趙淑娥，肖庚鵬，袁璐，蘆慧，羅春麗

（江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)發(fā)展研究院，江西南昌，330029）

0 引言

真菌毒素是各種真菌菌核產(chǎn)生的毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物，與真菌的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)關(guān)且并非所有代謝物都有毒。一種真菌可產(chǎn)生多種毒素，多種真菌也可產(chǎn)生同一種毒素。其中，曲霉屬、鐮刀菌屬和青霉屬涵蓋了絕大多數(shù)產(chǎn)毒菌。與曲霉屬相關(guān)的主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A 等，與鐮刀菌屬相關(guān)的包括玉米赤霉烯酮、T-2 毒素、嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）和伏馬毒素等，與青霉屬相關(guān)的有展青霉素和桔青霉素等。毒性最大的是黃曲霉毒素（尤指AFB1），赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮次之。被這些毒素污染的食物、飼料進(jìn)入食物鏈，會(huì)對(duì)人畜表現(xiàn)出致癌、遺傳毒性和致畸性。如何準(zhǔn)確快速測(cè)定真菌毒素已成為亟待解決的問(wèn)題。

有關(guān)黃曲霉毒素（以AFB1 為例）的毒性及對(duì)人和動(dòng)物健康危害的反應(yīng)機(jī)理以及檢測(cè)方法綜述見(jiàn)文獻(xiàn)［1］。不同國(guó)家對(duì)真菌毒素制定了不同的標(biāo)準(zhǔn)，包括不同食物中各類真菌毒素的限量及它們的測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)［2］。國(guó)標(biāo)［3］針對(duì)各類食品的AF、DON、ZEN、OTA 和PAT作了限量要求，并有相應(yīng)檢測(cè)方法。真菌毒素測(cè)定方法有薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）、膠體金免疫層析法、高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)法（LC/MS）等。TLC 主要用于粗篩，ELISA適用于大批樣品檢測(cè)，膠體金免疫層析法適合現(xiàn)場(chǎng)單個(gè)或少數(shù)樣品測(cè)定，HPLC 法專屬性較強(qiáng)，LC/MS 法可以實(shí)現(xiàn)多成分同時(shí)檢測(cè)，解決色譜不完全分離及假陽(yáng)性的問(wèn)題。QuEChERS 技術(shù)在食品真菌毒素檢測(cè)中的研究進(jìn)展得到了專題與綜述報(bào)道［4，5］。QuEChERS 方法具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠和安全的特點(diǎn)，在真菌毒素分析方面也得到普遍推廣和應(yīng)用。谷物中16 種真菌毒素采用直接提取加同位素內(nèi)標(biāo)的液相色譜質(zhì)譜儀法測(cè)定［7］。

國(guó)標(biāo)方法中不同真菌毒素對(duì)應(yīng)不同的檢測(cè)方法，全部測(cè)定所有毒素會(huì)耗費(fèi)大量的人力、耗材和時(shí)間成本，也對(duì)操作人員增加了風(fēng)險(xiǎn)。本研究在保證高回收率的前提下，將檢測(cè)方法統(tǒng)一，選擇用QuEChERS 方法快速提取、凈化和濃縮，通過(guò)同位素內(nèi)標(biāo)減少基質(zhì)干擾，對(duì)食品中8 種真菌毒素同時(shí)進(jìn)行了測(cè)定，有效地縮短了分析時(shí)間，節(jié)約了成本。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 6470B 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備Agilent 1290 Infinity II Prime LC 液相色譜分離模塊和安捷倫噴射流（AJS）電噴霧離子源，數(shù)據(jù)采集和定量分析采用Agilent MassHunter，美國(guó)Agilent 公司）；KQ5200E 型數(shù)字超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；飛鴿牌TDL-5-A 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；VORTEX GENIUS 3型渦旋混合器（德國(guó)IKA 公司）；氮吹儀，EFAAHM-01 型多管渦旋混合器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

