閔芳芳，袁璐，丁若雯，羅英，肖庚鵬*

（1. 江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)發(fā)展研究院，江西南昌，330052；2. 江西省藥品檢查員中心，江西南昌，330000）

0 引言

贛南臍橙產(chǎn)自江西省贛州市，是贛南地區(qū)的地理標(biāo)志產(chǎn)品。贛南臍橙由于味美和營(yíng)養(yǎng)豐富正受到越來(lái)越多人的青睞。贛南臍橙作為柑橘類水果，含有橙皮苷、蘆丁、柚皮苷等黃酮類化合物，在中藥中具有清熱去火的效果。其中，橙皮苷能擴(kuò)展支氣管，具有清熱化痰、疏郁理氣、抗炎和抗過(guò)敏的功效，蘆丁對(duì)高糖高脂飲食導(dǎo)致的小鼠腎臟損害具有保護(hù)作用［1-4］。

矮壯素（Chlormequat Chloride， CCC），是一種季銨鹽類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，主要用于小麥、水稻、玉米、水果等作物，以提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)［5］。矮壯素雖為低殘留的農(nóng)藥，但是仍會(huì)引起人的中毒甚至死亡［6］。同時(shí)，還有研究表明，在低于日允許攝入量（ADI）水平下，矮壯素也會(huì)對(duì)動(dòng)物的繁殖能力產(chǎn)生不良影響［7］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)矮壯素殘留的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，涉及食品［8］、肥料［9］、藥材［10］等。然而，應(yīng)用HPLC-MS/MS 法檢測(cè)矮壯素在贛南臍橙中殘留的方法未見報(bào)道，因此建立一個(gè)對(duì)贛南臍橙中矮壯素殘留的快速準(zhǔn)確的定性、定量分析的檢測(cè)方法， 對(duì)真實(shí)反映其殘留現(xiàn)狀， 確保人們的食品安全有著至關(guān)重要的作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 高效液相色譜儀， 配有G7120A 高壓二元泵， G7129B 高性能自動(dòng)進(jìn)樣器， G7116B 柱溫箱；Agilent 6470B 高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源 （AJS ESI）；數(shù)據(jù)采集和處理采用Mass Hunter 軟件。TDL-5-A 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；渦旋儀， 德國(guó)IKA；多孔振蕩器，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

矮壯素（1000μg/mL），天津阿爾塔科技有限公司；甲醇和乙腈（色譜純），德國(guó)Merck 公司；甲酸（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 。PSA（分析純），天津博納艾杰爾科技有限公司；GCB（分析純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

移取1.0 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液， 置于100 mL 棕色容量瓶中， 用乙腈定容，配制成10.0 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃下保存。

準(zhǔn)確移取1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于10 mL 棕色容量瓶中，用50%（v/v）乙腈水溶液定容，配置成1.0μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液。取適量矮壯素的標(biāo)準(zhǔn)使用液，用50%（v/v）乙腈水溶液配置成質(zhì)量濃度為0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

稱取約5 g（精確至0.0001）樣品至50 mL 離心管，加入10 mL 乙腈，于2500 Hz 下震蕩1 min，加入 4 g 無(wú)水MgSO4和1 g NaCl，于相同條件下震蕩5 min 后，5000 rpm 下離心5 min。分取2 mL 上清液于10 mL 離心管中（內(nèi)含300 mg 無(wú)水MgSO4、50 mg PSA、5 mg GCB），渦旋1 min，5000 rpm 下離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜供HPLC-MS/MS 分析。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18 （100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫： 30 ℃；進(jìn)樣量： 2 μL；流速： 0.3 mL/min；流動(dòng)相： 乙腈 （A）和0.1%甲酸水 （B）， 梯度洗脫程序見表1。

表1 矮壯素梯度洗脫程序

1.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件

離子源： 電噴霧離子源，正離子模式（AJS ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速： 11 L/min；霧化器壓力： 45 psi；鞘氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓： 3500 V；電子倍增管電壓： 500 V；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、駐留時(shí)間及碰撞能量見表2。

表2 矮壯素的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS 的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

