張智怡，程冬冬，羅少輝*

（1.江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院，江西南昌，330052；2.江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)發(fā)展研究院，江西南昌，330029）

0 引言

反相液相色譜有機(jī)流動(dòng)相的研究，對(duì)高效液相色譜分析領(lǐng)域的發(fā)展而言具有非常重要的意義。對(duì)將甲醇和乙腈作為流動(dòng)相的各種比例檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以此探究解決高效液相色譜中存在的疑難雜癥的方法，從而提高檢測(cè)效率并節(jié)約成本。

在實(shí)際檢測(cè)工作中，我們會(huì)同時(shí)收到大量樣品，然而參照國(guó)標(biāo)、行標(biāo)或企標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)制定者往往沒(méi)有考慮到一線檢測(cè)人員需要頻繁更換流動(dòng)相，導(dǎo)致實(shí)際工作量巨大的問(wèn)題。我們通過(guò)試驗(yàn)，試圖統(tǒng)一甲醇和乙腈流動(dòng)相（體積比）。統(tǒng)一甲醇和乙腈流動(dòng)相（體積比）不僅能夠大大減輕一線檢測(cè)人員的工作負(fù)擔(dān)，而且對(duì)高效液相色譜分析具有積極推廣的意義。

經(jīng)查閱大量國(guó)內(nèi)外高效液相色譜流動(dòng)相相關(guān)文獻(xiàn)［1-8］，目前只零星發(fā)現(xiàn)有甲醇乙腈混合流動(dòng)相檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，尚未發(fā)現(xiàn)通用有機(jī)流動(dòng)相、黃金混合比例的提法。本項(xiàng)目試圖統(tǒng)一反相色譜流動(dòng)相中的有機(jī)相。根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)成果，再通過(guò)大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明其普遍性、通用性后，很多國(guó)標(biāo)和企標(biāo)檢測(cè)方法將得到修正、補(bǔ)充和參考，這對(duì)于分析化學(xué)領(lǐng)域和標(biāo)準(zhǔn)制定領(lǐng)域來(lái)說(shuō)具有非常重要的意義。

1 研究?jī)?nèi)容和目標(biāo)

1.1 研究?jī)?nèi)容

本文研究甲醇和乙腈作為流動(dòng)相配比時(shí)的特性。

使用通用有機(jī)流動(dòng)相方法，采用最簡(jiǎn)單、基本的高效液相色譜儀對(duì)三種常見(jiàn)農(nóng)藥進(jìn)行色譜和含量分析。

1.2 研究目標(biāo)

1.2.1 有機(jī)流動(dòng)相的甲醇乙腈的配比值為3：2 的通用性驗(yàn)證

通過(guò)研究甲醇和乙腈的體積比V甲醇：V乙腈=3：2 標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)流動(dòng)相在實(shí)際檢測(cè)中的通用性，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，節(jié)約流動(dòng)相成本，將出峰異常率降到最低，免去摸索各種適合條件的時(shí)間。

1.2.2 有機(jī)流動(dòng)相在農(nóng)藥檢測(cè)中的運(yùn)用

通過(guò)研究甲醇和乙腈的體積比V甲醇：V乙腈=3：2 標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)流動(dòng)相在實(shí)際檢測(cè)中的通用性，用梯度分析法改變流動(dòng)相比率和檢測(cè)波長(zhǎng)，建立多種農(nóng)藥出峰時(shí)間，準(zhǔn)確得出檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 有機(jī)流動(dòng)相的拓展運(yùn)用

通過(guò)研究甲醇和乙腈的體積比V甲醇：V乙腈=3：2 標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)流動(dòng)相在實(shí)際檢測(cè)中的通用性，推廣至分析檢測(cè)其他應(yīng)用領(lǐng)域，如化工生產(chǎn)、食品藥品監(jiān)督、保健品、生物化學(xué)研究等。

2 研究方法和技術(shù)路線

2.1 甲醇乙腈混合流動(dòng)相洗脫能力配比分析

參考大量文獻(xiàn)［9-11］，根據(jù)研究甲醇乙腈極性及大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本項(xiàng)目統(tǒng)一有機(jī)流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)為A 體積比（甲醇：乙腈=3：2），以下簡(jiǎn)稱A 體積比（通用），甲醇大致相當(dāng)于89%乙腈的洗脫能力，故以此比例換算純甲醇或純乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