黃曲霉毒素B1（AFB1），氘代黃曲霉毒素B1（13C17-AFB1），黃曲霉毒素B2（AFB2），氘代黃曲霉毒素B2（13C17-AFB2），黃曲霉毒素G1（AFG1）， 氘代黃曲霉毒素G1（13C17-AFG1），黃曲霉毒素G2（AFG2）和氘代黃曲霉毒素G2（13C17-AFG2）均購(gòu)于天津阿爾塔科技有限公司；脫氧雪腐鐮刀烯醇（DON），氘代脫氧雪腐鐮刀烯醇（13C15-DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），氘代玉米赤霉烯酮（13C18-ZEN），赭曲霉毒素A（OTA），氘代赭曲霉毒素A （13C20-OTA），展青霉素（PAT）和氘代展青霉素（13C7-PAT）均購(gòu)于青島普瑞邦生物工程有限公司；甲醇，乙腈，正己烷（色譜純）均購(gòu)于美國(guó)默克股份聯(lián)合公司；乙酸，乙酸銨（色譜純），無(wú)水硫酸鎂（分析純）均購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA），碳十八鍵合硅膠（C18）和石墨化碳黑（GCB）均購(gòu)于月旭科技（上海）股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏純凈水；實(shí)驗(yàn)樣品為市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備

分別配置8 種真菌毒素單標(biāo)儲(chǔ)備液，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON 和PAT 用乙腈作溶劑，ZEN和OTA 用甲醇作溶劑，所有內(nèi)標(biāo)溶液均用乙腈作溶劑。分別移取一定體積單標(biāo)儲(chǔ)備液于同一10mL 棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，配置真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液， 濃度（AFT、DON、ZEN、OTA、PAT） 為100~15000ng/mL，分別移取一定體積的穩(wěn)定同位素單標(biāo)儲(chǔ)備液于同一10mL 棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，配置穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度（13C17-AFB1、13C17-AFB2、13C17-AFG1、13C17-AFG2、13C15-DON、13C18-ZEN、13C20-OTA、13C7-PAT）為1~200ng/mL，于 -20℃保存。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液濃度

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液濃度（見(jiàn)表1）。

表1 8 種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液濃度

1.4 樣品前處理

樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)1mm 孔徑試驗(yàn)篩，混勻，用四分法取樣。稱取5g（精確至0.01g）樣品于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入20mL 乙腈-水-乙酸混合提取液（70：29：1，v/v/v），渦旋混合1min，超聲（中途需搖勻數(shù)次）30min，然后以5000 r/min 離心5min。取8mL 上清液于預(yù)先加有50mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、50mg 碳十八鍵合硅膠（C18）、25mg 石墨化碳黑（GCB）和300mg 無(wú)水硫酸鎂凈化劑的10mL離心管中，渦旋2min，以5000r/min 離心2min。準(zhǔn)確吸取4mL 上清液于10mL 比色管，40℃氮?dú)獯抵两?，?mL 初始流動(dòng)相（A+B=3+7）渦旋復(fù)溶后移入1.5mL 離心管中，以12000 r/min 離心5min。上清液過(guò)0.22μm 微孔濾膜，取180μL 濾液至400μL 內(nèi)插管中，加20 μL 混合內(nèi)標(biāo)工作液渦旋混勻，供HPLCMS/MS 測(cè)定。

1.5 儀器條件

色譜條件。色譜柱：Phenomenex Luna C18（2）100?（150×2.0 mm ，3 μm）； 流動(dòng)相：A 相為乙腈+甲醇（1+1），B 相為5 mmol/L 乙酸銨水溶液（含1 %乙酸）；梯度洗脫程序：0~2.0 min、95%B，2.0~2.1 min、95~60%B，2.1~7.0 min、60~50%B，7.0~10.0 min、50%B，10.0~12.0 min、50~45%B，12.0~15.0 min、45~10%B，15.0~15.5 min、95%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件。電離方式：安捷倫噴射流（AJS）電噴霧電離，正離子、負(fù)離子切換模式；毛細(xì)管電壓3.5kv（+），3.5kv（-）；霧化氣：氮?dú)?，鞘氣流速?1 L/min，鞘氣溫度：350℃，霧化器壓力：45 psi，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣，流速：11 L/min；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），8 種真菌毒素及其穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)MRM 參數(shù)列表見(jiàn)表2。