少量甲酸可以增加化合物在正離子模式下的電離效率，有助于M 形成［M+H］+?；诖?，本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，考察對(duì)目標(biāo)化合物峰形及離子化效率的影響。結(jié)果表明，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，矮壯素的峰型更對(duì)稱，且靈敏度更高。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在正離子模式下，用濃度為1.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描確定母離子；確定母離子后，在SIM 模式下，對(duì)透鏡補(bǔ)償電壓進(jìn)行優(yōu)化；然后在某一特定的碰撞能下，對(duì)已確定的母離子使其產(chǎn)生特定的子離子，選取豐度強(qiáng)且干擾小的兩對(duì)子離子作為子離子，最后對(duì)碰撞能進(jìn)行優(yōu)化。矮壯素的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖如圖1。

圖1 矮壯素的離子碎片圖

圖 2 不同提取溶劑對(duì)矮壯素提取率的影響 （n=3）

2.2 樣品前處理優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

矮壯素是一種強(qiáng)極性農(nóng)藥，易溶于水、甲醇和乙腈等溶劑，因而本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈對(duì)矮壯素的提取效率。通過(guò)添加40 μg/kg 的矮壯素到陰性樣品中，比較了用甲醇和乙腈作提取溶劑的提取率。結(jié)果顯示，分別用甲醇和乙腈作為提取樣品中的矮壯素，再經(jīng)過(guò)分散固體劑凈化，乙腈提取率（95.21%）比甲醇（51.42%）的更高（圖2）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與乙腈相比，用甲醇作為提取劑，使得提取液中色素等干擾物質(zhì)越來(lái)越多，不利于后期的凈化，增加了質(zhì)譜的干擾。為了減少后續(xù)分析過(guò)程中的干擾成分，提高方法的靈敏度和準(zhǔn)確度，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)選擇贛南臍橙陰性樣品配置質(zhì)量濃度為5 μg/L、50 μg/L、100 μg/L 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇┑臉?biāo)準(zhǔn)溶液，按照公式（1）計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，其基質(zhì)效應(yīng)如圖3 所示。一般來(lái)說(shuō)，基質(zhì)效應(yīng)<0.85 表現(xiàn)為基質(zhì)抑制；基質(zhì)效應(yīng)>1.15，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)；0.85 ≤基質(zhì)效應(yīng)≤1.15，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略［11］。結(jié)果顯示，用乙腈作為提取溶劑，5 μg/L、50 μg/L 和100 μg/L 的基質(zhì)效應(yīng)分別為95.68%、89.37%和97.04%，這說(shuō)明矮壯素在低、中、高濃度下基質(zhì)效應(yīng)可以忽略，研究者可以用純?nèi)軇┐婊|(zhì)來(lái)配置標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3 不同濃度的矮壯素的基質(zhì)效應(yīng) （n=3）

2.3.2 線性范圍和檢出限

在1.3 條件下對(duì)矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，其線性方程為y=621.72x-780.85， 相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。結(jié)果表明，矮壯素在0.1~200 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別以3 倍信噪比 （S/N=3）和10 倍信噪比 （S/N=10）確定矮壯素的方法檢出限 （LOD）和定量限 （LOQ），結(jié)果分別為0.06 μg/kg 和0.18 μg/kg。

本方法的檢出限低、靈敏度高、線性關(guān)系良好， 適用矮壯素的定量分析。

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度

在贛南臍橙陰性樣品中添加低（10 μg/kg）、中（100 μg/kg）、高（200 μg/kg）3 個(gè)水平的矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。結(jié)果顯示，在3 個(gè)不同濃度水平下，贛南臍橙中矮壯素的平均回收率在90.29%~97.14%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%~4.42%，完全滿足GB/T 5009.219—2018 的精密度≤10%的要求。

表3 矮壯素的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了固體分散劑耦合高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定贛南臍橙中矮壯素的殘留量的分析方法，方法簡(jiǎn)便、高效，靈敏度高，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度均滿足方法學(xué)指標(biāo)，可為對(duì)贛南臍橙中矮壯素殘留的快速檢測(cè)提供技術(shù)手段。