組織學亞型、淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1.2PRDM家族與甲狀腺癌預后的關(guān)系 UALCAN數(shù)據(jù)庫還可評估PRDM家族的表達在甲狀腺癌患者中的預后。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫,選擇TCGA,篩選條件為:Gene symbol=PRDM1-PRDM16,TCGA dataset=thyroid cancer。選擇Survival,即可顯示PRDM家族的表達水平與甲狀腺癌患者預后的關(guān)系,可在線繪制總生存期(OS)生存曲線,計算95%可信區(qū)間(CI)、風險比(HR)和P值。

1.3預測與PRDM6有關(guān)上游miRNA HMDD數(shù)據(jù)庫(http://www.cuilab.cn/hmdd)是一個包含人類疾病相關(guān)聯(lián)的miRNA數(shù)據(jù)庫,運用HMDD數(shù)據(jù)庫可篩選出與人類甲狀腺癌相關(guān)的miRNA。使用HMDD數(shù)據(jù)庫,篩選出disease=thyroid neoplasm的miRNA。這些miRNA即為人類甲狀腺癌相關(guān)的miRNA。StarBase數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)為一個RNA靶標數(shù)據(jù)庫,包含了多種模塊,如“miRNA-Target”“RNA-RNA”等。使用StarBase數(shù)據(jù)庫可預測PRDM6相互作用的miRNA。取 StarBase和HMDD兩個數(shù)據(jù)庫交集為PRDM6在與人類甲狀腺癌中相互作用的miRNA。

1.4預測PRDM6下游的靶基因 StarBase數(shù)據(jù)庫還可以用于預測PRDM6下游的靶基因。在StarBase數(shù)據(jù)庫“RNA-RNA”模塊中選擇“mRNA-RNA”,在Query Gene中輸入PRDM6為關(guān)鍵詞進行檢索,得出與PRDM6有關(guān)的下游靶基因。

1.5靶基因的生物學功能預測 DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)是生物信息的數(shù)據(jù)庫,整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具,可為大量蛋白及基因提供全面且系統(tǒng)的生物功能注釋信息。運用DAVID數(shù)據(jù)庫對與PRDM6有關(guān)的下游靶基因進行生物學分析。篩選條件為“Enter Gene List=與PRDM6有關(guān)的下游靶基因”“Select Identifier”選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”“Select species ”中選擇“Homo sapiens”“List Type”中選擇“Gene List”。選擇數(shù)據(jù)庫基因本體論(GO)分析中的分子功能(MF)、細胞成分(CC)、生物過程(BP)。

1.6統(tǒng)計學方法 采用t檢驗對不同組間PRDM家族成員的差異進行比較。應用Kaplan-Meier法對甲狀腺癌患者進行生存分析。使用Log Rank檢驗比較各組間生存率,對與PRDM6有關(guān)的下游靶基因進行GO功能注釋分析。

2 結(jié) 果

2.1PRDM家族在甲狀腺癌中表達水平 通過UALCAN網(wǎng)站分析,PRDM1、PRDM3在甲狀腺癌組織中表達水平明顯高于正常組織(P<0.05)。PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM6、PRDM8、PRDM10、PRDM11、PRDM15、PRDM16在甲狀腺癌組織中表達水平明顯低于正常組織(P<0.05)。PRDM7、PRDM12在甲狀腺癌組織中與正常組織差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PRDM9、PRDM13、PRDM14在UALCAN網(wǎng)站中無檢索結(jié)果。根據(jù)不同臨床病理特征進行PRDM家族表達分析,分析在不同分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)、不同種族(白種人、黑種人、黃種人)、不同性別(男、女)、不同年齡(21～40歲、41～60歲、61～80歲、81～100歲)、不同甲狀腺乳頭狀癌組織學亞型(經(jīng)典型、高細胞型、濾泡亞型、其他亞型)、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0、N1)甲狀腺癌組織與正常組織表達。PRDM1在上述所有情況中明顯增高(P<0.05)。PRDM2、 PRDM5、PRDM10、 PRDM11、PRDM16五個成員在上述所有情況中明顯降低(P<0.05)。其他PRDM家族成員分別與不同臨床病理特征間存在關(guān)系。見表1。

2.2PRDM家族與甲狀腺癌預后分析 使用UALCAN網(wǎng)站得到的生存分析結(jié)果顯示,甲狀腺癌患者PRDM1、PRDM3(又名MECOM)高表達組總體生存時間高于低表達組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM7、PRDM8、PRDM10、PRDM15高表達組總體生存時間均低于低表達組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PRDM6、PRDM11、PRDM12、PRDM16高表達組總體生存時間均明顯低于低表達組(P<0.05)。PRDM9、PRDM13、PRDM14在UALCAN網(wǎng)站中無檢索結(jié)果。見圖1、圖2。