表2 8 種真菌毒素及其穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)MRM 參數(shù)列表

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

2.1.1 提取溶劑的確定

提取作為QuEChERS 法技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一，其效果決定了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。常用的提取劑乙腈、甲醇和丙酮，均有好的提取效果。對(duì)極性敏感的組分（如OTA 等）進(jìn)行提取時(shí)需加入一定比例的甲酸或乙酸于提取液中，以提高其提取效率。對(duì)谷物中極性較強(qiáng)的組分（如DON）甲醇的提取率不如乙腈。丙酮與乙腈極性相似，且揮發(fā)性更強(qiáng)，易于濃縮，對(duì)黃曲霉毒素和OTA 提取率高，但不易與水分層，提取雜質(zhì)較多且鹽析效果差，基質(zhì)干擾嚴(yán)重［4-6］。乙腈因其提取效率高，且與液質(zhì)分析（LC/MS/MS）兼容性強(qiáng)而應(yīng)用最廣。經(jīng)綜合考慮，本研究采用乙腈-水-乙酸混合液（70：29：1，v/v/v）為提取劑。

2.1.2 凈化材料（QuEChERS 法）的確定

樣品經(jīng)提取液提取后有大量共萃取物，通過(guò)鹽析可初步去除部分水溶性雜質(zhì)，針對(duì)中性和不同酸性體系［10］可采用不同的鹽析劑。PSA 去除有機(jī)酸、脂肪酸、酚類和碳水化合物效果好，C18能有效去除油脂類雜質(zhì)，GCB 對(duì)色素有較好的吸附。以無(wú)水硫酸鎂作除水劑，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)比較，PSA、C18、PSA+C18和PSA+C18+GCB，凈化效果與文獻(xiàn)［8，9］結(jié)論基本一致，PSA+C18凈化效果最佳，故采用PSA+C18為凈化材料，用QuEChERS 法處理。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中比較了不同流動(dòng)相對(duì)真菌毒素分離的影響，最終確定A 相為乙腈+甲醇（1+1），B 相為5 mmol/L乙酸銨水溶液（含1 %乙酸）。優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫程序，優(yōu)化后8 種真菌毒素響應(yīng)度和分離度都得到了改善，且大大縮短了分析時(shí)間（見(jiàn)圖1）。

圖1 8 種真菌毒素總離子流圖

2.3 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

將8 種真菌毒素系列濃度在優(yōu)化的色譜條件下上機(jī)測(cè)定，以待測(cè)組分的濃度為橫坐標(biāo)（X），響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸分析。以儀器3 倍信噪比（S/N=3）求出各組分儀器的檢出限。8 種真菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限見(jiàn)表3。由表3 可知，各組分的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.9984。

表3 8 種真菌毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限

2.4 方法的回收率和精密度

在花生、玉米、薏米仁空白樣品中以加標(biāo)的方式進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，分別加入低、中、高3個(gè)水平濃度，按1.4 項(xiàng)下的樣品前處理方法處理后上機(jī)測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定5 次，計(jì)算方法的回收率和精密度。由表4 可知，加標(biāo)平均回收率為70.1%~119%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.45%~9.97%，本方法具有良好的精密度。

表4 8 種真菌毒素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

3 樣品測(cè)定

為驗(yàn)證本方法的實(shí)用性，本研究在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取了120 份樣品，包括50 份花生、50 份玉米、20 份薏米仁，按照優(yōu)化的提取條件和色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行前處理和上機(jī)測(cè)定?；ㄉ鷺悠窓z出1 份陽(yáng)性， AFB1、AFB2、AFG1、AFG2檢出量分別為6.3μg/kg、3.8μg/kg、6.0μg/kg、4.4μg/kg；玉米、薏米仁樣品各檢出玉米赤霉烯酮（ZEN）1 個(gè)，檢出量分別為11.3μg/kg、 70.6μg/kg。

4 結(jié)論

本著快速、操作簡(jiǎn)便、低成本的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，本研究采用乙腈-水-乙酸（70：29：1，v/v/v）作提取溶劑和PSA、C18、GCB 混合固相分散凈化劑進(jìn)行前處理，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定食品中的8 種真菌毒素的方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單方便、快速高效，靈敏度高，回收率高，重復(fù)性好，并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明基質(zhì)特別復(fù)雜的調(diào)味品（如胡椒、花椒、辣椒粉）因其嚴(yán)重的基質(zhì)干擾不適用于本方法。