例：①當(dāng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為體積比A（甲醇）：B（水）=80：20 時(shí)，我們用通用有機(jī)流動(dòng)相換算公式體積比 A（通用）=［0.4A（甲醇）］×89%+0.6A（甲醇）=0.956A（甲醇），采用本項(xiàng)目通用有機(jī)流動(dòng)相后的有機(jī)相體積比A（通用）：B（水）=76.48：23.52 ≈76.5：23.5。

②當(dāng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為體積比A（乙腈）：B（水）=80：20時(shí)我們用通用有機(jī)流動(dòng)相換算公式體積比A 通用=0.4A（乙腈）+［0.6A（乙腈）］ ÷89%=1.074A 乙腈，修正后體積比A（通用）：B（水）=85.92：14.08 ≈86：14；當(dāng)分離情況不佳時(shí)，可根據(jù)檢測(cè)儀器和色譜柱特性適當(dāng)調(diào)低有機(jī)流動(dòng)相比例。

2.2 混合流動(dòng)相在農(nóng)藥檢測(cè)中的運(yùn)用

選出幾種具有代表性的三種農(nóng)藥產(chǎn)品噻呋酰胺、噻蟲(chóng)·吡蚜酮和嘧菌酯進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 混合流動(dòng)相在國(guó)標(biāo)等方面的運(yùn)用拓展前景

用通用有機(jī)流動(dòng)相對(duì)上述農(nóng)藥國(guó)標(biāo)（行標(biāo)、企標(biāo)）檢測(cè)方法進(jìn)行修正后，將兩種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2.4 混合流動(dòng)相的準(zhǔn)確性、通用性驗(yàn)證

基于通用有機(jī)流動(dòng)相，采用梯度法對(duì)上述部分農(nóng)藥混合標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)，包括漸變流動(dòng)相比例和檢測(cè)波長(zhǎng)，建立各組分出峰時(shí)間表和DAD 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)大量數(shù)據(jù)來(lái)證明V甲醇：V乙腈=3：2 的通用有機(jī)流動(dòng)相液相色譜分離法的準(zhǔn)確性和通用性。

3 試驗(yàn)部分

3.1 試驗(yàn)條件

Agilent 1200 高效液相色譜儀（具可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器）；250×4.6 mm（i.d.）色譜柱；不銹鋼柱（內(nèi)裝Tc-C18 填料）；流速1 mL/min；進(jìn)樣體積20μL。

3.2 混合流動(dòng)相運(yùn)用在噻呋酰胺的檢測(cè)

在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下（檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm）檢測(cè)混配懸浮劑（噻呋酰胺溶度約0.1 g/L ，己唑醇溶度約0.03 g/L 的甲醇混合溶液）時(shí)，噻呋酰胺出峰時(shí)間在7.087 min，己唑醇出峰時(shí)間在11.740 min，但保留時(shí)間在2.420 min 時(shí)出現(xiàn)了噻呋酰胺鼓峰問(wèn)題（見(jiàn)圖1），這可能是由于流動(dòng)相（甲醇：水=75：25）的種類(lèi)和組成比造成的。而經(jīng)試驗(yàn)改用優(yōu)化后的通用有機(jī)流動(dòng)相（有機(jī)相：水=70：30，有機(jī)相為V甲醇：V乙腈=3：2 混合溶劑）能解決此問(wèn)題（見(jiàn)圖2），噻呋酰胺出峰時(shí)間在9.968 min，己唑醇出峰時(shí)間在14.474 min，噻呋酰胺鼓峰幾乎消失（可忽略不計(jì)），并且提高了檢測(cè)精密度。對(duì)比圖1 和圖2，發(fā)現(xiàn)在其他試驗(yàn)條件不變的情況下，僅改變流動(dòng)相的種類(lèi)和組成，可以修正噻呋·己唑醇典型色譜圖的前鼓峰問(wèn)題。

圖1 企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下φ（甲醇：水）=75：25 檢測(cè)噻呋·己唑醇標(biāo)準(zhǔn)樣品典型色譜圖