表1 PRDM家族在正常組織及甲狀腺癌組織中表達(P值)

續(xù)表1 PRDM家族在正常組織及甲狀腺癌組織中表達(P值)

圖1 PRDM 1～15表達與甲狀腺癌患者生存分析結(jié)果

圖2 RPDM16表達與甲狀腺癌患者生存分析結(jié)果

2.3PRDM6上游miRNA預測 通過HMDD數(shù)據(jù)庫檢查得到與人類甲狀腺癌相關(guān)的miRNA 38個。根據(jù)StarBase數(shù)據(jù)庫預測與PRDM6相互作用的miRNA 共計70個。取HMDD數(shù)據(jù)庫和StarBase數(shù)據(jù)庫的交集得到6個miRNA,分別為hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-625-5p。其中在甲狀腺癌中與PRDM6相關(guān)并具有統(tǒng)計學意義的miRNA為hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-625-5p(P<0.05)。hsa-miR-20a-5p與PRDM6表達呈正相關(guān);hsa-miR-625-5p與PRDM6表達呈負相關(guān)。見圖3。

圖3 PRDM6與miRNA的關(guān)聯(lián)性分析

2.4PRDM6下游靶基因預測 通過使用StarBase數(shù)據(jù)庫靶基因預測模塊預測與PRDM6相互作用的下游靶基因,得到的靶基因分別為LAS1L、RTEL1-TNFRSF6B、TNRC6A、MTG2、ATP5F1B、TUBA1B、ARHGAP29、MTF2、APEH、HNRNPA1P12、AL16-1909.1、EEF1A1P13、RTEL1、RNA28S5、RNA18S5、RNA18N5、GMPR2、CACTIN、UBE2D3、MPHOSPH10、CABLES1、TONSL、RPS9、GPC6。

2.5PRDM6下游靶基因的GO功能注釋 應用DAVID數(shù)據(jù)庫,將通過StarBase數(shù)據(jù)庫得到的靶基因進行GO功能注釋。在BP中,這些基因主要參與基因重組對雙鏈損傷修復調(diào)控、DNA修復、復制叉處理等過程。CC方面主要富集于核質(zhì)。MF主要富集于RNA結(jié)合。見表2。

表2 預測靶基因的GO功能注釋

3 討 論

甲狀腺癌作為內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,也是頭頸部最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都呈逐年上升趨勢,而且甲狀腺癌也是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一〔14〕。甲狀腺癌患者早期常常無明顯癥狀,多數(shù)患者因健康體檢及其他疾病的相關(guān)檢查確診甲狀腺癌。甲狀腺癌具有發(fā)病率不斷升高和不顯著的臨床表現(xiàn),需要對甲狀腺癌的發(fā)生和診斷中投入更多的研究和關(guān)注。針對現(xiàn)狀,甲狀腺癌的篩查和診斷主要依據(jù)超聲和細針穿刺活檢,大多數(shù)患者可明確診斷,但仍有小部分可疑惡性患者無法確診,對于這部分患者來說,他們中的大多數(shù)選擇手術(shù)治療,但術(shù)后結(jié)果80%為良性,這部分患者接受了過度且不必要的治療。因此,仍需要提高甲狀腺癌的診斷率。近年來,隨著全球科學技術(shù)水平的不斷提高,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) BRAF基因突變與非髓樣甲狀腺癌密切相關(guān),基因突變后可引起B(yǎng)RAF激酶活化,進而促進乳頭狀甲狀腺癌(PTC)和因PTC進展的未分化甲狀腺癌(ATC)的發(fā)生;部分PTC病例中可發(fā)現(xiàn)RET/PTC家族易位等等。但對于甲狀腺癌的診斷仍缺乏特異性的分子診斷標準。在分子生物學水平對甲狀腺癌研究,探究其發(fā)生發(fā)展機制,有望提高甲狀腺癌的診斷率、治愈率、生存率。

PRDM家族是根據(jù)結(jié)構(gòu)上N末端存在保守的PR結(jié)構(gòu)域而命名〔15,16〕。PR結(jié)構(gòu)域與SET結(jié)構(gòu)域存在相似之處〔17～19〕,SET結(jié)構(gòu)域具有組蛋白或非組蛋白底物的甲基轉(zhuǎn)移酶活性(HMTs)〔16,17,20～22〕,后者可參與基因印記、染色體失活和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種過程。因與SET結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上的同源性,故PRDM家族也具有HMTs活性,使得PRDM家族能夠直接或間接的參與基因表達調(diào)控過程。PRDM家族在結(jié)構(gòu)上的第2個顯著特點是含有不同數(shù)目的鋅指結(jié)構(gòu),鋅指結(jié)構(gòu)是一種結(jié)構(gòu)單元,與手指相似而得名,常在DNA結(jié)合蛋白中出現(xiàn),對鋅離子具有結(jié)合功能,鋅離子能夠保持模體中α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,保證其安裝在DNA的大溝中。含有鋅指結(jié)構(gòu)的PRDM 家族成員存在DNA或RNA識別和結(jié)合的能力〔23〕,影響基因轉(zhuǎn)錄表達過程。