圖2 通用有機(jī)流動(dòng)相實(shí)驗(yàn)條件下φ：（有機(jī)相：水）=70：30 檢測(cè)噻呋·己唑醇標(biāo)準(zhǔn)樣品典型色譜圖

3.3 混合流動(dòng)相在檢測(cè)噻蟲(chóng)·吡蚜酮的運(yùn)用

采用國(guó)標(biāo)法（檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm）檢測(cè)噻蟲(chóng)·吡蚜酮（噻蟲(chóng)嗪和吡蚜酮溶度均約0.1 g/L 乙腈水混合溶液）時(shí)，以φ（乙腈：水）=10：90（水為0.2 g/L 磷酸二氫鉀溶液）為流動(dòng)相，吡蚜酮的保留時(shí)間為4.244 min，噻蟲(chóng)嗪的保留時(shí)間在7.955 min，但色譜圖會(huì)出現(xiàn)三叉鬼峰（見(jiàn)圖3），這可能與流動(dòng)相的極性有關(guān)，也可能是樣品預(yù)處理時(shí)發(fā)生了降解。而采用本項(xiàng)目通用有機(jī)流動(dòng)相后，吡蚜酮的保留時(shí)間為13.155 min，噻蟲(chóng)嗪的保留時(shí)間在17.742 min（見(jiàn)圖4），盡管保留時(shí)間有所延長(zhǎng)，但能有效地將噻蟲(chóng)嗪和吡蚜酮徹底分離，消除多余雜峰，并且成功解決了三叉鬼峰問(wèn)題，計(jì)算結(jié)果也能控制標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

圖3 采用國(guó)標(biāo)法實(shí)驗(yàn)條件下：流動(dòng)相φ（乙腈：水）=10：90（水為0.2g/L 磷酸二氫鉀溶液）檢測(cè)噻蟲(chóng)·吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)鬼峰色譜圖

圖4 采用通用有機(jī)流動(dòng)相φ（有機(jī)相：水）=18：82（有機(jī)相為甲醇和乙腈3：2 混合溶劑，水為0.2 g/L 磷酸二氫鉀溶液）檢測(cè)噻蟲(chóng)·吡蚜酮標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)典型色譜圖

3.4 混合流動(dòng)相在檢測(cè)嘧菌酯水分散粒劑中的運(yùn)用

采用《嘧菌酯水分散粒劑》（HG/T 4931—2016）檢測(cè)25%嘧菌酯（嘧菌酯約0.1 g/L 乙腈水混合溶液），以φ（乙腈：水）=45：55（水為pH=2.5 的磷酸水溶液）為流動(dòng)相，嘧菌酯在19.183 min 出峰，同時(shí)出現(xiàn)一雜峰且拖尾（見(jiàn)圖5），嚴(yán)重影響了目標(biāo)物質(zhì)的分離度、靈敏度和定量。造成這種現(xiàn)象的原因可能是樣品中含有其他未知化合物。而采用本項(xiàng)目通用有機(jī)流動(dòng)相，并調(diào)整流動(dòng)相有機(jī)溶劑與水的體積比后，嘧菌酯保留時(shí)間在23.066 min（見(jiàn)圖6），嘧菌酯主峰與拖尾雜峰分離，所得結(jié)果較行標(biāo)法更為精確。