PRDM家族成員在結(jié)構(gòu)上的獨特性表明其在功能上存在特殊作用。PRDM蛋白通過調(diào)控下游靶基因,影響細胞分化,使細胞向惡性轉(zhuǎn)化〔24〕,導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。PRDM蛋白可以影響表觀遺傳修飾和代謝穩(wěn)態(tài)等過程,對細胞的增殖、分化和免疫細胞穩(wěn)態(tài)維持產(chǎn)生影響。其中,表觀遺傳學的主要內(nèi)容就是基因啟動子異常甲基化。甲基化能夠引起DNA構(gòu)象、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA與蛋白質(zhì)作用方式改變,抑制基因的轉(zhuǎn)錄和表達〔25〕。另外,大多數(shù)PRDM蛋白可以編碼出存在和不存在PR結(jié)構(gòu)域的兩個主要分子變體〔20,26〕,它們是通過不同啟動子的可變剪接或交替使用產(chǎn)生的,兩者作用截然相反,尤其在腫瘤的形成過程中,通常情況下可以觀察到二者表達不均衡,在這種狀態(tài)下,PRDM蛋白與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)〔11,27〕。PRDM蛋白的特殊結(jié)構(gòu)和功能說明PRDM蛋白有可能作為診斷性腫瘤標志物、治療的靶點和反應生存預后的指標。

本研究說明,PRDM1、PRDM3對甲狀腺癌的診斷有提示作用,有可能成為甲狀腺癌的診斷性標志物;PRDM2、PRDM4、PRDM5、PRDM6、PRDM8、PRDM10、PRDM11、PRDM15、PRDM16在甲狀腺癌組織中表達水平明顯低于正常組織,說明以上PRDM家族成員在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。根據(jù)不同臨床病理特征進行PRDM家族表達情況分析。由本研究結(jié)果可推斷,當甲狀腺乳頭狀癌組織中PRDM3和PRDM15表達水平與正常組織相接近時,病理學分型很可能為其他亞型甲狀腺乳頭狀癌;當確診為甲狀腺乳頭狀癌時,腫瘤組織中PRDM6表達水平與正常組織相接近時,濾泡亞型甲狀腺乳頭狀癌可能性較大;確診為甲狀腺乳頭狀癌組織中PRDM7和PRDM12表達水平明顯高于正常組織時,診斷為濾泡亞型甲狀腺乳頭狀癌可能性較大;甲狀腺癌組織中PRDM6表達降低時,可能提示存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能。由本研究生存分析結(jié)果可以預測PRDM6、PRDM11、PRDM12、PRDM16與甲狀腺癌的患者預后有關(guān),若以上家族成員在甲狀腺癌中高表達可能提示著其預后不良。

由以上結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRDM6、PRDM11、PRDM16高表達既與甲狀腺癌患者的診斷有關(guān)又與預后有關(guān)。說明這3個成員意義重大,可探討其在甲狀腺癌中的作用機制。通過對論文檢索發(fā)現(xiàn)PRDM11和PRDM16已經(jīng)在發(fā)表論文中闡述。因此,本文只針對PRDM6作用機制進行初步分析,預測其上游miRNA及下游靶基因,并對下游靶基因進行GO功能注釋。本研究對與PRDM6相互作用的下游靶基因進行GO功能注釋,發(fā)現(xiàn)這些靶基在通過基因重組對雙鏈損傷修復調(diào)控、DNA修復、復制叉處理生物過程中發(fā)揮作用,具有RNA結(jié)合的分子功能,還可參與核質(zhì)的組成。進一步推測,PRDM6可能通過以上功能參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究僅通過生物信息學分析,而未經(jīng)過實驗驗證,結(jié)果可能存在一定局限性。需完善研究數(shù)據(jù),開展相關(guān)細胞及動物實驗和臨床研究,對所得出的結(jié)果進行進一步驗證。

綜上,PRDM家族的表達與甲狀腺癌相關(guān),部分家族成員的表達與甲狀腺癌預后及臨床病理特征密切相關(guān)。PRDM家族成員PRDM6可通過上游miRNA及下游靶基因的相互作用,參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。PRDM家族,特別是PRDM6,可能成為甲狀腺癌診治的新靶點。