圖5 采用行標(biāo)HG/T 4931-2016：φ（乙腈：水）=45：55（pH=2.5磷酸水溶液）檢測(cè)嘧菌酯試樣典型色譜圖

圖6 采用通用有機(jī)流動(dòng)相φ（有機(jī)相：水）=50：50（pH=2.5 磷酸水溶液）檢測(cè)嘧菌酯試樣典型色譜圖

3.5 混合流動(dòng)相在檢測(cè)24 種非法添加農(nóng)藥運(yùn)用

對(duì)國(guó)標(biāo)方法中流動(dòng)相的組分和體積比進(jìn)行條件試驗(yàn)（流量1.0 mL·min-1，最大壓力400.0 bar），通過(guò)調(diào)整甲醇和乙腈的體積比進(jìn)行混合標(biāo)樣梯度法試驗(yàn)（見(jiàn)表1），建立24 種高頻非法添加農(nóng)藥（24 種標(biāo)樣含量均為約0.04g/L 甲醇水混合溶液）色譜圖（見(jiàn)圖7~10）。對(duì)比圖7~10 結(jié)果，圖9 分離效果最好，拖尾峰最少，重峰最少。24 種農(nóng)藥在通用有機(jī)流動(dòng)相（V甲醇：V乙腈=3：2）出峰順序（圖9 所示）：6.536 min 甲胺磷；8.305 min 乙酰甲胺磷；14.195 min 吡蚜酮；15.391 min 滅多威；16.018 min烯啶蟲(chóng)胺；17.954 min 噻蟲(chóng)嗪；21.550 min 吡蟲(chóng)啉；24.124 min 啶蟲(chóng)脒；32.332 min 克百威；33.290 min 福美雙；39.755 min 氯蟲(chóng)苯甲酰胺；43.540 min 毒死蜱；47.386 min 氟蟲(chóng)腈；51.368 min 辛硫磷；54.883 min氟鈴脲；57.570 min 溴蟲(chóng)腈；59.765 min 唑蟲(chóng)酰胺；62.696 min 虱螨脲；70.418 min 丁醚脲；72.380 min 螺螨酯；78.455 min 阿維菌素；79.120 min 聯(lián)苯菊酯；84.357 min 氟蟲(chóng)脲；92.740 min 丁硫克百威。

表1 A（有機(jī)相）：B（水）流動(dòng)相洗脫梯度

圖7 梯度法甲醇-水的24 種農(nóng)藥混合標(biāo)樣色譜圖

圖8 梯度法乙腈-水24 種農(nóng)藥混合標(biāo)樣色譜圖

圖9 梯度法有機(jī)相（V甲醇：V乙腈=3：2）-水24 種農(nóng)藥混合標(biāo)樣色譜圖

圖10 梯度法有機(jī)相（V 甲醇：V 乙腈=8：2）-水24 種農(nóng)藥混合標(biāo)樣色譜圖

3.6 實(shí)驗(yàn)綜述

對(duì)嘧菌酯、噻蟲(chóng)·吡蚜酮、噻呋·己唑醇三種農(nóng)藥樣品采用國(guó)標(biāo)法、企標(biāo)法和行標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)間與本項(xiàng)目通用有機(jī)流動(dòng)相檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，最終統(tǒng)計(jì)出國(guó)標(biāo)法和企標(biāo)法為12 小時(shí)左右，通用有機(jī)流動(dòng)相方法為6小時(shí)左右，其中國(guó)標(biāo)法和企標(biāo)法消耗的大量時(shí)間集中在更換流動(dòng)相時(shí)的洗柱時(shí)間，并且檢測(cè)噻蟲(chóng)·吡蚜酮時(shí)條件不適合，摸索條件浪費(fèi)了大量時(shí)間。由此可知，本次試驗(yàn)優(yōu)化的通用有機(jī)流動(dòng)相（V甲醇：V乙腈=3：2）對(duì)于提高上述三種典型農(nóng)藥有效成分、食品農(nóng)藥殘留、農(nóng)藥隱性添加成分的檢測(cè)效率有明顯作用。

4 結(jié)論

本文以高效液相色譜法中流動(dòng)相甲醇和乙腈的比值，從通用有機(jī)流動(dòng)相的角度，建立一個(gè)完善的黃金有機(jī)流動(dòng)相（V甲醇：V乙腈=3：2）檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系，對(duì)國(guó)標(biāo)（行標(biāo)、企標(biāo)）起到修正、參考、補(bǔ)充作用。甲醇乙腈黃金配比有機(jī)流動(dòng)相能大大提高檢測(cè)效率和檢測(cè)準(zhǔn)確度，降低檢測(cè)成本，用在復(fù)雜組分梯度法定性時(shí)，還降低了檢測(cè)門(mén)檻。因此，甲醇乙腈黃金配比有機(jī)流動(dòng)相的實(shí)用前景非常廣闊。而專注于研究檢測(cè)方法的通用性，對(duì)于分析化學(xué)液相色譜儀器檢測(cè)領(lǐng)域研究具有重要的實(shí)際意義。